發(fā)酵工業(yè)制藥part

發(fā)酵工業(yè)制藥part第1頁(yè)/共34頁(yè)四、新型生物藥物的篩選一、常規(guī)篩選技術(shù)瓊脂擴(kuò)散法（又稱杯碟法）：在接有試驗(yàn)菌的瓊脂平板上放上玻璃或不銹鋼的無(wú)底小杯（常稱牛津杯），向杯內(nèi)滴入待檢的接抗菌發(fā)酵液，保溫培養(yǎng)，抗生素由小杯滲透到周?chē)沫傊校种萍?xì)菌生長(zhǎng)，因此在小杯周?chē)纬梢粋€(gè)透明圈。圈的直徑?jīng)Q定于抗生素的濃度。第2頁(yè)/共34頁(yè)四、新型生物藥物的篩選一、常規(guī)篩選技術(shù)此法常用來(lái)測(cè)定抗生素的效價(jià)，即是用抗菌效力表示的抗生素有效含量。第3頁(yè)/共34頁(yè)四、新型生物藥物的篩選一、常規(guī)篩選技術(shù)測(cè)定方法：將制備好的培養(yǎng)基傾注20ml于雙碟中（直徑90mm、高15mm），水平放置使其凝固，作為底層。然后將冷卻至約50℃的培養(yǎng)基與適量質(zhì)控菌株的菌懸液混合，迅速搖勻，傾注4ml覆蓋底層培養(yǎng)基，使其分布均勻，作為菌層，放置水平位置充分凝固后，在菌層培養(yǎng)基上等距離放置4~6個(gè)牛津杯，加入制備好的抗生素溶液，培養(yǎng)后觀察結(jié)果，移去牛津杯測(cè)量抑菌圈直徑。第4頁(yè)/共34頁(yè)四、新型生物藥物的篩選一、常規(guī)篩選技術(shù)效價(jià)計(jì)算：按照上述計(jì)算實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定得到的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液和樣品溶液所致的抑菌圈直徑的平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再?gòu)臉?biāo)準(zhǔn)曲線查得樣品稀釋液的效價(jià)。第5頁(yè)/共34頁(yè)四、新型生物藥物的篩選二、定靶篩選從臨床有效的抗生素的作用機(jī)理和細(xì)菌的耐藥機(jī)理來(lái)設(shè)計(jì)篩選模型，有目的地篩選具有某種作用機(jī)理的抗生素，試圖獲得抗菌作用強(qiáng)、對(duì)耐藥菌有效、毒性小的新抗生素。第6頁(yè)/共34頁(yè)四、新型生物藥物的篩選二、定靶篩選1、以作用機(jī)理為依據(jù)的篩選方法（各類抗生素的受體）抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成蛋白質(zhì)合成抑制劑細(xì)菌DNA回旋酶抑制劑改變細(xì)胞膜通透性作用于細(xì)胞外膜的藥物篩選作用于細(xì)菌外排泵的藥物的篩選氨基糖類抗生素的篩選第7頁(yè)/共34頁(yè)四、新型生物藥物的篩選二、定靶篩選1、以作用機(jī)理為依據(jù)的篩選方法（各類抗生素的受體）抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成的抗生素：青霉素、頭孢菌素蛋白質(zhì)合成抑制劑：四環(huán)素改變細(xì)胞膜功能：多烯類抗生素抑制核酸合成的抗生素：絲裂霉素C抑制生物能作用的抗生素：抗霉素第8頁(yè)/共34頁(yè)四、新型生物藥物的篩選二、定靶篩選2、抗生素的耐藥機(jī)制細(xì)菌的耐藥性又稱抗藥性，一般是指細(xì)菌與藥物多次接觸后，對(duì)藥物的敏感性下降甚至消失，致使藥物對(duì)耐藥菌的療效降低或無(wú)效。第9頁(yè)/共34頁(yè)四、新型生物藥物的篩選二、定靶篩選2、抗生素的耐藥機(jī)制耐藥性產(chǎn)生的機(jī)理主要有以下幾種:產(chǎn)生降解抗生素（如β-內(nèi)酰胺類）的酶或鈍化酶改變抗生素的結(jié)構(gòu)（如氨基糖苷類）?？股刈饔冒悬c(diǎn)由于發(fā)生突變或被細(xì)菌的某些酶修飾而使抗菌藥物無(wú)法發(fā)揮作用，以及抗生素使用的靶酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變使之與抗生素的親和力下降。