臨床微生物學檢驗

物學檢驗臨床微生物學檢驗(sop)Ⅰ高壓鍋使用的標準操作程序（SOP）實驗室名項目編號制定日期稱檢驗科高壓鍋的使用檢驗科2006年06月06日【目的】確保高壓效果的可靠性?！具m用范圍】蒸氣式高壓鍋?！驹揝OP變動程序】本標準操作程序的改動，可由任壹使用本SOP的工作人員提出，且報經(jīng)下述人員批準簽字：專業(yè)主管、科主任?！静僮鞣椒ā?．將水加到高壓鍋內(nèi)至其刻度線，將欲滅菌物品放入鍋內(nèi)，關(guān)閉鍋門，擰緊螺絲且確認已經(jīng)封閉。2．打開排氣閥。3．打開蒸汽開關(guān)，向鍋內(nèi)輸入蒸汽或接通電源，使產(chǎn)生蒸汽。40.05mPa時，關(guān)閉排氣閥。5．觀察壓力表，當壓力升至0.15mPa時，開始計時。6．壓力達0.15mPa后，可調(diào)節(jié)進氣閥，減少進氣量，維持壓力且使其穩(wěn)定在0.15mPa。電加熱時，可切斷電源，維持壓力持續(xù)15分鐘，至多不超過30分鐘，否則營養(yǎng)物質(zhì)破壞。7．關(guān)閉進氣閥門或切斷電源，讓鍋內(nèi)物品自然冷卻，不可馬上打開排氣閥，以免發(fā)生意外。8．待鍋內(nèi)壓力降為零時，可打開鍋蓋，取出物品。操作人員部門主管質(zhì)量負責人姓名唐玉貞檢驗科檢驗科日期06年06月06日Ⅱ培養(yǎng)箱使用的校準標準操作程序（SOP）實驗室名稱項目編號制定日期檢驗科檢驗科06年06月06日準【目的】確保培養(yǎng)箱溫度恒定?！具m用范圍】各種類型隔水式、溫度設定為27℃、35℃、42℃、56℃培養(yǎng)箱?！驹揝OP變動程序】本標準操作程序的改動，可由任壹使用本SOP的工作人員提出，且報經(jīng)下述人員批準簽字：專業(yè)主管、科主任?！静僮鞣椒ā?2．從注水口先將隔水箱內(nèi)的水注滿到浮標要求的位置。3．將溫度調(diào)節(jié)旋扭調(diào)至所需溫度，然后將電源開關(guān)撥至“開”處。4．每次使用時應在培養(yǎng)箱頂部插入標準溫度計，監(jiān)測實際溫度。5．培養(yǎng)箱工作溫度波動范圍應控制在±10C以內(nèi)。6．培養(yǎng)箱正面貼有溫度記錄表，記錄每天上班和下班時溫度，如溫度超出正常范圍，指示該溫度的刻度應劃上紅圈，且把修正溫度記錄下來。7．培養(yǎng)箱內(nèi)外應保持清潔。操作人員部門主管質(zhì)量負責人姓名唐玉貞檢驗科檢驗科日期06年06月06日Ⅲ培養(yǎng)基制備的標準操作程序（SOP）實驗室名稱項目編號制定日期檢驗科培養(yǎng)基的制備檢驗科06年06月06日【目的】保證培養(yǎng)基的質(zhì)量?！具m用范圍】使用成品培養(yǎng)基干粉制備各種分離培養(yǎng)基?！驹揝OP變動程序】本標準操作程序的改動，可由任壹使用本SOP的工作人員提出，且報經(jīng)下述人員批準簽字：專業(yè)主管、科主任?！静襟E】1.在玻璃容器中加入所需蒸餾水的二分之壹量，然后放入壹定量培養(yǎng)基干粉，補足水量，輕輕攪拌以促進溶解。2.校正pH：高壓滅菌前可用pH計或精密pH試紙校正培養(yǎng)基的pH。3.分裝：液體培養(yǎng)基壹般在滅菌前分裝，分裝時應注意每管的分裝量不應高于試管的2/3。瓊脂平板是在培養(yǎng)基高壓滅菌后冷至50-600C時再傾注平板。4.質(zhì)量檢查[1]無菌試驗：將制好的培養(yǎng)基在350C孵育過夜，判定是否滅菌合格。[2]效果檢驗：按不同的培養(yǎng)要求，接種相應的菌種，觀察細菌的發(fā)育、菌落形態(tài)、色素、溶血等特征，判斷培養(yǎng)基是否符合要求。