膠體金快速免疫診斷技術(shù)

關(guān)于膠體金快速免疫診斷技術(shù)第1頁，共33頁，2023年，2月20日，星期五

層析法技術(shù)優(yōu)勢:簡單\現(xiàn)場\快速1.打開包裝取出試紙條2.直接插入待測樣品中3.目測讀出結(jié)果（3-10分鐘內(nèi)）第2頁，共33頁，2023年，2月20日，星期五

與常規(guī)診斷方法相比

優(yōu)點缺點快速：全部檢測過程僅需3-10分鐘。簡便：不需其它任何儀器設(shè)備，操作也極其簡單，無需專業(yè)人員，攜帶方便，可隨時隨地進(jìn)行。廉價：單個測試條成本極低

可單份檢測：對標(biāo)本既能成批檢測，又可單份檢測，可立刻拿到結(jié)果，不必等待。

穩(wěn)定性好：金標(biāo)試劑穩(wěn)定，可長期保存。

檢測標(biāo)本種類多：既可用于查血，又可用于檢尿或唾液，因而適合各種檢查定量問題靈敏度問題第3頁，共33頁，2023年，2月20日，星期五

技術(shù)應(yīng)用類別應(yīng)用領(lǐng)域檢測的物質(zhì)人類醫(yī)學(xué)各級醫(yī)院,血站,CDC,防疫站,診斷中心；家庭自檢；商檢系統(tǒng)；邊檢口岸；公安系統(tǒng).傳染?。ㄒ腋挝屙?HIV,SARS等）標(biāo)志物（AFP、肌鈣蛋白、糞便血紅蛋白等）女性妊娠（hCG(早孕),LH,FSH)毒品（嗎啡,K粉,搖頭丸,冰毒）農(nóng)牧業(yè)畜牧獸醫(yī)站,商檢系統(tǒng),邊檢口岸,農(nóng)牧類院系和研究所傳染?。ㄇ萘鞲?獸瘟疫等）環(huán)境環(huán)保監(jiān)測部門,研究機(jī)構(gòu)有害物質(zhì)超標(biāo)食品安全食品安全檢測中心,各監(jiān)管部門農(nóng)獸藥殘留（磺胺類、瘦肉精等）,大腸桿菌,黃曲霉素第4頁，共33頁，2023年，2月20日，星期五試紙條組成結(jié)構(gòu)測試線（T線）控制線（C線）膠體金墊吸水濾紙樣品墊NC膜（硝酸纖維素膜）層析方向PVC底板有4個組分：⑴、吸水紙（樣品墊）。⑵、玻璃纖維膜（膠體金墊）。膜上吸附著干燥的金標(biāo)抗體（流動帶）。⑶、硝酸纖維素膜，膜上包被著抗原或抗體條帶和能與標(biāo)記物直接起反應(yīng)的質(zhì)控物條帶（檢測帶）。⑷、吸水紙。以上各組份首尾互相銜接。

第5頁，共33頁，2023年，2月20日，星期五基本原理是將已知的特異性抗原或抗體固定于硝酸纖維素膜上某一區(qū)帶作為檢測帶，在樣品區(qū)滴加樣品后，借助毛細(xì)作用，樣品泳動至玻璃纖維膜，金標(biāo)復(fù)合物溶解，并與樣品進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，形成復(fù)合物，繼續(xù)泳動至硝酸纖維素膜的檢測區(qū)，帶有金標(biāo)記的復(fù)合物被檢測區(qū)抗原或抗體捕獲，呈現(xiàn)紅色條帶。如樣品中沒有待測抗原或抗體，則不發(fā)生結(jié)合，即不顯色。在硝酸纖維素膜檢測區(qū)附近一般再固定上針對金標(biāo)結(jié)合物相應(yīng)的抗原或抗體作為質(zhì)控帶，無論樣品中有無待測物，質(zhì)控線都應(yīng)顯示，如無，則檢測失敗。整個過程一般在15分鐘內(nèi)完成，操作簡單、快速，且不需任何儀器。第6頁，共33頁，2023年，2月20日，星期五免疫層析法檢測原理分類介紹