第10頁(yè)/共34頁(yè)四、新型生物藥物的篩選二、定靶篩選2、抗生素的耐藥機(jī)制細(xì)菌具有一種信賴于能量的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，即它能夠把進(jìn)入胞內(nèi)的藥物泵入胞外。降低細(xì)胞壁的通透性，使抗生素不能進(jìn)入細(xì)菌。從下列方式獲得耐藥基因：從祖先細(xì)菌獲得；自發(fā)獲得或使原存在的耐藥基因表達(dá)加強(qiáng)；從其他細(xì)菌經(jīng)接合轉(zhuǎn)移獲得耐藥基因；從病毒的其它細(xì)菌的質(zhì)或染色體獲得；從環(huán)境中經(jīng)質(zhì)?；蛉旧w介紹獲得耐藥基因。第11頁(yè)/共34頁(yè)五、新型生物的生物合成一、微生物的代謝微生物在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的不同作用，可將代謝分為初級(jí)代謝和次級(jí)代謝。第12頁(yè)/共34頁(yè)五、新型生物的生物合成一、微生物的代謝初級(jí)代謝是指能使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)變成機(jī)體的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和對(duì)機(jī)體有生理活性作用的物質(zhì)，或是為機(jī)體生長(zhǎng)提供能量的一類代謝。初級(jí)代謝的產(chǎn)物稱為初級(jí)代謝產(chǎn)物。這類物質(zhì)包括供機(jī)體進(jìn)行生物合成的各種小分子前體、單體和多聚體物質(zhì)，以及在能量代謝中起調(diào)節(jié)作用的各種物質(zhì)，如多糖、蛋白質(zhì)、脂肪和核酸等。第13頁(yè)/共34頁(yè)五、新型生物的生物合成一、微生物的代謝次級(jí)代謝是指微生物生長(zhǎng)到一定階段才產(chǎn)生化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、對(duì)該生物無(wú)明顯生理功能，或并非是微生物生長(zhǎng)和繁殖所必需的物質(zhì)，如抗生素、毒素、激素、色素等。不同種類的微生物所產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物不相同，它們可能積累在細(xì)胞內(nèi)，也可能排到外環(huán)境中。第14頁(yè)/共34頁(yè)五、新型生物的生物合成二、微生物藥物合成的基本途徑次級(jí)代謝產(chǎn)物中的構(gòu)建單位稱之為生源。一般次級(jí)代謝產(chǎn)物的生源都是直接或間接地來(lái)自于微生物代謝過(guò)程中產(chǎn)物的一些中間產(chǎn)物或是初級(jí)代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)有的直接作為次級(jí)代謝產(chǎn)物的前提，有的經(jīng)過(guò)修飾后作為特殊前體用于合成次級(jí)代謝產(chǎn)物。雖然次級(jí)代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)類型繁多，而且結(jié)構(gòu)也比較復(fù)雜，但是它們的構(gòu)建單位只有幾種。第15頁(yè)/共34頁(yè)五、新型生物的生物合成二、微生物藥物合成的基本途徑1、生源聚酮體即含有多個(gè)羰基的聚合物，和次級(jí)代謝產(chǎn)物脂肪酸合成的前提相似。許多次級(jí)代謝產(chǎn)物的前體是由聚酮體構(gòu)成。聚酮體的形成以起始單位為基礎(chǔ)，與鏈的延伸單位不斷縮合和脫羧，最終形成β-多酮次甲基鏈，合成的β-多酮次甲基鏈經(jīng)過(guò)不完全的還原或者在不同位點(diǎn)還原，可以形成種類極多的聚酮體。第16頁(yè)/共34頁(yè)五、新型生物的生物合成二、微生物藥物合成的基本途徑糖類次級(jí)代謝產(chǎn)物中的糖類主要有氨基酸、糖胺、環(huán)多醇和氨基環(huán)多醇以及其他糖類等。