藥物特殊毒性評(píng)價(jià)

藥物的遺傳毒性及評(píng)價(jià)

了解毒性反應(yīng)劑量、時(shí)間、強(qiáng)度、癥狀、靶器官及可逆性等，為臨床方案供應(yīng)參考、預(yù)料出現(xiàn)的毒性反應(yīng)，制訂臨床防護(hù)措施、保證受試者用藥平安

毒理學(xué)特殊毒性評(píng)價(jià)一般毒性評(píng)價(jià)急性毒性長(zhǎng)期毒性目的局部毒性遺傳毒性致癌性生殖毒性依靠性先天愚型海豹肢畸形突變（mutation）指生物體遺傳物質(zhì)發(fā)生急劇的遺傳學(xué)變更，導(dǎo)致可遺傳的表型變異，其表型變異為不行逆的，這種現(xiàn)象稱為突變作用。

突變作用可視為DNA結(jié)構(gòu)在任一水平上受到破壞，并由此變更了體細(xì)胞或生殖細(xì)胞中的遺傳信息，DNA是大分子物質(zhì)，它確定了生命現(xiàn)象的基本屬性

第1節(jié)

藥物致遺傳損傷的類型堿基的排列依次確定著蛋白質(zhì)肽鏈的長(zhǎng)短及其氨基酸的依次基因是DNA分子上最簡(jiǎn)潔而已完整的功能單位，每一個(gè)基因產(chǎn)生一種功能產(chǎn)物，幾乎全部的基因功能產(chǎn)物是多肽（蛋白質(zhì)）一個(gè)基因在伸直的DNA鏈上約500-1000個(gè)堿基對(duì)結(jié)果可造成細(xì)胞或機(jī)體的死亡、或細(xì)胞、機(jī)體結(jié)構(gòu)形態(tài)或功能的變更染色體畸變（chromosomeaberration）基因突變（genemutation）（一）基因突變定義：組成一個(gè)染色體的一個(gè)或幾個(gè)基因發(fā)生變更，這種變更不能用光學(xué)顯微鏡干脆視察到。

二、基因突變與染色體畸變（一）自發(fā)突變與誘發(fā)突變自發(fā)突變--------在自然狀態(tài)下基因結(jié)構(gòu)發(fā)生的變更，與生物適應(yīng)環(huán)境變更的進(jìn)化有關(guān)誘發(fā)突變--------在外界因素影響下所產(chǎn)生的基因結(jié)構(gòu)變更變更一、基因突變（二）堿基置換與移碼突變（1）轉(zhuǎn)換型突變：指DNA多核苷酸鏈上的堿基中，嘌呤相互取代或嘧啶相互取代所引起的突變。如：亞硝酸可引起這種突變（2）顛換型突變：只DNA多核苷酸鏈上的堿基中，嘌呤取代嘧啶或嘧啶取代嘌呤所引起的突變。如：二乙基亞硝酸胺一、基因突變（二）堿基置換與移碼突變（3）移碼突變定義：指DNA多核苷酸鏈上堿基序列中丟失一個(gè)或幾個(gè)堿基，或插入一個(gè)或幾個(gè)化合物分子，結(jié)果使突變位點(diǎn)以下的堿基序列發(fā)生變更，以致使三聯(lián)密碼轉(zhuǎn)錄和翻譯時(shí)，發(fā)生較多遺傳信息的改變。多環(huán)芳香烴類、等能引起插入性移碼突變一、基因突變（三）同義突變、錯(cuò)義突變和無義突變一、基因突變（二）染色體畸變定義：一個(gè)或幾個(gè)染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)目發(fā)生變更，用光學(xué)顯微鏡可以干脆進(jìn)行視察。1.染色體數(shù)目的畸變突變細(xì)胞中，染色體可以成倍地發(fā)生變更，也可以不成倍的增減二、染色體畸變2.染色體結(jié)構(gòu)的畸變斷裂是造成染色體結(jié)構(gòu)變更的根本緣由，依據(jù)斷片不同的重接方式，形成以下四種畸變：（1）缺失（2）重復(fù)（3）倒位（4）易位在誘變因素的作用下，染色體從長(zhǎng)軸上斷下一個(gè)片段染色體的斷片未與斷裂端連接結(jié)果：失去一個(gè)片段及所攜帶的遺傳密碼斷片與同源染色體連接結(jié)果：使部分遺傳密碼重復(fù)出現(xiàn)斷片作180°倒轉(zhuǎn)后，再接到斷端結(jié)果：所攜帶的遺傳密碼紊亂兩條非同源染色體同時(shí)斷裂，兩個(gè)斷片交換位置后相接結(jié)果：所攜帶的遺傳密碼紊亂二、染色體畸變其次節(jié)突變作用的分子機(jī)理一、干脆作用于DNA1.堿基類似物取代如：5-溴脫氧尿嘧啶核苷與胸腺嘧啶（T）相像2.烷化劑的影響一般認(rèn)為，鳥嘌呤的N-7位置最易接受烷化劑賜予的烷化基團(tuán)，當(dāng)N-7位受到烷化后，分子的內(nèi)部電子和質(zhì)子位置重新排列，鳥嘌呤由酮式異構(gòu)體變?yōu)橄┐际疆悩?gòu)體，引起堿基錯(cuò)誤配對(duì)，最終產(chǎn)生轉(zhuǎn)換型堿基置換二、不以DNA為靶的間接誘變凡干擾有絲分裂的物質(zhì)，不管是抑制紡錘體的功能，或擾亂染色體分別，稱之為干擾劑1.秋水仙效應(yīng)有絲分裂（細(xì)胞分裂完全抑制）秋水仙堿長(zhǎng)春新堿2對(duì)酶促過程的作用對(duì)DNA合成和復(fù)制有關(guān)的酶系統(tǒng)作用也可間接影響遺傳物質(zhì)第3節(jié)藥物致遺傳損傷的影響因素及后果

