毛細(xì)管電泳法專家講座

第4節(jié)毛細(xì)管電泳1毛細(xì)管電泳法第1頁(yè)4.1、概述4.2、理論基礎(chǔ)4.3、毛細(xì)管電泳儀4.4、毛細(xì)管電泳分離模式4.5、毛細(xì)管電泳應(yīng)用2毛細(xì)管電泳法第2頁(yè)4.1、概述

在電解質(zhì)溶液中，位于電場(chǎng)中帶電離子在電場(chǎng)力作用下，以不一樣速度向其所帶電荷相反電極方向遷移現(xiàn)象，稱之為電泳。因?yàn)椴灰粯与x子所帶電荷及性質(zhì)不一樣，遷移速率不一樣，可實(shí)現(xiàn)分離。樣品遷移速度和方向由其電荷和淌度決定。

1937年，Tiselius(瑞典)將蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進(jìn)行自由溶液電泳，第一次將人血清提取蛋白質(zhì)混合液分離出白蛋白和α、β、γ球蛋白；1948年，獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)；3毛細(xì)管電泳法第3頁(yè)利用電泳現(xiàn)象對(duì)化學(xué)或生物物質(zhì)進(jìn)行分離分析方法和技術(shù)叫電泳法或電泳技術(shù)。

按形狀分類：U型管電泳、柱狀電泳、板電泳；按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳；傳統(tǒng)電泳分析：操作煩瑣，所用分離柱柱徑大，柱較短，分離效率不高（遠(yuǎn)低于HPLC），溫度影響大。4.1.1、經(jīng)典電泳分析方法4毛細(xì)管電泳法第4頁(yè)

1981年，Jorgenson等用75m內(nèi)徑石英毛細(xì)管進(jìn)行電泳分析，柱效高達(dá)40萬(wàn)/m，快速發(fā)展成為可與GC、HPLC相媲美嶄新分離分析技術(shù)——高效毛細(xì)管電泳。4.1.2、毛細(xì)管電泳分析方法5毛細(xì)管電泳法第5頁(yè)高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)主要改進(jìn)：一、采取了<0.1mm內(nèi)徑毛細(xì)管二、采取了高達(dá)數(shù)萬(wàn)伏電壓毛細(xì)管采取使產(chǎn)生熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應(yīng)，使電場(chǎng)電壓能夠很高。

電壓升高，電場(chǎng)推進(jìn)力大，又可深入使柱徑變小，柱長(zhǎng)增加。高效毛細(xì)管電泳柱效遠(yuǎn)高于高效液相色譜，理論塔板數(shù)高達(dá)幾十萬(wàn)/米，特殊柱子能夠到達(dá)數(shù)百萬(wàn)。6毛細(xì)管電泳法第6頁(yè)分離過(guò)程

電場(chǎng)作用下，毛細(xì)管柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象。

帶電粒子遷移速度=電泳+電滲流；兩種速度矢量和。

正離子：兩種效應(yīng)運(yùn)動(dòng)方向一致，在負(fù)極最先流出；

中性粒子無(wú)電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽(yáng)離子后流出；

陰離子：兩種效應(yīng)運(yùn)動(dòng)方向相反。ν電滲流>ν電泳時(shí)，陰離子在負(fù)極最終流出。7毛細(xì)管電泳法第7頁(yè)高效毛細(xì)管電泳特點(diǎn)1、儀器簡(jiǎn)單、易自動(dòng)化電源、毛細(xì)管、檢測(cè)器、溶液瓶2、分析速度快、分離效率高

可在3.1min內(nèi)分離36種無(wú)機(jī)及有機(jī)陰離子，4.1

min內(nèi)分離了24種陽(yáng)離子；分離柱效：105～107/m理論塔板數(shù)3、操作方便、消耗少、成本低進(jìn)樣量極少，nL水平4、環(huán)境友好5、應(yīng)用范圍極廣

無(wú)機(jī)物、有機(jī)物、生物小分子、中性分子；生物大分子等

8毛細(xì)管電泳法第8頁(yè)4.2、理論基礎(chǔ)4.2.1電泳

電泳是指帶電離子在電場(chǎng)中定向移動(dòng)，不一樣離子含有不一樣遷移速度，遷移速度與哪些原因相關(guān)？當(dāng)帶電離子以速度ν在電場(chǎng)中移動(dòng)時(shí)，受到大小相等、方向相反電場(chǎng)推進(jìn)力和平動(dòng)摩擦阻力作用。電場(chǎng)力：FE=qE

