病毒感染的實(shí)驗(yàn)室診斷

關(guān)于病毒感染的實(shí)驗(yàn)室診斷第1頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期五病毒感染的實(shí)驗(yàn)診斷方法病原學(xué)診斷病毒分離培養(yǎng)顯微鏡檢查抗原檢測(cè)核酸檢測(cè)血清學(xué)診斷抗體檢測(cè)IgM、IgG第2頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期五一、標(biāo)本采集與運(yùn)送（一）標(biāo)本采集采集時(shí)間：盡早采集（越早越好）標(biāo)本種類：根據(jù)感染的部位、可能感染的病毒類型選擇第3頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期五（二）標(biāo)本的運(yùn)送與保存1.低溫送檢

4℃可保存數(shù)小時(shí)-70℃可長(zhǎng)期保存

-10～-20℃下病毒易滅活，不可用于保存病毒標(biāo)本對(duì)冷凍標(biāo)本應(yīng)避免反復(fù)凍融2.保濕送檢50%甘油鹽水保存送檢病毒轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基（virustransportmedium，VTM）含0.5%明膠或牛血清白蛋白的Hank’s液3.無(wú)菌送檢抑制細(xì)菌生長(zhǎng)100U/ml青霉素＋100μg/ml鏈霉素抑制真菌生長(zhǎng)2.5μg/ml二性霉素B或40μg/ml制霉菌素第4頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期五二、病毒的分離與鑒定（一）病毒分離和鑒定的一般程序動(dòng)物接種組織培養(yǎng)標(biāo)本采集標(biāo)本處理后接種雞胚接種卵黃囊膜尿囊液羊膜腔液絨毛尿囊膜觀察囊膜病變血凝試驗(yàn)血凝抑制試驗(yàn)CPEEM包涵體空斑試驗(yàn)紅細(xì)胞吸附中和試驗(yàn)觀察發(fā)病抗原檢測(cè)抗體檢測(cè)病理檢查第5頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期五（二）病毒的分離組織培養(yǎng)雞胚培養(yǎng)動(dòng)物接種第6頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期五1.組織培養(yǎng)將人或動(dòng)物離體的活組織或分散的活細(xì)胞在體外人工控制的條件下使其生長(zhǎng)繁殖的一種技術(shù)。組織培養(yǎng)的類型（1）組織塊培養(yǎng)（2）器官培養(yǎng)人胚氣管－呼吸道病毒；人胚腸－腸道病毒（3）細(xì)胞培養(yǎng)最常用原代和次代細(xì)胞培養(yǎng)二倍體細(xì)胞培養(yǎng)傳代細(xì)胞培養(yǎng)第7頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

動(dòng)物新鮮組織（人胚腎等）→胰酶消化→營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)→單層細(xì)胞（原代細(xì)胞）原代細(xì)胞→胰酶消化→轉(zhuǎn)種培養(yǎng)（次代培養(yǎng)細(xì)胞）對(duì)病毒敏感，但制備費(fèi)時(shí)費(fèi)力，只能傳2～3代。二倍體細(xì)胞株原代細(xì)胞反復(fù)傳代（50～70代）仍保持二倍體染色體特性。病毒分離和疫苗制備的首選細(xì)胞株。傳代細(xì)胞系

來(lái)源于腫瘤細(xì)胞或突變的二倍體細(xì)胞，能在體外無(wú)限增殖。增殖快，不易衰老，易于傳代保存。常用于病毒的分離鑒定，但不能用于制備疫苗。

原代和次代培養(yǎng)細(xì)胞第8頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期五2.雞胚培養(yǎng)常用于粘病毒、皰疹病毒和痘類病毒的分離培養(yǎng)接種途徑及方法

新鮮受精卵接種病毒38～39℃7～13d卵黃囊接種羊膜腔接種尿囊腔接種絨毛尿囊膜接種第9頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期五絨毛尿囊膜表現(xiàn)有痘病毒的特異性損傷第10頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期五3.動(dòng)物接種常用動(dòng)物小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。不同病對(duì)動(dòng)物的敏感性不同，根據(jù)病毒種類加以選擇。接種途徑按病毒侵襲部位選擇相應(yīng)的接種途徑：乙型腦炎病毒及狂犬病毒小鼠腦內(nèi)接種柯薩奇病毒乳鼠腹腔接種乙肝病毒黑猩猩靜脈注射流感病毒鼻腔滴種用途分離鑒定病毒，制備疫苗，制備抗血清第11頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期五（三）病毒的鑒定病毒的初步鑒定動(dòng)物感染范圍及潛伏期對(duì)雞胚的敏感性在細(xì)胞培養(yǎng)中的表現(xiàn)理化性質(zhì)的測(cè)定最后鑒定血清學(xué)鑒定:中和試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)等分離的新病毒，必須進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定第12頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期五病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中的表現(xiàn)（1）細(xì)胞代謝作用改變（培養(yǎng)液顏色變化）正常細(xì)胞代謝：培養(yǎng)液由紅變黃病毒增殖，抑制細(xì)胞代謝：培養(yǎng)液顏色不變或更紅第13頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖后，使宿主的形態(tài)發(fā)生不同程度改變，這種由病毒增殖引起的細(xì)胞形態(tài)變化，稱為細(xì)胞病變效應(yīng)。（2）細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathiceffect，CPE）

