分子生物學實驗室的要求與儀器設備

PAGEPAGE141附錄二分子生物學實驗室的要求與儀器設備生命科學的飛速發(fā)展孕育了現(xiàn)代分子生物學技術，并且已經(jīng)滲透到生命科學的各個領域，因此在許多學科如遺傳學、分類學、病理學和醫(yī)學等均開展了相關研究。建立一個標準的分子生物學實驗室是非常必要的，它主要包括離心機室、細胞培養(yǎng)室、儀器分析室、普通實驗室和放射性核素操作室等；一個分子生物學實驗室應具備的儀器設備，按用途不同可分為以下幾類：一、離心機離心技術是利用物質的沉降、浮力和質量等差異，在離心力的作用下使其分離、純化和濃縮的一種物理手段。離心技術廣泛應用于收集和分離細胞、細胞器和生物大分子等。實驗室中常用的離心機容量和轉速各不相同，主要有：1．低速離心機：最大轉速6000r/min（轉/分鐘），離心力60002．高速離心機：最大轉速25,000r/min，離心力89,0003．超速離心機：最大轉速為120,000r/min，離心力為694,0004．臺式微量離心機：轉速可達12,000～18,000r/min，有常溫和冷卻兩種類型。適用于小量樣品（如1.5mL）的操作，可極大地縮短離心時間。主要用于生物大分子的微量操作。二、細胞培養(yǎng)由于細胞培養(yǎng)要求無菌操作，所以在細胞培養(yǎng)室最好設置獨立的無菌操作間；如果實驗室條件有限，那么在室內走動較少的位置設無菌操作區(qū)，同樣也能滿足要求。1．超凈工作臺：是不可缺少的無菌操作裝置。其原理是利用鼓風機驅動空氣，經(jīng)過高效過濾器后而通過工作臺面，使實驗操作區(qū)域成為無菌環(huán)境。2．恒溫培養(yǎng)箱：可調節(jié)溫度，用于細胞培養(yǎng)。3．CO2培養(yǎng)箱：它能恒定地提供一定量的CO2，通常為5%，用來維持培養(yǎng)液的酸堿度。適用于培養(yǎng)各種細胞。4．恒溫搖床：配有控溫裝置，用于液體細菌的培養(yǎng)。5．生化培養(yǎng)箱：既可加熱，又可制冷，用于細胞培養(yǎng)。6．倒置顯微鏡：用來觀察了解細胞的生長狀況，最好附帶照相裝置。7．實體顯微鏡：用于細胞的觀察和照相。三、分析及檢測儀器1．分光光度計：分光光度法是基于不同分子結構的物質對電磁輻射選擇性吸收而建立的分析方法。分光光度計能利用物質在可見光和紫外線區(qū)域中的吸收光譜來鑒定物質的性質及其含量。實驗室經(jīng)常使用的大都是紫外與可見光分光光度計，主要用于核酸的定量和純度檢測。2．電泳儀：可輸出穩(wěn)定的電流（最大250mA）和電壓（高達2500～3000V，用于測序）。根據(jù)輸出電壓不同，分為常壓、中壓和高壓穩(wěn)壓電泳儀。電泳技術是檢測和鑒定各種生物大分子的純度、濃度和大小的有力工具，甚至還是分離、純化、回收和濃縮樣品的主要工具之一。電泳裝置包括電泳儀和電泳槽。3．電泳槽：一般有水平和垂直電泳槽兩種。水平電泳槽可用于紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳、薄層電泳和瓊脂糖凝膠電泳等。垂直電泳槽可用于聚丙烯酰胺凝膠電泳等。4．脈沖場凝膠電泳裝置：與常規(guī)的直流單向電場凝膠電泳不同，脈沖場凝膠電泳采用定時改變電場方向的交變電源，時間與電流交替改變，使DNA分子能不斷地調整泳動方向，達到分離目的，目前該儀器可達到的最大分辨率為12Mb。為保證實驗效果，該裝置常附加冷卻系統(tǒng)。