阻力：F=fν故：qE=fνq—離子所帶有效電荷；E—電場(chǎng)強(qiáng)度；ν—離子在電場(chǎng)中遷移速度；f—平動(dòng)摩擦系數(shù)9毛細(xì)管電泳法第9頁(yè)（球形離子）

η-溶液粘度r-離子半徑物質(zhì)離子在電場(chǎng)中差速遷移是電泳分離基礎(chǔ)。淌度μ：?jiǎn)挝浑妶?chǎng)強(qiáng)度下平均電泳速度:所以，遷移速度：10毛細(xì)管電泳法第10頁(yè)4.2.2、電滲現(xiàn)象與電滲流1、電滲流現(xiàn)象

當(dāng)固體與液體接觸時(shí)，固體表面因?yàn)槟撤N原因帶一個(gè)電荷，則因靜電引力使其周圍液體帶有相反電荷，在液-固界面形成雙電層，二者之間存在電位差。

當(dāng)液體兩端施加電壓時(shí)，就會(huì)發(fā)生液體相對(duì)于固體表面移動(dòng)，這種液體相對(duì)于固體表面移動(dòng)現(xiàn)象叫電滲現(xiàn)象。電滲現(xiàn)象中整體移動(dòng)著液體叫電滲流（electroosmoticflow，EOF）。11毛細(xì)管電泳法第11頁(yè)2、HPCE中電滲現(xiàn)象與電滲流

石英毛細(xì)管柱，內(nèi)充液pH>3時(shí)，表面電離成-SiO-，管內(nèi)壁帶負(fù)電荷，形成雙電層。

在高電場(chǎng)作用下，帶正電荷溶液表面及擴(kuò)散層向陰極移動(dòng)，因?yàn)檫@些陽(yáng)離子實(shí)際上是溶劑化，故將引發(fā)柱中溶液整體向負(fù)極移動(dòng)，速度νEOF。12毛細(xì)管電泳法第12頁(yè)

電滲流方向取決于毛細(xì)管內(nèi)表面電荷性質(zhì)：石英毛細(xì)管，內(nèi)表面帶負(fù)電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極；改變電滲流方向方法：（1）毛細(xì)管改性表面鍵合陽(yáng)離子基團(tuán)；（2）加電滲流反轉(zhuǎn)劑內(nèi)充液中加入大量陽(yáng)離子表面活性劑，將使石英毛細(xì)管壁帶正電荷，溶液表面帶負(fù)電荷。電滲流流向陽(yáng)極。3、HPCE中電滲流方向13毛細(xì)管電泳法第13頁(yè)

電滲流大小用電滲流速度νEOF表示，取決于電滲淌度μ和電場(chǎng)強(qiáng)度E。即

νEOF=μE電滲淌度取決于電泳介質(zhì)及雙電層Zeta電勢(shì)，即

μ=ε0εξε0—真空介電常數(shù)；ε—介電常數(shù)；ξ—毛細(xì)管壁Zeta電勢(shì)。νEOF=ε0εξE實(shí)際電泳分析，可在試驗(yàn)測(cè)定對(duì)應(yīng)參數(shù)后，按下式計(jì)算

νEOF=Lef/teoLef—毛細(xì)管有效長(zhǎng)度；teo—電滲流標(biāo)識(shí)物（中性物質(zhì)）遷移時(shí)間。4、HPCE中電滲流大小14毛細(xì)管電泳法第14頁(yè)5、HPCE中電滲流流形

電荷均勻分布，整體移動(dòng)，電滲流流動(dòng)為平流，塞式流動(dòng)（譜帶展寬很小）；液相色譜中溶液流動(dòng)為層流，拋物線流型，管中心處速度為平均速度2倍（引發(fā)譜帶展寬較大）。15毛細(xì)管電泳法第15頁(yè)6、HPCE中電滲流作用各種電性離子在毛細(xì)管柱中遷移速度為：

ν+=νEOF+ν+ef陽(yáng)離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致；ν-=νEOF-ν-ef陰離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流相反；ν0=νEOF中性粒子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致；普通離子電滲速度是電泳速度5-7倍，所以待測(cè)組分都能從陰極流出。（1）可一次完成陽(yáng)離子、陰離子、中性粒子分離；（2）改變電滲流大小和方向可改變分離效率和選擇性，如同改變LC中流速；（3）電滲流微小改變影響結(jié)果重現(xiàn)性；在HPCE中，控制電滲流非常主要。16毛細(xì)管電泳法第16頁(yè)4.2.3、

HPCE中影響電滲流原因1.電場(chǎng)強(qiáng)度影響

電滲流速度和電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，當(dāng)毛細(xì)管長(zhǎng)度一定時(shí)，電滲流速度正比于工作電壓。2.毛細(xì)管材料影響

