方法學(xué)驗(yàn)證方法

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內(nèi)容提要：（方法學(xué)驗(yàn)證的應(yīng)用、依據(jù)、類型、一般參數(shù)、要求）

驗(yàn)證應(yīng)用：方法驗(yàn)證是對(duì)測(cè)定方法的評(píng)價(jià)，是建立新方法的研究?jī)?nèi)容和依據(jù)。

（新建方法、已建立方法的修訂驗(yàn)證、已建方法的復(fù)現(xiàn)）

驗(yàn)證依據(jù)：方法應(yīng)用領(lǐng)域?qū)Ψ椒?yàn)證要求的“指導(dǎo)原則”

驗(yàn)證類型：全部驗(yàn)證Fallvalidation、部分驗(yàn)證Partialvalidation、交叉驗(yàn)證crossvalidation

●Fullvalidation：第一次新建方法；一個(gè)已建方法，但增加分析對(duì)象（精密、回收）。

●Partialvalidation：（已建方法的部分改變）

1)分析方法改變（檢測(cè)器改變）；

2)生物樣品（抗凝劑改變）；

3)基質(zhì)改變（血－尿）；

4)前處理方法改變；

5)生物樣品種屬改變（rat大鼠－mouse小鼠）；

6)儀器改變工作軟件改變；

7)稀有生物樣品，取樣量有限。

●Crossvalidation：樣品分析在不同場(chǎng)所或?qū)嶒?yàn)室進(jìn)行時(shí)，不同實(shí)驗(yàn)室需進(jìn)行加樣生物樣品或

實(shí)際樣品分析，建立實(shí)驗(yàn)室間的重現(xiàn)性數(shù)據(jù)。當(dāng)分析數(shù)據(jù)由不同檢測(cè)技術(shù)產(chǎn)生時(shí)LC－MSvsELSD需交叉驗(yàn)證

部分驗(yàn)證：準(zhǔn)確度，精密度（都做）

交叉驗(yàn)證：加樣準(zhǔn)確度，實(shí)際樣品分析（任一）

一般參數(shù)：

精密度precision:

同一勻質(zhì)樣品的一組測(cè)量值，彼此符合的程度。

1)SD標(biāo)準(zhǔn)偏差standarddeviation

2)％RSD相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差relativeSD，CV變異系數(shù)n>8

標(biāo)準(zhǔn)差SD=開方（求和（xi－x均值）/（n－1））

％RSD＝SD/x均值×100％

●日內(nèi)精密度（intradayprecision）：同一次測(cè)定，7～10份，按方法做。測(cè)定，SD值，RSD

限度（生物制品5％，藥品2％）。

●日間精密度（interdayprecision）：不同一次測(cè)定，7～10份，按方法做。測(cè)定，SD值，RSD

限度（生物制品15％，藥品5％）。

準(zhǔn)確性accuracy：

●結(jié)果與真值的接近程度，表示分析方法測(cè)定的正確性，通常用回收率實(shí)驗(yàn)表示（加樣回收率）。

●回收率＝（測(cè)定液測(cè)定值－原樣液含測(cè)值）/加入量值×100％

靈敏度：

●檢測(cè)限（limitofdetectionLOD）：分析方法能從背景信號(hào)中區(qū)分出藥物，所需樣品中藥物

的最低濃度，LOD反映方法與儀器的靈敏度和噪音也表明樣品經(jīng)處理后本底值的高低。S/N>3●定量限（limitofquantitationLOQ）在保證具有一定可靠性（一定準(zhǔn)確度和精密度）分析方

法能夠測(cè)定出樣品中藥物的最低濃度。反映分析方法測(cè)定含藥物的低濃度樣品時(shí)的可靠性。

選擇性（selectivity）：

分析方法從其他成分中區(qū)分并定量目標(biāo)成分的能力

●專屬性（specificity）：指一種方法僅對(duì)一種分析成分產(chǎn)生唯一信號(hào)

●選擇性（selectivity）：指一種方法可對(duì)多種成分產(chǎn)生不同響應(yīng)，主要成分響應(yīng)可與其他成

分區(qū)分

選擇性的區(qū)分選擇內(nèi)容：

?化藥：雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、相關(guān)化合物、制劑輔料（可通過空白比較和添加法所得分析結(jié)