主要用于原核生物染色體的分離、核型分析、大片段物理圖譜制作、酵母人工染色體的分析、探測細胞染色體上百萬堿基對以上的基因組DNA的缺失等。5．紫外/可見檢測儀：能提供紫外光和可見光源，用于觀察凝膠條帶。對于核酸，電泳后需要溴化乙錠染色，在紫外光下觀察。使用波長為302nm的紫外燈，靈敏度較高，且對核酸的褪色和斷鏈作用較小。盡量避免長時間的照射凝膠，否則影響回收DNA片段的質量，而且影響觀察和照相效果。輻射式紫外燈對觀察者照射少，而透射式紫外燈的照相效果好，但須佩帶有機防護面罩。6．核酸/蛋白凝膠圖像分析系統(tǒng)：該系統(tǒng)包括圖像的攝取、分析、數(shù)據(jù)處理和打印等功能，可應用于觀察和拍攝瓊脂糖凝膠、考馬斯亮藍染膠、銀染膠、雜交膜、放射自顯影片和熒光顯影膠片等。利用該系統(tǒng)，可以得到最佳的圖像質量并對結果進行定性和定量分析，如自動計算分子量和濃度、斑點自動識別和質量計算、密集條帶識別和分析等。7．凝膠干燥儀：能將電泳后的凝膠進行脫水干燥，便于保存。8．PCR儀：聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction,PCR）是用于在體外酶促擴增特定DNA片段的快速方法，通過不同溫度下進行的DNA變性、引物復性和延伸等過程的循環(huán)，使靶序列DNA片段以指數(shù)級數(shù)積累。PCR儀又稱為DNA熱循環(huán)儀、基因擴增儀，在基因工程研究中廣泛應用。目前國內外許多廠家都生產(chǎn)PCR儀，各類儀器的溫度控制有所不同：（1）液體加熱和冷卻；（2）電阻加熱，液體冷卻；（3）電阻加熱，半導體致冷。利用熒光定量PCR儀可以進行定量分析。9．電穿孔儀：1988年Dower等人用電激法（electroporation）成功轉化細菌，其原理是在高壓電脈沖的作用下，使細胞膜上暫時出現(xiàn)微孔，從而將生物大分子如DNA、RNA、蛋白等導入動物、植物或微生物體內。通過各種參數(shù)的優(yōu)化，如電場強度、電脈沖長度、電容和電阻等，可提高轉化率。與化學轉化方法相比，電激法轉化細菌操作簡單，重復性好，轉化效率高。10．基因槍：基因槍技術是一種將核酸直接發(fā)送至細胞內的物理學方法，應用于包括培養(yǎng)細胞、組織、器官、植物、動物、細菌和細胞器官等各種不同的目標。11．DNA合成儀：DNA合成就是在實驗室內用化學合成方法進行基因或寡核苷酸片段的人工合成，目前已發(fā)展出的方法有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法以及后二者結合的固相合成法和自動化法。DNA合成儀的基本工作原理是，將待合成的DNA片段第一個核苷酸的3’-OH直接固定于惰性的固相載體上，然后從該核苷酸開始與下一個核苷酸進行縮合反應，反應后通過洗滌除去多余的反應物和副產(chǎn)物。重復進行以上步驟，每一次循環(huán)都加入一個核苷酸，一般一個循環(huán)只需幾分鐘，合成的鏈始終被固定在固相載體上。當鏈長達到所需長度后，將寡核苷酸鏈從固相載體上切除下來，并洗脫保護基，經(jīng)純化得到所需的寡核苷酸片段。目前化學合成寡核苷酸片段的能力一般在150～200bp，它主要用作合成基因的元件、核苷酸序列分析的引物、連接時使用的連接子和接頭、核酸分子雜交探針和基因定點誘變研究等。12．DNA測定儀：DNA自動測序技術在80年代以來迅速發(fā)展，其特點是操作簡單、安全（不使用同位素）、計算機精確控制、快速等。