對(duì)人類基因庫(kù)的影響人類基因庫(kù)是指人群生殖細(xì)胞所具有的能傳給下一代的全部基因總和。基因組是指單一個(gè)體所具有全部基因在人群中每個(gè)個(gè)體新攜帶的有害基因的平均水平叫做人群的遺傳負(fù)荷（Gennticload）或突變負(fù)荷（mutationload)體細(xì)胞突變的后果體細(xì)胞突變的后果中令人最關(guān)切的是致癌問題其次是致畸體細(xì)胞的突變可能與動(dòng)脈硬化有關(guān)體細(xì)胞突變是老化的起因突變后果生殖細(xì)胞突變的后果致死性的非致死性的-----遺傳?。@性或隱性）在遺傳疾病增多的同時(shí)，突變的基因（及染色體）損傷將造成下一代的基因庫(kù)的遺傳負(fù)荷可遺傳的突變都是壞事？突變后果符合下列狀況者應(yīng)優(yōu)先考慮檢測(cè)已知的或可疑的誘變劑有關(guān)的化合物在動(dòng)物試驗(yàn)中表現(xiàn)出某些毒性反應(yīng)的化合物臨床療程長(zhǎng)，尤其是用于兒童和青年人的藥物在大部分人群中運(yùn)用的藥物一般用于預(yù)防的藥物普遍濫用的藥物以高濃度與精子接觸起作用的藥物第4節(jié)

藥物遺傳毒性評(píng)價(jià)

1鼠傷寒沙門氏桿菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)2大腸桿菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)

3體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)4微核試驗(yàn)5哺乳動(dòng)物體內(nèi)骨髓細(xì)胞遺傳試驗(yàn)6哺乳動(dòng)物體外細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)7果蠅隱性伴性致死試驗(yàn)8嚙齒動(dòng)物顯性致死試驗(yàn)第4節(jié)藥物遺傳毒性評(píng)價(jià)國(guó)際經(jīng)濟(jì)合作發(fā)展組織（OECD）舉薦方法國(guó)際經(jīng)濟(jì)合作和發(fā)展組織（OECD）鼠傷寒沙門氏桿菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)大腸桿菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)微核試驗(yàn)哺乳動(dòng)物體內(nèi)骨髓細(xì)胞遺傳試驗(yàn)哺乳動(dòng)物體外細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)果蠅隱性伴性致死試驗(yàn)嚙齒動(dòng)物顯性致死試驗(yàn)測(cè)定基因點(diǎn)突變?nèi)旧w畸變?nèi)旧w畸變生殖細(xì)胞染色體畸變一些國(guó)家新藥遺傳毒性試驗(yàn)的項(xiàng)目一、鼠傷寒沙門菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Ames試驗(yàn)）1.[原理]組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌在缺乏組氨酸的培育基上不能生長(zhǎng)，但在加有致突變?cè)呐嘤吓嘤?，則可使突變型產(chǎn)生回復(fù)突變成為野生型，即復(fù)原合成組氨酸的實(shí)力，于是就能在缺乏組氨酸的培育基上生長(zhǎng)成為菌落，通過計(jì)數(shù)菌落出現(xiàn)的數(shù)目估計(jì)藥物誘變性的強(qiáng)弱。同時(shí)在檢測(cè)系統(tǒng)中還包括大鼠肝微粒體酶（S9）體外代謝活化系統(tǒng)，使藥物在體外受到與體內(nèi)類似的氧化活化作用，因此可測(cè)出間接誘變?cè)?.[試驗(yàn)菌株]一、Ames試驗(yàn)各種鼠傷寒沙門氏菌株對(duì)不同的致突變物敏感性不同TA100和TA98可舉薦用于大多數(shù)致突變物和致癌物的檢測(cè)。我國(guó)《新藥審批方法》中舉薦運(yùn)用TA97、TA98、TA100和TA102四種標(biāo)準(zhǔn)菌株。一、Ames試驗(yàn)試驗(yàn)前必需進(jìn)行菌株的基因型鑒定、自發(fā)回變數(shù)鑒定及對(duì)鑒別性致突變物的反應(yīng)鑒定，合格后才能用于致突變?cè)囼?yàn)一、Ames試驗(yàn)[菌株鑒定]基因型鑒定