第17頁(yè)/共34頁(yè)五、新型生物的生物合成二、微生物藥物合成的基本途徑不常見(jiàn)的氨基酸正常氨基酸是指微生物能夠利用并用于蛋白質(zhì)合成的α-L-氨基酸，而在次級(jí)代謝產(chǎn)物中存在200多種非蛋白質(zhì)氨基酸，如D-氨基酸，N-甲基氨基酸、β-氨基酸以及稀有的二氨基酸等，稱為不常見(jiàn)的氨基酸。第18頁(yè)/共34頁(yè)五、新型生物的生物合成二、微生物藥物合成的基本途徑非核酸的嘌呤堿和嘧啶堿非核酸的嘌呤堿和嘧啶堿不同于正常核酸上的堿基，而是以正常堿基經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾形成的。與菌體內(nèi)核苷酸的合成途徑不同，可以直接利用培養(yǎng)基中的各種嘌呤堿基核苷酸第19頁(yè)/共34頁(yè)五、新型生物的生物合成二、微生物藥物合成的基本途徑吩惡嗪酮吩惡嗪酮是一些次級(jí)代謝產(chǎn)物的一個(gè)基本結(jié)構(gòu)，其生物合成前提是色氨酸和一些代謝物。它們先形成4-甲基-3-羥基-鄰氨基苯酸在吩惡嗪酮合成酶的催化下被氧化脫水形成吩惡嗪酮。第20頁(yè)/共34頁(yè)五、新型生物的生物合成二、微生物藥物合成的基本途徑莽草酸莽草酸是許多芳香氨基酸化合物，包括芳香氨基酸、肉桂酸和某些多酚類化合物的前提。莽草酸源自葡萄糖，是合成許多抗生素的前提。第21頁(yè)/共34頁(yè)五、新型生物的生物合成二、微生物藥物合成的基本途徑甲羥戊酸在許多次級(jí)代謝產(chǎn)物中，甲羥戊酸是其重要的構(gòu)建單位。如甲羥戊酸被磷酸化后形成甲羥戊酸-5-焦磷酸，繼續(xù)經(jīng)脫羧和脫水作用就可以形成活化形式的異戊二烯焦磷酸，這種活化的五碳單位幾乎可以和任何數(shù)量的單元結(jié)合，形成各種各樣的異戊二烯類或萜類次級(jí)代謝產(chǎn)物。第22頁(yè)/共34頁(yè)五、新型生物的生物合成二、微生物藥物合成的基本途徑2、次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成的基本途徑前體聚合：次級(jí)代謝產(chǎn)物的生源合成后，可通過(guò)綜合反應(yīng)形成聚酮體、寡肽、聚乙烯等。修飾：次級(jí)代謝產(chǎn)物和各種單體聚合在一起，建立起基本骨架后，其中的某些基團(tuán)往往還必須通過(guò)酶促反應(yīng)進(jìn)行修飾，才會(huì)形成具有生理活性的物質(zhì)、這些酶促反應(yīng)包括糖基化、?；⒘u基化和氨基化反應(yīng)以及氧化還原等。第23頁(yè)/共34頁(yè)五、新型生物的生物合成二、微生物藥物合成的基本途徑2、次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成的基本途徑不同組分的裝配：次級(jí)代謝產(chǎn)物的必需的幾個(gè)部分合成后，需要按照一定的順序在特異酶的催化下組裝在一起才會(huì)形成具有生理活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物。例如，新生霉素是由新生酶糖部分、香豆素部分、異戊烯部分和對(duì)羥基苯甲酸部分組合而成。其中新生霉素部分來(lái)自于葡萄糖，香豆素部分是由酪氨酸衍生，異戊烯部分來(lái)自于甲羥戊酸，而對(duì)羥基苯甲酸部分是由莽甲酸衍生而來(lái)，幾個(gè)組分形成后裝配在一起得到具有生理活性的新生霉素。第24頁(yè)/共34頁(yè)五、新型生物的生物合成二、微生物藥物合成的基本途徑3、次級(jí)代謝產(chǎn)物的主要代謝調(diào)節(jié)機(jī)制A.初級(jí)代謝對(duì)次級(jí)代謝的調(diào)節(jié)當(dāng)初級(jí)代謝和次級(jí)代謝具有共同的合成途徑時(shí)，初級(jí)代謝的終產(chǎn)物過(guò)量，往往會(huì)抑制次級(jí)代謝的合成。這主要是因?yàn)槌跫?jí)代謝終產(chǎn)物抑制了在次級(jí)代謝產(chǎn)物合成中重要的分叉中間體的合成。