不一樣材料毛細(xì)管表面電荷特征不一樣，產(chǎn)生電滲流大小不一樣。17毛細(xì)管電泳法第17頁(yè)3.電解質(zhì)溶液性質(zhì)影響（1）溶液pH影響

對(duì)于石英毛細(xì)管，溶液pH增高時(shí)，表面電離多，電荷密度增加，管壁zeta電勢(shì)增大，電滲流增大；pH<3，完全被氫離子中和，表面電中性，電滲流為零。分析時(shí)，采取緩沖溶液來(lái)保持pH穩(wěn)定。（2）陰離子影響

陰離子不一樣時(shí)，毛細(xì)管中電流有較大差異，產(chǎn)生焦耳熱不一樣。

緩沖溶液離子強(qiáng)度，影響雙電層厚度、溶液黏度和工作電流，顯著影響電滲流大小。緩沖溶液離子強(qiáng)度增加，電滲流下降。18毛細(xì)管電泳法第18頁(yè)19毛細(xì)管電泳法第19頁(yè)4.溫度影響

毛細(xì)管內(nèi)溫度升高，使溶液黏度下降，電滲流增大。溫度改變來(lái)自于“焦耳熱”；焦耳熱：毛細(xì)管溶液中有電流經(jīng)過(guò)時(shí)，產(chǎn)生熱量；HPCE中焦耳熱與背景電解質(zhì)摩爾電導(dǎo)、濃度及電場(chǎng)強(qiáng)度成正比。溫度每改變1K，將引發(fā)背景電解質(zhì)溶液黏度改變2%～3%；20毛細(xì)管電泳法第20頁(yè)5.添加劑影響（1）加入濃度較大中性鹽，如K2SO4，溶液離子強(qiáng)度增大，電滲流減小。（2）加入表面活性劑，可改變電滲流大小和方向；加入陽(yáng)離子表面活性劑可改變電滲流方向。

（3）加入有機(jī)溶劑可改變電滲流大小。21毛細(xì)管電泳法第21頁(yè)4.2.4、淌度

淌度：帶電離子在單位電場(chǎng)下遷移速度；淌度不一樣是電泳分離基礎(chǔ)。1.有效淌度(effectivemobility)μef溶液中離子電泳淌度μef=∑aiμi（不考慮電滲流）

ai—溶質(zhì)i解離度；μi—溶質(zhì)i在解離狀態(tài)下絕對(duì)淌度2.表觀淌度μap離子在實(shí)際分離過(guò)程中遷移速度（表觀遷移速度）：

νap=μapE

μap=μef+μEOF22毛細(xì)管電泳法第22頁(yè)4.2.5、

HPCE中參數(shù)與關(guān)系式

1.遷移時(shí)間（保留時(shí)間）

HPCE兼含有電化學(xué)特征和色譜分析特征。相關(guān)色譜理論也適用。V—外加電壓；L—毛細(xì)管總長(zhǎng)度；2.分離效率（塔板數(shù)）

在HPCE中，僅考慮縱向擴(kuò)散，σ2=2Dt

擴(kuò)散系數(shù)小溶質(zhì)比擴(kuò)散系數(shù)大分離效率高，分離生物大分子依據(jù)。23毛細(xì)管電泳法第23頁(yè)3.分離度

影響分離度主要原因；工作電壓V；毛細(xì)管有效長(zhǎng)度與總長(zhǎng)度比；有效淌度差。分離度可按譜圖直接由下式計(jì)算：24毛細(xì)管電泳法第24頁(yè)4.2.6、影響分離效率原因—區(qū)帶展寬1.縱向擴(kuò)散影響

在HPCE中，縱向擴(kuò)散引發(fā)峰展寬：σ2=2Dt由擴(kuò)散系數(shù)和遷移時(shí)間決定。大分子擴(kuò)散系數(shù)小，可取得更高分離效率，大分子生物試樣分離依據(jù)。2.進(jìn)樣影響

當(dāng)進(jìn)樣塞長(zhǎng)度太大時(shí)，引發(fā)峰展寬大于縱向擴(kuò)散。分離效率顯著下降；實(shí)際操作時(shí)進(jìn)樣塞長(zhǎng)度小于或等于毛細(xì)管總長(zhǎng)度1%～2%。25毛細(xì)管電泳法第25頁(yè)3.焦耳熱與溫度梯度影響