5.保存：液體培養(yǎng)基及瓊脂平板須在40C保存，壹般不超過7天，如用塑料袋密封至多保存2周。操作人員部門主管質(zhì)量負責人姓名唐玉貞檢驗科檢驗科日期06年06月06日Ⅳ革蘭染色的標準操作程序?qū)嶒炇颐椖烤幪栔贫ㄈ掌诜Q檢驗科革蘭染色檢驗科06年06月06日【目的】確保染色結(jié)果清晰可靠?！驹揝OP變動程序】本標準操作程序的改動，可由任壹使用本SOP的工作人員提出，且報經(jīng)下述人員批準簽字：專業(yè)主管、科主任?！驹噭?.結(jié)晶紫溶液A液：結(jié)晶紫2g95%乙醇20mlΒ液：草酸銨0.8g蒸餾水80ml使用前24小時將A液Β液混合后，過慮后裝入試劑瓶內(nèi)備用。2.碘液碘1g碘化鉀2g蒸餾水300ml3.脫色液：95%乙醇4.復染液儲存液：沙黃2.5g95%乙醇100ml應用液：儲存液10ml蒸餾水90ml【方法】1.待檢標本用無菌生理鹽水涂片，經(jīng)自然干燥或火焰固定。2.加結(jié)晶紫液染1分鐘，清水沖去染液。3.加碘液染1分鐘，清水沖去染液。4.加95%乙醇脫色液，不時搖動約10-30分鐘，至紫色已脫落為至，水沖洗。5.30分鐘，水沖洗。6.待涂片自然干燥后，油鏡鏡檢。操作人員部門主管質(zhì)量負責人姓名唐玉貞檢驗科檢驗科日期06年06月06日Ⅴ抗酸染色的標準操作程序?qū)嶒炇颐Q項目編號制定日期檢驗科抗酸染色檢驗科06年06月06日【目的】確保染色結(jié)果清晰可靠?！痉椒ā浚ㄒ唬A性復紅染色法【試劑】1、萋納石炭酸復紅溶液堿性復紅乙醇飽和溶液10ml5%石炭酸溶液90ml2、脫色劑濃鹽酸3ml95%乙醇97ml3、復染液（呂弗勒美藍液）美藍乙醇飽和溶液30ml10%氫氧化鉀0.1ml蒸餾水100ml【染色步驟】1、切不可沸騰。染52、加脫色劑，不時搖動坡片至無紅色脫落為至，水洗。3、加復染液，染0.5-1分鐘。4、干后鏡檢。分枝桿菌呈紅色，背景為藍色。注：奴卡菌、放線菌標本染色時，脫色劑改用2%硫酸水溶液。（二）金胺O-羅丹明Β染色法【染劑】1、羅丹明Β液：羅丹明Β0.1g加蒸餾水100ml；2、0.1%金胺O液：金胺O0.1g加蒸餾水95ml，再加入純石炭酸5ml，混勻。3、3%鹽酸酒精。4、稀釋美藍液：呂弗勒美藍液10ml，加蒸餾水90ml，混勻?！痉椒ā?、涂片固定后加第1液30-90分鐘。2、棄去第1液后加第2液染15分鐘。3、用第3液脫色1-2分鐘，水洗。4、滴加第4液染30分鐘，水洗，待干，熒光鏡檢?！窘Y(jié)果】抗酸菌在暗背景中呈現(xiàn)金黃色熒光。操作人員部門主管質(zhì)量負責人姓名唐玉貞檢驗科檢驗科日期06年06月06日Ⅵ血培養(yǎng)標本采集的標準操作程序?qū)嶒炇颐椖烤幪栔贫ㄈ掌诜Q檢驗科血培養(yǎng)標本的采集檢驗科06年06月06日【目的】指導血液標本的正確采集?！驹揝OP變動程序】本標準操作程序的改動，可由任壹使用本SOP的工作人員提出，且報經(jīng)下述人員批準簽字：專業(yè)主管、科主任?！静襟E】1.選擇壹適當?shù)撵o脈穿刺處，先以70%酒精擦拭。2.再用棉簽沾取2%碘酊涂于欲作靜脈穿刺處，讓其干后再用70%酒精擦拭。3.全部手續(xù)再作壹此（如必要）4.用壹支無菌的21號針頭和10ml針筒抽空（成人約抽取10ml血液，小孩約抽取1-5ml5.血液抽出后，立即注入血液培養(yǎng)瓶，馬上充分混勻后，再送入檢驗。操作人員部門主管質(zhì)量負責人姓名唐玉貞檢驗科檢驗科日期06年06月06日Ⅶ血液及骨髓微生物學檢驗的標準操作程序（SOP）實驗室名稱項目編號制定日期檢驗科血液及骨髓微生物學檢檢驗科06*年06月06日驗【目的】保證血（骨髓）培養(yǎng)結(jié)果的正確性?！