A.

組氨酸需求試驗(yàn)B.深粗糙型(rfa)鑒定C.urvB缺失的鑒定D.R因子的鑒定(抗生素抗性試驗(yàn))自發(fā)回變數(shù)測(cè)定對(duì)鑒別性致突變物的反應(yīng)一、Ames試驗(yàn)（1）基因型鑒定①組氨酸養(yǎng)分缺陷型鑒定（組氨酸需求試驗(yàn)）組氨酸養(yǎng)分缺陷型菌株只能在補(bǔ)充有組氨酸的培育皿上生長(zhǎng)②深粗糙型（rfa）鑒定（結(jié)晶紫抑菌試驗(yàn)）深粗糙型突變細(xì)菌，缺乏脂多糖屏障，一些大分子能進(jìn)入菌體菌株鑒定

一、Ames試驗(yàn)③uvrB缺失的鑒定（紫外線敏感試驗(yàn)）uvrB缺失，即切除修復(fù)系統(tǒng)缺失④R因子的鑒定：帶有R因子的菌株具有抗氨芐青霉素的特性菌株鑒定一、Ames試驗(yàn)（2）自發(fā)回變數(shù)測(cè)定受試菌株在保存或培育過程中，能產(chǎn)生自發(fā)回變（3）對(duì)鑒別性致突變物的反應(yīng)經(jīng)過體外代謝活化系統(tǒng)后的自發(fā)回變數(shù)，要比不經(jīng)體外代謝活化系統(tǒng)的自發(fā)回變數(shù)略高。

菌株鑒定一、Ames試驗(yàn)確定藥物最高劑量的標(biāo)準(zhǔn)是藥物對(duì)細(xì)菌的毒性和溶解度。西藥最大劑量可達(dá)5mg/皿，中藥可超過5mg/皿最低劑量0.2μg/皿.至少5個(gè)不同劑量每劑量間隔不差過5倍每個(gè)劑量應(yīng)做3個(gè)皿可用水、二甲基亞砜(DMSO)或乙醇做溶劑一、Ames試驗(yàn)3.[試驗(yàn)設(shè)計(jì)]DMSO≤0.4ml；乙醇≤0.1ml比照組陰性比照組陽(yáng)性比照組對(duì)需運(yùn)用間接誘變物作比照時(shí)，應(yīng)留意平行加S9與不加S9的比照一、Ames試驗(yàn)應(yīng)用誘導(dǎo)劑處理后的S9進(jìn)行體外代謝活化試驗(yàn)，即在加S9和不加S9混合物平行條件下測(cè)試。為何要制備S9？為何要誘導(dǎo)制備S9？代謝活化一、Ames試驗(yàn)S9代謝活化系統(tǒng)：經(jīng)誘導(dǎo)的大鼠肝臟勻漿，離心后所上清即為S9上清液，再向其中加入一些協(xié)助因子，如輔酶II（NADP）、6-磷酸葡萄糖、K+/Mg2+等，組成混合液，從而構(gòu)成還原型輔酶II再生系統(tǒng)。肝S9的成分主要是混合功能氧化酶，大多數(shù)化合物在體內(nèi)經(jīng)過其代謝。一、Ames試驗(yàn)(1)摻入法：(2)點(diǎn)試法：5.[結(jié)果評(píng)價(jià)]報(bào)告的試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)是2次獨(dú)立試驗(yàn)的重復(fù)結(jié)果。推斷是否是致突變物？4.[方法]一、Ames試驗(yàn)（1）摻入法：Rt/Rc=誘發(fā)回變菌落數(shù)/自發(fā)回變菌落數(shù)>2為陽(yáng)性(2)點(diǎn)試法：凡在濾紙四周長(zhǎng)出一圈密集的回變菌落，該藥物即為致突變物質(zhì)。如在平皿上出現(xiàn)少數(shù)散在的自發(fā)菌落，則為陰性一、Ames試驗(yàn)二、體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)中國(guó)倉(cāng)鼠肺（CHL）細(xì)胞（舉薦）、卵巢（CHO）細(xì)胞[原理]具有遺傳毒性的物質(zhì)作用于靶細(xì)胞引起較大范圍的DNA損傷，可出現(xiàn)染色體水平變更。制備中期分裂相染色體標(biāo)本，在光鏡下可干脆視察染色體數(shù)目和形態(tài)的變更。通過檢測(cè)受試物誘發(fā)體外培育的哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變實(shí)力，從而評(píng)價(jià)受試物的遺傳毒性及其強(qiáng)度[試驗(yàn)設(shè)計(jì)]1.試驗(yàn)至少設(shè)4個(gè)劑量組2.最高劑量組的細(xì)胞存活率為10%-20%3.無毒性受試物最高劑量組不超過10mmol/L或5mg/ml4.應(yīng)設(shè)空白比照、陽(yáng)性比照和S9比照