DNA自動測序技術的基本原理是利用了Sanger雙脫氧核苷酸末端終止法，在反應過程中，標記有熒光素（fluorescein）引物在DNA聚合酶作用下，按照堿基配對的原則，分別將4種dNTP（熒光素標記）底物加到引物的3'－OH端，與dNTP的5'－磷酸基團形成磷酸二酯鍵連接；如果反應體系中含有2'3'雙脫氧核糖核苷酸（ddNTP），雖然可摻入到正在延伸的DNA鏈中，但是由于沒有3'－OH，不能與后面的dNTP形成磷酸二酯鍵，使合成反應終止，得到一系列長度不同的以ddNTP結尾的一組片段，電泳之后可以直接讀出堿基順序。如Pharmacia公司的ALF全自動激光熒光DNA測序系統(tǒng)，PE公司的ABI377型DNA自動測序儀可自動進行順序分析、電泳、檢測條帶及堿基分析，需要工作人員操作的只是和進行反應及制膠。ABI最新型的全自動測序儀PRISM310型采用毛細管電泳技術取代了傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠平板電泳，不僅具有DNA測序、PCR片段大小分子和定量分析功能，且實現(xiàn)了全部操作自動化，包括灌膠、進樣、電泳、檢測、數(shù)據(jù)分析等。13．基因芯片系統(tǒng)：Affymetrix公司的基因芯片為寡核苷酸芯片（Oligo芯片），這種類型的芯片具有極高的特異性和靈敏度，重復性好，假陽性率非常低，是目前世界上最先進的基因芯片。Affymetrix所利用的原位光刻專利技術可使一張芯片上合成多達500,000個寡核苷酸。該系統(tǒng)可以分析樣品中DNA或者RNA序列的相對含量?？蓮V泛應用于從人類疾病的分子機理到臨床診斷、免疫學、信號轉導、基因調控、細胞周期與凋亡、藥物代謝與毒理、神經(jīng)發(fā)育與老化、肥胖與糖尿病、抗真菌藥物篩選、細菌基因組以及植物基因調控等研究領域。14．顯微操作系統(tǒng)：顯微操作系統(tǒng)是進行基因顯微注射，進行細胞轉基因必不可缺少的儀器之一。四、其它常規(guī)儀器及設備1．冰箱：常用的有4℃、―20℃和―802．天平：可備有多種規(guī)格和靈敏度的架盤天平和電子天平，以滿足不同實驗要求。3．酸度計：大部分試劑要求嚴格的pH值，因此應具有一臺精確度較高的酸度計；而pH試紙只適用于培養(yǎng)基、緩沖液等要求不高的溶液pH值的粗略估計。注意，許多緩沖液的pH值與溫度有密切關系，如50mmol/L的Tris·Cl溶液，在4℃時的pH值為8.6，25℃時為8.0，37℃4．磁力攪拌器：用于混勻樣品，常配備加熱功能。5．可調微量加液器：具有不同量程，用于各種微量液體體積的吸取。實驗室應備有一套不同規(guī)格的加液器，如Gilson產(chǎn)品的0～10μL、0～100μL、0～200μLl、0～1000μL和0～5000μL等加液器。6．電熱烘箱：用于干燥實驗器皿等。一般玻璃器皿在高溫下干燥，如RNA研究使用的器皿需在200℃烘干2h，以去除RNase的污染；而塑料器皿一般在較低溫度下（42～457．恒溫水浴鍋：溫度一般從室溫至100℃8．循環(huán)式水槽：可以制冷。主要用于某些酶反應、電泳冷卻循環(huán)用水等。9．純化水裝置許多實驗要求較高純度的水，常使用的有雙蒸水，其中的大部分有機雜質被除去，但無機離子仍存在，且制作時間較長；去離子水，通過離子交換樹脂進行處理。有些實驗還要求使用超純水，美國的微孔濾膜公司（MilliporeCorporation）的Milli-Q系統(tǒng)制造的超純水，采用紫外燈后凈化柱，可除去無機粒子和有機物，并經(jīng)過0.22μm孔徑的終端過濾器，可完全除去該孔徑以上的微生物及粒子。