驹揝OP變動程序】本標準操作程序的改動，可由任壹使用本SOP的工作人員提出，且報經(jīng)下述人員批準簽字：專業(yè)主管、科主任。【實驗條件】培養(yǎng)箱或厭氧培養(yǎng)箱（或厭氧罐）或全自動血培養(yǎng)儀?！静僮鞒绦颉浚ㄒ唬吮静杉瘒栏駸o菌技術(shù)取血液10ml（兒童血液1-5ml0.5-1ml注入血培養(yǎng)瓶后立即送實驗室，注入?yún)捬跗繒r要注意勿將注射器內(nèi)的空氣注入瓶內(nèi)，培養(yǎng)瓶在送試驗室前，不可放冰箱暫存。（二）培養(yǎng)1.實驗室接到血培養(yǎng)瓶后，放350C孵育。2.經(jīng)過12-18小時，350C孵育后，在血平板或巧克力平板上盲傳壹次。3.盲傳后繼續(xù)孵育，每日早晨觀察有無細菌生長，直至第7天。4.無細菌生長表現(xiàn)的培養(yǎng)瓶，在觀察的7天中，最少應做2次盲目傳種。5.全自動血培養(yǎng)儀培養(yǎng)時，待其儀器報警，涂片、接種；若儀器未報警，5天后盲種，仍為陰性，才能報告。（三）分離鑒定1.盲傳陽性或肉眼可見生長現(xiàn)象，直接涂片做革蘭染色，所見結(jié)果應及時報告臨床醫(yī)師。2.根據(jù)涂片結(jié)果，如為壹種細菌生長，則直接以增菌液做鑒定實驗；如有倆種或多種細菌同時生長，則必須經(jīng)過分離培養(yǎng)，以獲得純菌種后做鑒定。3.細菌鑒定要做到種的鑒定。（四）藥敏實驗1.根據(jù)涂片結(jié)果，直接以培養(yǎng)瓶內(nèi)的增菌液做直接藥物敏感性測試，爭取在較短時間內(nèi)得出初步結(jié)果，供臨床醫(yī)師作為治療的參考。2.標本經(jīng)平板分離純培養(yǎng)后，做標準化藥敏實驗正式報告給臨床?！窘Y(jié)果的判斷】1.疑有細菌生長者，經(jīng)涂片、革蘭染色鏡檢后，電話通知主管醫(yī)師。2.任何時候平板上長出單個菌落，應立即完成鑒定就及標準化藥敏實驗，且發(fā)出報告，報告形式為“XXX細菌生長，藥敏實驗報告形式為“XXX敏感”等。3.培養(yǎng)37“經(jīng)7日培養(yǎng)無細菌生長。操作人員部門主管質(zhì)量負責人姓名唐玉貞檢驗科檢驗科日期06*年06月06日保證質(zhì)量評價的準確可靠?！咀饔谩竣幟粼囼灥臉藴什僮鞒绦?qū)嶒炇颐Q項目編號制定日期檢驗科藥敏試驗檢驗科06年06月06日壹、K—B法【目的】保證紙片擴散法藥敏結(jié)果的可靠性?！静牧稀浚ㄒ唬┡囵B(yǎng)基Mueller-HintonHTMGC瓊脂＋1％特定的生長因子，只適合淋病奈瑟菌；Mueller-Hinton瓊脂＋5％羊血，只適合鏈球菌。（二）藥敏紙片抗菌藥物紙片直徑約為6.0-6.35mm，每片的吸水量約20ml。（三）質(zhì)控菌株K-Β法質(zhì)量控制用菌株常規(guī)用：金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853。（四）菌液比濁管接種菌液濃度為1.5x108/ml，相當于0.5的麥氏比濁管?！痉椒ā?.制備接種菌液：挑選瓊脂平板上，形態(tài)相同的菌落移種于M-H液體培養(yǎng)基中，置350C溫箱中孵育4小時，校正濁度，或用接中環(huán)挑取菌落，置浮于生理鹽水中振蕩混勻后和標準化濁管比濁，調(diào)整濁度和比濁管相同。2.M-H60最后沿平皿周邊繞倆圈，保證涂布均勻。3.