果比較確定）

?體內(nèi)藥物：內(nèi)源性物質(zhì)、代謝物、分解產(chǎn)物、分析中的相伴物、內(nèi)源性代謝物

?體內(nèi)藥分的選擇性內(nèi)容：空白生物樣品（血尿、膽汁等）、至少六個(gè)來源的生物樣品（非

MS方法）、每個(gè)空白樣品均測(cè)定干擾和LOQ。

線性（liner）：

●給定范圍內(nèi)獲取與樣品中供試物濃度成正比的試驗(yàn)結(jié)果的能力

●線性范圍是指利用一種方法取得精密度、準(zhǔn)確度均符合要求的試驗(yàn)結(jié)果，而且呈線性的供試

物濃度的變化范圍其最大、最小量間的間隔。

●濃度范圍包括5-8個(gè)濃度點(diǎn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)覆蓋樣品濃度范圍。

1.藥物一般80-120%（但低限不低于LOQ）

2.體內(nèi)藥物、濃度上線高于樣品最高濃度，下限為LOQ

3.相關(guān)系數(shù)(r)表示了線性度r≧0.9900

重現(xiàn)性（Repeatibility）

相同方法在正常條件下多次重復(fù)測(cè)定同一勻質(zhì)樣品所得分析結(jié)果的重現(xiàn)程度。

穩(wěn)定性（Stability）

●生物樣品中藥物的穩(wěn)定性涉及儲(chǔ)存條件、藥物理化性質(zhì)、基質(zhì)、容器系統(tǒng)。

●Stability評(píng)價(jià)包括：樣品收集與前處理、短期儲(chǔ)存、長期儲(chǔ)存、凍融、處理后穩(wěn)定性。

穩(wěn)定性試驗(yàn)要求

●Stability考察條件應(yīng)反映實(shí)際測(cè)定過程的實(shí)驗(yàn)條件。

●應(yīng)包括Stockingsolution穩(wěn)定性的考察

●凍融穩(wěn)定性至少高、中、低三個(gè)濃度、三個(gè)凍融過程在真實(shí)實(shí)驗(yàn)條件下保存樣品，室溫化

凍，至少保存24小時(shí)，第二、三次相同條件下至少保存12-24小時(shí)，在第三個(gè)circle時(shí)分析。

●如果樣品不穩(wěn)定，應(yīng)在-70℃下保存

●短期穩(wěn)定性：樣品化凍后室溫4-24小時(shí)考察穩(wěn)定性

●長期穩(wěn)定性：應(yīng)包括第一樣品—>最后樣品分析結(jié)束的全過程（三個(gè)濃度、足夠樣品）

處理后穩(wěn)定性

分析過程~~~一個(gè)方法經(jīng)建立、驗(yàn)證、正常應(yīng)用后進(jìn)行分析。

分析包括：標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、分析法與過程建立、驗(yàn)證后方法應(yīng)用與建立分析結(jié)果認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)。藥物定量方法：LC、GC、生化免疫、同位素標(biāo)示。

驗(yàn)證要求：

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線至少6個(gè)點(diǎn)，包括LLOQ（標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度）、ULOQ（最高濃度）Upperlimit

ofquantification

2.精密度precision和準(zhǔn)確度accuracy：三個(gè)濃度，每個(gè)濃度進(jìn)樣5次，測(cè)定與理論差≤

15%、LLOQ外≤20%。三個(gè)濃度的分布要求：lowQCsample=3*LLOQmiddleQC=中間

點(diǎn)highQC接近曲線最高點(diǎn)

3.穩(wěn)定性：2個(gè)濃度的三次凍融（每個(gè)2次？）生物樣品的室溫穩(wěn)定性、處理后的穩(wěn)

定性。

分析數(shù)據(jù)的可接受標(biāo)準(zhǔn)

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線除LLOQ，CV在15%以內(nèi)

2.QCsample在分析過程中合理分布

3.QCsample至少67%-->>15%可接受

4.每樣品周期中QC樣品至少5%

中藥指紋圖譜方法驗(yàn)證評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)CSV圖