第25頁(yè)/共34頁(yè)五、新型生物的生物合成二、微生物藥物合成的基本途徑3、次級(jí)代謝產(chǎn)物的主要代謝調(diào)節(jié)機(jī)制B.碳代謝物的調(diào)節(jié)一般情況下，凡能被微生物快速利用、促進(jìn)產(chǎn)生菌生長(zhǎng)速度的碳源，對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成都表現(xiàn)出抑制作用。第26頁(yè)/共34頁(yè)五、新型生物的生物合成二、微生物藥物合成的基本途徑3、次級(jí)代謝產(chǎn)物的主要代謝調(diào)節(jié)機(jī)制C.氮代謝物的調(diào)節(jié)在不同氮源的研究中發(fā)現(xiàn)，以蛋白質(zhì)作氮源，可以促進(jìn)次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成，而以無(wú)機(jī)氮或簡(jiǎn)單有機(jī)氮等容易利用的氮作為氮源（胺鹽、硝酸鹽、某些氨基酸）能促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)，但卻抑制次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成。第27頁(yè)/共34頁(yè)五、新型生物的生物合成二、微生物藥物合成的基本途徑3、次級(jí)代謝產(chǎn)物的主要代謝調(diào)節(jié)機(jī)制D.磷酸鹽的調(diào)節(jié)過(guò)量的磷酸鹽也像葡萄糖一樣抑制次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成，這種抑制作用稱為磷酸鹽調(diào)節(jié)。磷酸鹽對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的影響表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：（1）促進(jìn)初級(jí)代謝，抑制次級(jí)代謝；（2）抑制次級(jí)代謝產(chǎn)物前體的形成；（3）阻遏次級(jí)代謝產(chǎn)物合成中某些關(guān)鍵酶的合成；第28頁(yè)/共34頁(yè)五、新型生物的生物合成二、微生物藥物合成的基本途徑3、次級(jí)代謝產(chǎn)物的主要代謝調(diào)節(jié)機(jī)制D.磷酸鹽的調(diào)節(jié)（4）抑制次級(jí)代謝產(chǎn)物合成中某些關(guān)鍵酶的活性；（5）增加菌體能荷狀態(tài)以及促進(jìn)初級(jí)代謝。第29頁(yè)/共34頁(yè)五、新型生物的生物合成二、微生物藥物合成的基本途徑3、次級(jí)代謝產(chǎn)物的主要代謝調(diào)節(jié)機(jī)制E.ATP調(diào)節(jié)磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶羧基轉(zhuǎn)移酶草酰乙酸丙酮酸乙酰CoA乙酰CoA羧化酶丙二酰CoAATP第30頁(yè)/共34頁(yè)五、新型生物的生物合成二、微生物藥物合成的基本途徑3、次級(jí)代謝產(chǎn)物的主要代謝調(diào)節(jié)機(jī)制F.誘導(dǎo)調(diào)節(jié)和產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)：在次級(jí)代謝過(guò)程中，有些酶為誘導(dǎo)酶，需要有誘導(dǎo)物才能形成。產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)：在次級(jí)代謝誒產(chǎn)物合成中，產(chǎn)物的過(guò)量積累，也存在著像初級(jí)代謝中相似的反饋調(diào)節(jié)現(xiàn)象。第31頁(yè)/共34頁(yè)五、新型生物的生物合成二、微生物藥物合成的基本途徑3、次級(jí)代謝產(chǎn)物的主要代謝調(diào)節(jié)機(jī)制G.細(xì)胞膜透性調(diào)節(jié)細(xì)胞膜透性影