貼紙片：待平板上的水分被瓊脂完全吸收后（約15貼在瓊脂平板表面，且用鑷尖輕壓壹下，使其貼平。每張紙片間距不少于24mm，紙片中心距平皿邊緣不少于15mm。4.350C孵平板，最好單獨擺放，不超過2個疊在壹起，孵育18-24小時后，讀取結(jié)果。5.判定結(jié)果：培養(yǎng)后取出平板，用游標卡尺測量抑菌環(huán)的直徑，抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見不到細菌明顯生長為限，然后根據(jù)抑菌環(huán)直徑大小、NCCLS判斷細菌的敏感性，且加以記錄。二、稀釋試驗【目的】1.為了決定抗生素的最低抑菌濃度（MIC2.為了決定抗生素殺菌能力，或?qū)嶒瀭z種之上抗生素對細菌的協(xié)同作用或?qū)棺饔??！痉椒ā浚ㄒ唬┤鉁♂屧囼?.適用情況：[1]血液培養(yǎng)。[2]病人對適當治療方法無效。[3]免疫機能障礙病人[4]病人經(jīng)治療后復發(fā)者。2.培養(yǎng)基的選擇：壹般細菌用調(diào)節(jié)好陽離子的M-HCAMHB不動桿菌、葡萄球菌、腸球菌、霍亂弧菌；某些挑剔性細菌則根據(jù)其生長的營養(yǎng)M-HHTMCAMHB＋2－5％凍融馬血，適合肺炎鏈球菌以及以外的鏈球菌。3.肉湯的連續(xù)稀釋：[1]將各種抗微生物藥物庫存液稀釋成200ug/ml或200u/ml。[2]取10支無菌試管，寫上編號1-10，為壹組每種抗生素需壹種。[3]自第2管至10管各加入無菌肉湯1。0[4]將各實驗藥分別加1.0ml至第1管及第2管，將第2管混勻后移取0.1ml至第3管，同樣操作，倍比稀釋至第910管不加抗生素作為陽性生長對照。[5]另外準備僅含肉湯的試管，作為陰性對照。4.細菌的接種[1]每支試管接種1.0ml105-106個細菌/ml0.5個麥氏濁度再用肉湯稀1：200然后接種1.0ml至每支試管內(nèi)。[2]接種后每支試管含混合液，抗生素濃度為512ug（u）-O.125ug（u[3]102倍稀釋，最后的濃度為10；5；2.5；0.6；0.3；0.15；0.08；及0.04ug/ml。5.培養(yǎng)和結(jié)果的判斷在350C溫箱中培養(yǎng)16-20陰性對照管則應清澈。以抗生素能抑制細菌生長管的最低濃度為其MIC值。6.測量最低殺菌濃度（MBC）把無菌生長的每壹試管吸0.1ml加到500C的胰蛋白胨肉湯（Trypticsoybroth,TSA）20ml混合均勻后分別倒平板，培養(yǎng)48-72小時后計算菌落數(shù)，和1：200稀釋原菌液作傾注獲得的細菌數(shù)相比，減少99.9％，其最小抑菌濃度為可得到抗生素的MBC0.00157.質(zhì)控：利用NCCLS建議的標準菌株進行質(zhì)控。（二）微量肉湯稀釋敏感實驗手工法：原理和試管稀釋方法相同。具體操作是在含有96小孔的小塑料培養(yǎng)盤進行，每壹孔可裝0.1ml量，每壹盤可同時作數(shù)種抗生素的數(shù)種不同濃度，另2孔作為陽性和陰性對照。儀器法：配制儀器Minidiluter或MIC-2000（美國）Dynatechlabortories，Alexandria，VA）自配或購買現(xiàn)成的實驗培養(yǎng)基。（三）瓊脂稀釋法1此法和肉湯稀釋實驗原理相同，但又有其優(yōu)點：①可同時實驗許多菌株，利用多點接種儀可同時接種多個菌株到壹系列含有各種不同抗生素濃度的平板。②可檢測是否污染：由細菌在平板上生長的特性判斷。③可對肉湯稀釋實驗結(jié)果不佳的挑剔性細菌進行實驗。