細(xì)胞變圓、融合、腫脹、細(xì)胞空泡、核濃縮、形成嗜酸性或嗜堿性包涵體等。某些病毒感染細(xì)胞后不出現(xiàn)CPE第14頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期五第15頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期五（3）空斑現(xiàn)象空斑（plaque）是指在單層細(xì)胞中，由活細(xì)胞包圍的由病毒感染引起的死細(xì)胞的區(qū)域。一個(gè)空斑由一個(gè)病毒顆粒感染所致，利用空斑可純化病毒。不同種類病毒形成的空斑大小和形狀不同，可用于鑒定病毒。第16頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期五（4）干擾現(xiàn)象當(dāng)兩種不同的病毒同時(shí)或先后感染同一細(xì)胞時(shí)，其中一種病毒可抑制另一種病毒的增殖，稱為病毒的干擾現(xiàn)象。第17頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期五（5）紅細(xì)胞吸附及吸附抑制試驗(yàn)

受感染的宿主細(xì)胞膜含病毒抗原（血凝素），可吸附雞、豚鼠或猴紅細(xì)胞如果在培養(yǎng)瓶中加入相應(yīng)的血凝素抗血清，則不出現(xiàn)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象，即紅細(xì)胞吸附抑制試驗(yàn)陽(yáng)性第18頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期五（6）血凝及血凝抑制試驗(yàn)

含有血凝素的病毒能吸附一定種類的哺乳動(dòng)物或禽類的紅細(xì)胞，使紅細(xì)胞凝集。該現(xiàn)象可被相應(yīng)的血凝素抗體抑制，稱為血凝抑制試驗(yàn)，可用于分型。第19頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期五病毒的理化性質(zhì)測(cè)定主要用于新發(fā)現(xiàn)病毒的鑒定（1）病毒的大小及形態(tài)電鏡直接觀察（2）核酸類型

5-溴-2-脫氧尿苷（BUDR）能抑制DNA復(fù)制，而不抑制RNA病毒。（3）乙醚敏感試驗(yàn)

有包膜病毒對(duì)乙醚敏感，經(jīng)乙醚作用后，失去感染性（4）耐酸試驗(yàn)?zāi)c道病毒耐酸，在pH3的環(huán)境下穩(wěn)定，鼻病毒不耐酸，在pH3的環(huán)境下被滅活第20頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期五病毒的血清學(xué)鑒定中和試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)等第21頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期五三、病毒的血清學(xué)診斷單份血清IgM測(cè)定早期診斷雙份血清IgG測(cè)定4倍以上增長(zhǎng)，有診斷意義第22頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期五病毒血清學(xué)試驗(yàn)常用方法（一）中和試驗(yàn)原理抗體與相應(yīng)病毒結(jié)合后，能夠使病毒失去感染性。

V.＋Ab→失去感染易感細(xì)胞的能力一定量抗體可中和一定量病毒。

中和試驗(yàn)的必要條件：

1.活病毒

2.敏感細(xì)胞、雞胚或動(dòng)物第23頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期五中和試驗(yàn)的常用方法：固定V.，稀釋血清，測(cè)定抗體效價(jià)（常用）固定血清，稀釋V.，求中和指數(shù)中和試驗(yàn)的優(yōu)缺點(diǎn)特異，敏感，既可檢測(cè)抗體，也可測(cè)定抗原（定屬、定型）。既可用細(xì)胞培養(yǎng)做，也可用動(dòng)物或雞胚接種，以細(xì)胞最常用。檢測(cè)IgG，不能用于早期診斷，常用用于流行病學(xué)調(diào)查。第24頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期五（二）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)IgM，常用于早期診斷。不需活細(xì)胞，比中和試驗(yàn)簡(jiǎn)單，省時(shí)。（三）IF及ELISA方法簡(jiǎn)單、快速、敏感性高。第25頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期五四、病毒感染的快速診斷（一）病毒的形態(tài)學(xué)檢查

1.光學(xué)顯微鏡檢查

病變組織中找包涵體。簡(jiǎn)便、快速，但敏感性低，有些病毒感染細(xì)胞后不形成包涵體

狂犬病毒胞漿內(nèi)包涵體（內(nèi)基小提）巨細(xì)胞病毒胞核內(nèi)包涵體第26頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期五2.電鏡及免疫電鏡檢查直接檢查標(biāo)本中的病毒顆粒，快速，可確診。但敏感性低（＞106/ml）免疫電鏡敏感性高，但只能用于已知病毒的檢測(cè)）乙型肝炎病毒電鏡圖輪狀病毒電鏡圖第27頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期五（二）病毒抗原檢查

用免疫標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)：DFA、IFA、IEA等可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)、外的游離病毒抗原。敏感、特異，簡(jiǎn)便、快速。適用于多種病毒性疾病的早期快速診斷。InfluenzavirusA培養(yǎng)物DFA染色陽(yáng)性

InfluenzavirusB培養(yǎng)DFA染