10．制冰機：用于提供實驗操作所需要的低溫環(huán)境。11．微波爐：可方便地進行溶液的快速加熱，如瓊脂糖凝膠的溶化、雜交洗膜液的定點加溫等。12．液氮罐：液氮溫度為－196℃，主要用于冷凍貯存細胞、細胞株、菌株、動植物樣品等，以較好地保持細胞生物學特性?？筛鶕?jù)實驗室需要，準備不同容量（10L、35L和50L13．高壓滅菌鍋：在進行細胞和細菌培養(yǎng)等無菌操作時，所有實驗用品、試劑及培養(yǎng)基等都需要高壓蒸汽滅菌；另外在進行核酸制備和酶解等有關操作時，要求沒有核酸酶的存在，所以實驗使用的所有用具和試劑等也要滅菌。一般在15lbf/in2（1.034×105Pa）壓力下，滅菌20min即可。注意有些試劑不能耐受高溫高壓處理，可用濾膜除菌；器皿可用紫外線照射、75%乙醇或0.1%的十二烷基硫酸鈉（SDS）浸泡消毒。14．快速振蕩混勻器：用于組織或細胞樣品的混勻等。15．組織勻漿器：用于組織或細胞樣品的破碎、分離和提純等。16．超聲破碎儀：用于組織或細胞樣品的破碎、分離和提純等。17．超聲清洗器：超聲清洗主要是利用超聲波在液體中的空化作用，這種空化作用是由于在超聲波作用下，液體分子時而受拉，時而受壓，形成一個個微小的空腔，即所謂”空化泡”,由于空化泡的內外壓力相差懸殊，所以在其消失時具有很大的沖擊力，使粘附在物質表面的污物脫落。同時超聲波在液體中又能加速溶解和乳化作用，從而達到清洗的目的。18．真空泵：為樣品提取和純化等設備提供穩(wěn)定的負壓。19．冷凍干燥儀：用于生物樣品的冷凍干燥。五、放射性核素操作在基因工程實驗中，有些實驗如DNA序列測定、核酸探針的體外標記和分子雜交等，需要使用放射性核素。由于它具有放射性，對人體產(chǎn)生輻射損傷并污染環(huán)境，所以操作必須在專用的實驗室內進行，并具備防護措施，如使用鉛玻璃或有機玻璃屏蔽、戴上有機玻璃眼鏡、戴乳膠手套操作、使用長柄工具（以加大操作者與放射源之間的距離）操作等。在基因工程實驗中經(jīng)常使用的放射性核素有32P、33P、35S和3H等，它們都是進行β衰變的，除了32P之外，其余幾種核素能量很低。特別注意，放射性廢物（包括廢液、吸頭、濾紙、玻璃器皿和實驗材料等）要單獨收集，分類存放于指定地點，并標明核素類別、放射性活度、日期和數(shù)量等，排放時必須遵守國家有關規(guī)定。放射性同位素實驗室除了一些專用于測定放射性活度的儀器外，還需要一些常規(guī)儀器，如冰箱、恒溫培養(yǎng)箱、離心機、恒溫水浴鍋、恒溫搖床、雜交箱和紫外交聯(lián)儀等等，注意，原則上放射性同位素實驗室的常規(guī)儀器與其它實驗室的儀器是不共用的。1．液體閃爍計數(shù)器：閃爍測量技術是利用某種閃爍物質將輻射能轉變?yōu)楣饽?，再利用光電倍增管使之轉變?yōu)殡娒}沖，從而分析射線的數(shù)量和能量。根據(jù)閃爍劑的物理狀態(tài)，可分為固體閃爍測量技術和液體閃爍測量技術。液體閃爍計數(shù)器使用的閃爍體為液體，是由有機閃爍體溶于適當溶劑中組成，放射性樣品置于液體閃爍體中，使射線直接被吸收，提高了探測效率。所以這種技術不僅測量的放射性核素和射線類型廣，而且最適合于測量穿透力較弱的射線，特別是低能β射線如3H，因為能量低，其它儀器難以測量。目前液體閃爍測量技術在生命科學中廣泛應用于生物大分子的結構與功能研究、物質的吸收與分布等代謝研究、分子雜交分析和放射免疫分析