2.M-H瓊脂，它適合腸桿菌科、銅綠假單胞菌、不動桿菌、葡萄球菌、腸球菌、霍亂弧菌；對挑剔的細菌可加入相應的營養(yǎng)物，如巧克力、動物血、5%脫纖維血或冷凍動物血等，如HTM瓊脂，只適合嗜血桿菌；GC瓊脂＋1Mueller-Hinton瓊脂＋5％羊血，只適合肺炎鏈球菌以外的鏈球菌。3.抗生素稀釋和平板的配制。4.平板的接種：[1]每壹試驗菌株需調(diào)整濃度至0.5麥氏濁度。[2]平板點接種可用定量接種杯（0.001ml同時作5ATCC25922、大腸埃希菌ATCC35218、金黃色葡萄球菌ATCC29213、糞腸球菌ATCC29212。5.待接種菌液被完全吸收后，倒置培養(yǎng)在350C溫箱內(nèi)。6.16-20小時后，首先見不含抗生素的對照平板，必須有壹株生長，然后見各實驗平板，凡能完全抑制細菌生長的抗生素最低濃度即為MIC值。操作人員部門主管質(zhì)量負責人姓名唐玉貞檢驗科檢驗科日期06年06月06日Ⅸ藥敏實驗室內(nèi)質(zhì)量控制的標準操作實驗室名稱項目編號制定日期檢驗科藥敏實驗室內(nèi)質(zhì)量控檢驗科06年06月06日制【目的】保證藥敏報告的準確性，可靠性及重現(xiàn)性?！驹揝OP變動程序】本標準操作程序的改動，可由任壹使用本SOP的工作人員提出，且報經(jīng)下述人員批準簽字：專業(yè)主管、科主任?！具m用范圍】瓊脂紙片擴散法?！痉椒ā恳?、培養(yǎng)基紙片擴散實驗必須使用M-H瓊脂培養(yǎng)基，因為它不含抑制磺胺藥物，而其他種類培養(yǎng)基可能含有和磺胺藥拮抗的物質(zhì)，使其抑菌環(huán)變小。1.PH的時間或溫度都需遵照規(guī)定，2.新的粉狀脫水培養(yǎng)基打開時，要附廠商、編號、日期、及打開者的姓名。3.無菌實驗：每壹批配好的培養(yǎng)基其中抽取5%的量在350C或其他適合的溫度下隔夜培養(yǎng)，觀察有無菌落生長。4.若是新購的培養(yǎng)基必須觀察其顏色和透明度，若有沉淀、渾濁或脫水的現(xiàn)象都必須丟棄，新配好的M-H培養(yǎng)基，用塑料袋包好，儲藏于40C的水箱內(nèi)，防水蒸發(fā)。5.平板所含培養(yǎng)基的量太多或太少均不宜，如Mueller—Hintonagar的高度不可超過4mm6.定期檢測培養(yǎng)基的有效性，且對結(jié)果加以記錄，以便能隨時發(fā)現(xiàn)問題。7.培養(yǎng)基要在有效期內(nèi)使用。二、試劑鑒定細菌實驗所用的紙條或紙片，儲藏于冰箱時，須附干燥劑，且須注意所標明的有效期限。紙片購入時須作陽性和陰性對照以檢查其是否有效，以后可每周做壹次。三、抗生素粉末和抗生素紙片檢查室診斷過程中所用抗生素粉末必須保持干燥，置冰箱儲藏，若其制成高濃度-140C或-140C解凍，未用完的就應丟棄。若抗生素粉末用于稀釋試驗時，須限已知MIC的微生物作對照。作藥敏用的抗生素紙片應放干燥劑且貯存于-140C或-140C以下，若情況不允許，除了penicillinscephalosporins及oxacillin紙片仍必須冰凍外，其余可置每天在作藥敏試驗時，最好同時取已知敏感的微生物質(zhì)控菌株作對照，來測驗紙片的功效。四、裝備1．培養(yǎng)箱、冰箱等裝備于每天早上上班時須記錄溫度且校正，使用過程中應注意溫度有無變化。2．CO2培養(yǎng)箱，要確保其所含的CO2量。31600C干燥箱中加熱1-2且同時于缸中放入生物指示劑可確定是否絕對無氧。五、操作人員素質(zhì)操作者應熟悉藥敏試驗的規(guī)范步驟，尤其要注意其影響因素，如：接種菌的且要使接種菌在平板上分布均勻；紙片間距要合適等。六、結(jié)果判讀紙片擴散敏感性試驗只適用于快速生長菌，不可用于緩