臨床分子診斷學(xué)課件：地中海貧血

-地中海貧血-地中海貧血是一種由于-珠蛋白基因突變導(dǎo)致肽鏈合成減少或缺乏而產(chǎn)生的單基因遺傳血液病，多由-珠蛋白基因點(diǎn)突變所致。在中國人群中常見的突變位點(diǎn)有CD41-42M，-28M，IVS-II-654M，CD71-72M等檢測原理1、核酸標(biāo)記：設(shè)計特異的PCR引物且其5‘端用生物素進(jìn)行標(biāo)記，擴(kuò)增獲得一定長度的DNA片段，該片段包含了所要檢測的各個位點(diǎn)。2、雜交：反向點(diǎn)雜交（RBD）根據(jù)檢測位點(diǎn)堿基的差異，設(shè)計特異性識別某種基因型的寡核苷酸探針組合（正常探針和突變探針），按預(yù)先設(shè)定的排列方式分別固定在尼龍膜的特定位置上，制成檢測膜條。用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與探針按照堿基互補(bǔ)配對的原則，進(jìn)行分子雜交反應(yīng)。

突變類型41-42N654N－28N71-72N17NβEN31N27/28M41-42M654M－28M71-72M17MβEM31MIVS1-1M43M－32M－29M－30M14-15MCAPIntMIVS1-5M3、雜交信號的檢測：

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與探針特異結(jié)合，因在產(chǎn)物末端標(biāo)記生物素，通過抗生物素辣根過氧化物酶（POD）催化底物（TMB和過氧化氫）顯藍(lán)色，觀察檢測膜條上各位點(diǎn)信號的有無（信號為藍(lán)色斑點(diǎn)），判斷該探針是否與PCR產(chǎn)物雜交，從而確定待測樣品的基因型。檢測原理（PCR與反向點(diǎn)雜交）反向點(diǎn)雜交技術(shù)膜條顯色原理生物素鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物TMBH2O2固定在膜上的探針β-地中海貧血基因診斷操作流程

變性及雜交

取15mL塑料離心管，放入膜條，加入A液5-6mL及PCR產(chǎn)物。將塑料管放入沸水中加熱10分鐘，取出擰緊蓋子，放入43℃雜交箱雜交2-4小時。洗膜取出膜條，移至裝有預(yù)熱B液的50mL管中，于43℃輕搖洗滌15分鐘一管同時洗3張膜。顯色1）POD溶液（20mlA液加10ulPOD）孵育30分鐘2）洗滌：用A液室溫洗兩次，每次5分鐘。3）用C液室溫洗膜1-2分鐘4）顯色將膜條浸泡于顯色液（19mlC液加入1mlTMB和2ul過氧化氫）中避光顯色10-15分鐘即可見斑點(diǎn)顯現(xiàn)。注意事項(xiàng)1、若整張膜條都沒有藍(lán)色斑點(diǎn)，則提示實(shí)驗(yàn)失敗，應(yīng)重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若一張膜條上有三個或以上突變位點(diǎn)有信號，則該膜條很可能是發(fā)生污染或有非特異性雜交，應(yīng)排查具體原因后重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2、雜交全過程要避免直接用手接觸膜條，可用鑷子夾取膜條邊角操作，或戴手套操作。3、顯色液需現(xiàn)配現(xiàn)用，配制是應(yīng)按順序加入

C液、TMB和過氧化氫，顯示過程應(yīng)避光。β-地中海貧血基因診斷結(jié)果判讀41-42N654N－28N71-72N17NβEN31N27/28M41-42M654M－28M71-72M17MβEM31MIVS1-1M43M－32M－29M－30M14-15MCAPIntMIVS1-5MN/N結(jié)果判讀654M/71-72M17M/NβEM/βEM41-42M/N結(jié)果判讀654M/N43M/N-28M/N結(jié)果判讀4