膠體金免疫層析法檢測流腦抗體（間接法）

膠體金標(biāo)記的兔抗人IgG，樣品中的流腦抗體與膠體金標(biāo)記的抗人IgG結(jié)合，沿硝酸纖維素膜移動，在包被有流腦抗原結(jié)合，出現(xiàn)紅色反應(yīng)線。

第7頁，共33頁，2023年，2月20日，星期五免疫層析法檢測原理分類介紹

（雙抗體夾心）（以HCG檢測為例）HCG-β亞基抗體Y2，羊抗鼠二抗固定于硝酸纖維素膜上，金標(biāo)HCG-α亞基單抗Y1固定于玻璃纖維素膜上。第8頁，共33頁，2023年，2月20日，星期五免疫層析法檢測原理分類介紹

（競爭反應(yīng)）（以嗎啡檢測為例）嗎啡偶聯(lián)物和膠體金標(biāo)記的抗嗎啡單克隆抗體固定于膜上測試區(qū)。通過嗎啡偶聯(lián)物和尿液中的嗎啡競爭結(jié)合金標(biāo)單克隆抗體，最小檢出量300ng/ml。

結(jié)果判定：

陽性（+）：嗎啡300ng/ml以上，質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紫紅色條帶，測試區(qū)內(nèi)不出現(xiàn)紫紅色條帶。嗎啡濃度高于300ng/ml時，膠體金抗體與嗎啡全部結(jié)合，從而不與嗎啡偶聯(lián)物結(jié)合而不出現(xiàn)紫紅色條帶。陰性（-）：嗎啡在300ng/ml以下。出現(xiàn)兩條紫紅色條帶，一條在測試區(qū)內(nèi)，另一條在質(zhì)控區(qū)內(nèi)。嗎啡濃度低于300ng/ml時，膠體金抗體不能與嗎啡全部結(jié)合。這樣，膠體金抗體在層析過程中會被固定在膜上的嗎啡偶聯(lián)物結(jié)合，測試區(qū)內(nèi)會出現(xiàn)一條紫紅色條帶。無效：質(zhì)控區(qū)未出現(xiàn)紫紅色條帶，表明不正確的操作過程或試劑盒已變質(zhì)損壞。

第9頁，共33頁，2023年，2月20日，星期五抗體Antibody來源差異:鼠抗,兔抗和羊抗種類差異:單抗,多抗?jié)舛?濃縮溶解液:不含鹽

抗原抗體生物原料抗原Antigen全病毒抗原重組抗原第10頁，共33頁，2023年，2月20日，星期五

膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。第11頁，共33頁，2023年，2月20日，星期五容器硅化處理：玻璃表面少量的污染會干擾膠體金顆粒的生成，一切玻璃容器應(yīng)絕對清潔，用前經(jīng)過酸洗、硅化。將玻璃容器浸泡于５％二氯二甲硅烷的氯仿溶液中１分鐘，室溫干燥后蒸餾水沖洗，再干燥備用。膠體金的制備

第12頁，共33頁，2023年，2月20日，星期五膠體金的制備

枸櫞酸三鈉還原法

15nm、18nm～30nm、40nm或50nm膠體金顆粒的制備：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加熱煮沸。根據(jù)需要迅速加入1％枸櫞酸三鈉水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，繼續(xù)煮沸約5min，出現(xiàn)橙紅色。這樣制成的膠體金顆粒則分別為15nm、18～20nm、41nm和50nm顏色與顆粒的關(guān)系.最佳標(biāo)記顆粒大小40nm.第13頁，共33頁，2023年，2月20日，星期五1％檸檬酸三鈉ml0.300.450.701.001.502.00