電泳過(guò)程產(chǎn)生焦耳熱可由下式計(jì)算：m—電解質(zhì)溶液摩爾電導(dǎo)；I—工作電流：cm—電解質(zhì)濃度；散熱過(guò)程中，在毛細(xì)管內(nèi)形成溫度梯度（中心溫度高），破壞了塞流，造成區(qū)帶展寬。改進(jìn)方法：（1）減小毛細(xì)管內(nèi)徑；（2）控制散熱；26毛細(xì)管電泳法第26頁(yè)4.溶質(zhì)與管壁間相互作用

存在吸附與疏水作用，造成譜帶展寬；蛋白質(zhì)、多肽帶電荷數(shù)多，有較多疏水基，吸附問(wèn)題尤其嚴(yán)重，是當(dāng)前分離分析該類物質(zhì)一大難題。細(xì)內(nèi)徑毛細(xì)管柱，首先有利于散熱，另首先比表面積大，又增加了溶質(zhì)吸附機(jī)會(huì)。

27毛細(xì)管電泳法第27頁(yè)4.3、毛細(xì)管電泳儀4.3.1、儀器流程與主要部件

電壓：0～30kV；分離柱不涂敷任何固定液；紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器；激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器可檢測(cè)到：10-19～10-21mol28毛細(xì)管電泳法第28頁(yè)1.高壓電源（1）0～30kV穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)直流電源；（2）含有恒壓、恒流、恒功率輸出；（3）電場(chǎng)強(qiáng)度程序控制系統(tǒng)；（4）電壓穩(wěn)定性：0.1%；（5）電源極性易轉(zhuǎn)換；2.毛細(xì)管柱

（1）材料：石英：各項(xiàng)性能好；玻璃：光學(xué)、機(jī)械性能差；外涂覆聚酰亞胺保護(hù)層。檢測(cè)窗口制作。（2）規(guī)格：內(nèi)徑25～100μm，外徑150～400μm；長(zhǎng)度<=1m29毛細(xì)管電泳法第29頁(yè)3.緩沖液池

化學(xué)惰性，機(jī)械穩(wěn)定性好；4.檢測(cè)器

要求：含有極高靈敏度，可柱端檢測(cè)；檢測(cè)器、數(shù)據(jù)采集與計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理一體化；

類型檢測(cè)限/mol特點(diǎn)紫外-可見(jiàn)

10-13～10-15

加二極管陣列，光譜信息熒光

10-15～10-17靈敏度高，樣品需衍生激光誘導(dǎo)熒光10-18～10-21靈敏度極高，樣品需衍生電化學(xué)

10-17～10-19樣品需有電活性30毛細(xì)管電泳法第30頁(yè)4.3.2、毛細(xì)管電泳進(jìn)樣方式

進(jìn)樣量：毛細(xì)管長(zhǎng)度1%-2%；納升級(jí)、非常小；1.流體力學(xué)進(jìn)樣方式

（1）進(jìn)樣端加壓（2）出口端抽真空（3）虹吸進(jìn)樣31毛細(xì)管電泳法第31頁(yè)

毛細(xì)管一端插入樣品瓶，加電壓；2.電動(dòng)進(jìn)樣方式

進(jìn)樣不均：電歧視現(xiàn)象，淌度大離子比淌度小進(jìn)樣量大；離子丟失：淌度大且與電滲流方向相反離子可能進(jìn)不去；尤其適合黏度大試樣；

32毛細(xì)管電泳法第32頁(yè)4.4、毛細(xì)管電泳分離模式4.4.1、毛細(xì)管區(qū)帶電泳

capillaryzoneelectrophoresis，CZE

帶電粒子遷移速度=電泳和電滲流速度矢量和。正離子：兩種效應(yīng)運(yùn)動(dòng)方向一致，在負(fù)極最先流出；中性粒子：無(wú)電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽(yáng)離子后流出；

陰離子：兩種效應(yīng)運(yùn)動(dòng)方向相反；ν電滲流>ν電泳時(shí),陰離子在負(fù)極最終流出,在這種情況下,不但能夠按類分離,同種類離子因?yàn)椴钏龠w移被相互分離。最基本、應(yīng)用最廣分離模式；33毛細(xì)管電泳法第33頁(yè)

1.緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度到達(dá)臨界濃度，形成一疏水內(nèi)核、外部帶電膠束。4.4.2、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜

micellarelectrokineticchromatography，MEKC

在電場(chǎng)力作用下，膠束在柱中移動(dòng)。加入十二烷基磺酸鈉34毛細(xì)管電泳法第34頁(yè)

2.電泳流和電滲流方向相反，且ν電滲流

>ν電泳，負(fù)電膠束以較慢速度向