用細(xì)胞遺傳學(xué)方法檢測(cè)受試物是否影響DNA結(jié)構(gòu)或變更遺傳信息的試驗(yàn)過程，從而判定受試物的遺傳毒性體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)[方法]1.在培育72小時(shí)的細(xì)胞中一次加入確定濃度的受試物、S9混合液（不加S9混合液時(shí)，需用培育液不足）及確定量不含血清的培育液，混勻后接著培育24h收獲細(xì)胞2.收獲細(xì)胞前加入秋水仙堿作用4小時(shí)3.用胰蛋白酶溶液消化并收集細(xì)胞，加入KCL溶液低滲處理10min4.離心后，用甲醇/冰醋酸液固定2次5.常規(guī)底片，染色，清洗，晾干6.每組選100個(gè)染色體分散良好的中期分裂相細(xì)胞進(jìn)行染色體畸變分析哺乳動(dòng)物胞染色體畸變?cè)囼?yàn)[結(jié)果及判定]鏡檢：每種濃度至少視察100個(gè)中期分裂相細(xì)胞和染色體結(jié)構(gòu)，計(jì)算結(jié)構(gòu)突變及多倍體出現(xiàn)率。陽(yáng)性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：1染色體畸變數(shù)增加與藥物劑量有關(guān)，單劑量組按下表判定2某一測(cè)試點(diǎn)呈現(xiàn)可重復(fù)的并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加三、微核試驗(yàn)[原理]骨髓細(xì)胞經(jīng)致突變物作用，其染色體可發(fā)生畸變以致斷裂。其斷裂的碎片在分裂間期留在子代細(xì)胞內(nèi)形成規(guī)則的一個(gè)或幾個(gè)圓形或橢圓形結(jié)構(gòu)的小塊物質(zhì)，由于它比一般細(xì)胞核小，故稱之為微核（micronucleus）。視察骨髓細(xì)胞中的微核率，有助于檢驗(yàn)藥物是否具有致突變作用。雖然骨髓和外周血各種有核細(xì)胞中均可見到微核，但只有在無核的紅細(xì)胞中才易辯認(rèn)。在骨髓中無核紅細(xì)胞有嗜多染紅細(xì)胞（晚幼紅細(xì)胞）和成熟紅細(xì)胞兩種，正常狀況下，嗜多染紅細(xì)胞占多數(shù)。由于毒性物質(zhì)影響了骨髓紅細(xì)胞尤其是嗜多染紅細(xì)胞，使二者比例失衡，故在骨髓涂片中一般均在嗜多染紅細(xì)胞中進(jìn)行視察。微核試驗(yàn)[動(dòng)物]NIH小鼠，6只/組（雄性）或10只/組（雌雄各半），。[給藥劑量及途徑]高、中、低三個(gè)劑量；高劑量以LD50/2為基準(zhǔn)；低劑量應(yīng)結(jié)合藥效學(xué)及臨床用量；一般單次給藥。[比照]陰性（溶媒）比照；陽(yáng)性（環(huán)磷酰胺）。環(huán)磷酰胺不同途徑給藥對(duì)小鼠微核出現(xiàn)率的影響微核試驗(yàn)[試驗(yàn)設(shè)計(jì)]1.NIH小鼠，6只/組（雄性）或10只/組（雌雄各半）。2.動(dòng)物體重差異應(yīng)在平均體重的20%之內(nèi)。3.至少三個(gè)劑量組；高劑量以LD50/2為基準(zhǔn)；低劑量應(yīng)結(jié)合藥效學(xué)及臨床用量。4.設(shè)陽(yáng)性比照組（環(huán)磷酰胺）和陰性比照組（溶劑）5.兩次染毒或多次染毒環(huán)磷酰胺不同途徑給藥對(duì)小鼠微核出現(xiàn)率的影響[方法]