金溶膠顏色藍(lán)灰紫灰紫紅紅橙紅橙

吸收峰(nm)220240535525522518

徑粒(nm)14797.571.54024.515

第14頁，共33頁，2023年，2月20日，星期五

膠體金的鑒定1.肉眼觀察：在日光下仔細(xì)觀察膠體金顏色，可以大致估計金顆粒大小。同時良好的膠體金應(yīng)該是清澈透明的，若渾濁或有漂浮物提示有較多的凝集顆粒。2.分光光度計掃描吸收峰時光波長來估計金顆粒的大小。3.電鏡可見精確測定金顆粒的大小。第15頁，共33頁，2023年，2月20日，星期五

免疫膠體金的制備

膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。

蛋白質(zhì)的預(yù)處理:

1.蛋白質(zhì)應(yīng)先對低離子強(qiáng)度的水透析，去除鹽類成份。鹽類成份能影響膠體金對蛋白質(zhì)的吸附，并可使膠體金聚沉，應(yīng)避免磷酸根離子和硼酸根離子的存在。

2.用微孔濾膜或超速離心除去蛋白質(zhì)溶液中的細(xì)小微粒。

3.膠體金對蛋白的吸附主要取決于pH值，在接近蛋白質(zhì)的等電點或略偏堿的條件下，二者容易形成牢固的結(jié)合物。如果膠體金的pH值低于蛋白質(zhì)的等電點時，則會聚集而失去結(jié)合能力。

第16頁，共33頁，2023年，2月20日，星期五蛋白質(zhì)最適用量測定:將待標(biāo)記的蛋白質(zhì)（鼠抗人IgG）儲存液作系列稀釋后，分別取0.1ml加到1ml膠體金溶液中，另設(shè)一管不加蛋白質(zhì)的對照管，5分鐘后加入0.1ml10％NaCl溶液，混勻后靜置2小時。第17頁，共33頁，2023年，2月20日，星期五123

4576膠體金(ml)1111111蛋白質(zhì)(ug)010152025303510%NaCl0.10.10.10.10.10.10.1

結(jié)果判斷:對照管或加入蛋白量不足，膠體金出現(xiàn)由紅變藍(lán)的凝聚現(xiàn)象；加入蛋白質(zhì)量達(dá)到或超過穩(wěn)定量，則膠體金保持紅色不變第18頁，共33頁，2023年，2月20日，星期五不穩(wěn)定的金溶膠將發(fā)生聚沉，對照管（未加蛋白質(zhì)）和加入蛋白質(zhì)的量不足以穩(wěn)定膠體金的各管，均呈現(xiàn)出由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象；而加入蛋白量達(dá)到或超過最低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變。以穩(wěn)定1ml膠體金溶液紅色不變的最低蛋白質(zhì)用量，即為該標(biāo)記蛋白質(zhì)的最低用量，在實際工作中，可適當(dāng)增加10％，在此情況下蛋白質(zhì)分子在金顆粒表面的吸附量最大。

膠體金與蛋白質(zhì)偶聯(lián)后，加入穩(wěn)定劑，以避免產(chǎn)生凝集。一般選用PEG（分子量為20000）和牛血清白蛋白作穩(wěn)定劑。加入的量：5％BSA使溶液終濃度為1%；1%聚乙二醇加至總?cè)芤旱?/10。第19頁，共33頁，2023年，2月20日，星期五①用0.1mol/LK2CO3或0.1mol/LHCl調(diào)節(jié)金溶膠至所需pH。

②于100ml金溶膠中加入最佳標(biāo)記量的蛋白質(zhì)溶液攪拌2～3分鐘。

③加入5ml1%PEG20000溶液。

④于10000～100000g離心30～60分鐘小心吸去上清液（切忌傾倒）。

⑤將沉淀懸浮于一定體積含0.2～0.5mg/mlPEG20000的緩沖液中，離心沉淀后，再用同一緩沖液恢復(fù)，濃度以A540nm=1.5左右為宜，防腐置4℃保存。

⑥包被后的金溶膠也可濃縮后于SephadexG-200柱進(jìn)行凝膠層析分離純化，以含0.1%BSA的緩沖溶液洗脫。通常用IgG包被的金溶膠洗脫液pH為8.2。

以上操作中應(yīng)注意，一切溶液中不應(yīng)含雜質(zhì)微粒，可用高速離心或微孔濾膜預(yù)處理。

第20頁，共33頁，2023年，2月20日，星期五膠體金蛋白結(jié)合物的質(zhì)量鑒定

平均直徑的測量：用支持膜的鎳網(wǎng)（銅網(wǎng)也可）蘸取金標(biāo)蛋白試劑，自然干燥后直接在透射電鏡下觀察?；蛴么姿徕檹?fù)染后觀察。計算100個金顆粒的平均直徑。OD520nm值測定：用PBS液（含1%BSA）將膠體金蛋白試劑作1:20稀釋，OD520＝0.25左右。一般應(yīng)用液的OD520應(yīng)為0.2～0.4。金標(biāo)記蛋白的特異性與敏感性測定：采用微孔濾膜免疫金銀染色法。將可溶性抗原（或抗體）吸附于載體上（濾紙、硝酸纖維膜、微孔濾膜），用膠體金標(biāo)記的抗體（或抗原）以直接或間接染色法并經(jīng)銀顯影來檢測相應(yīng)的抗原或抗體，對金標(biāo)記蛋白的特異性和敏感性進(jìn)行鑒定。

第21頁，共33頁，2023年，2月20日，星期五

膠體金蛋白結(jié)合物玻璃纖維素膜制備膠體金標(biāo)記的鼠抗人IgG放入玻璃纖維素膜浸泡10分鐘，取出至37度烤箱中烤干，熱合封口，置4攝氏度冰箱備用。(實驗階段）用噴點儀將膠體金標(biāo)記的鼠抗人IgG噴在玻璃纖維素膜上,真空干燥2h。（生產(chǎn)階段）第22頁，共33頁，2023年，2月20日，星期五選擇NC膜NC膜的選擇爬速(???秒/4cm)對靈敏度的影響通過同一T線噴點位置時,金溶液通過的速度是快速膜>慢速膜.那么通過速度越快和包被在T線的物質(zhì)反應(yīng)時間也就越短,讀數(shù)快,那么靈敏度也就越低.反之,反應(yīng)時間長,讀數(shù)慢,也就靈敏度高。同時還有一個問題是,反應(yīng)時間越長,發(fā)生非特異性結(jié)合的可能性就越大,所以過長時間的反應(yīng)不一定就能夠真正的提升靈敏度.。所以這里就有一個讀數(shù)時間/反應(yīng)靈敏度/非特異性結(jié)合的均衡.不同膜廠家的產(chǎn)品(Whatman,Millipore,Sartorius)大致為:135s和180s第23頁，共33頁，2023年，2月20日，星期五抗原、抗體包被固相NC膜的制備包被流腦抗原濃度篩選（T線）抗原用PBS梯度稀釋,釋后用1μl移液器點在NC膜上,37℃干燥1h備用。包被抗鼠IgG濃度篩選（C線）抗鼠IgG抗體用PBS梯度稀釋,釋后用1μl移液器點在NC膜上,37℃干燥1h備用。第24頁，共33頁，2023年，2月20日，星期五溶液噴點

(噴點演示:BIODOTXYZ系列噴點儀器)C\T線溶液前處理:1.過濾,0.22um孔徑濾膜2.離心1萬轉(zhuǎn)10分鐘C\T線噴點工藝與接觸劃點工藝比較因劃膜式為軟管將抗體劃到膜表面,而膜本身的物理性質(zhì)為軟脆,劃管會在其表面留下印痕.劃痕容易對層析的金標(biāo)復(fù)合物形成阻力,導(dǎo)致假陽性。第25頁，共33頁，2023年，2月20日，星期五第26頁，共33頁，2023年，2月20日，星期五干燥干燥方法的比較37度干燥４h：顆粒感較強(qiáng)，易中間白，周邊深;低溫真空干燥３h：顏色均一，只是兩端稍淺，有一定的柔性。第27頁，共33頁，2023年，2月20日，星期五試紙條組裝

在干燥間內(nèi)準(zhǔn)備好吸水濾紙、樣品墊、PVC