發(fā)酵工業(yè)無菌技術(shù)

發(fā)酵工業(yè)無菌技術(shù)第1頁/共67頁4.1滅菌與消毒的區(qū)別滅菌：用物理或化學(xué)方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物，包括營養(yǎng)細胞、細菌芽孢和孢子消毒：用物理或化學(xué)方法殺死物料、容器、器皿內(nèi)外的病源微生物。第2頁/共67頁培養(yǎng)基滅菌的目的

1，在發(fā)酵過程中夾雜其它雜菌造成的后果：生產(chǎn)菌和雜菌同時生長，生產(chǎn)菌喪失生產(chǎn)能力；在連續(xù)發(fā)酵過程中，雜菌的生長速度有時會比生產(chǎn)菌生長得更快，結(jié)果使發(fā)酵罐中以雜菌為主；雜菌及其產(chǎn)生的物質(zhì)，使提取精制發(fā)生困難雜菌會降解目的產(chǎn)物；雜菌會污染最終產(chǎn)品，雜菌會污染最終產(chǎn)品；發(fā)酵時如污染噬菌體，可使生產(chǎn)菌發(fā)生溶菌現(xiàn)象。第3頁/共67頁2，工業(yè)上具體措施包括：（1）使用的培養(yǎng)基和設(shè)備須經(jīng)滅菌；（2）好氧培養(yǎng)中使用的空氣須除菌處理；（3）設(shè)備應(yīng)嚴密，發(fā)酵罐維持正壓環(huán)境；（4）培養(yǎng)過程中加入的物料應(yīng)經(jīng)過滅菌；（5）使用無污染的純粹種子。3，培養(yǎng)基滅菌的目的殺滅培養(yǎng)基中的微生物，為后續(xù)發(fā)酵過程創(chuàng)造無菌的條件。第4頁/共67頁4，培養(yǎng)基滅菌的要求（1）達到要求的無菌程度（10-3）（2）盡量減少營養(yǎng)成分的破壞，在滅菌過程中，培養(yǎng)基組分的破壞，是由兩個基本類型的反應(yīng)引起的：培養(yǎng)基中不同營養(yǎng)成分間的相互作用；對熱不穩(wěn)定的組分如氨基酸和維生素等的分解。第5頁/共67頁4.2發(fā)酵工業(yè)污染的防治策略4.2.1污染的危害1.使生物反應(yīng)的基質(zhì)或產(chǎn)物，因雜菌的消耗而損失，造成生產(chǎn)能力的下降。2.雜菌也會產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，這就使產(chǎn)物的提取更加困難，造成得率降低，產(chǎn)品質(zhì)量下降。3.有些雜菌會分解產(chǎn)物，使生產(chǎn)失敗。4.雜菌大量繁殖后，會改變反應(yīng)液的pH值，使反應(yīng)異常。5.如果發(fā)生噬菌體污染，生產(chǎn)菌細胞將被裂解，使生產(chǎn)失敗。

第6頁/共67頁4.2.2雜菌污染的防治雜菌的檢查與類型判斷顯微鏡檢查法平板劃線培養(yǎng)肉湯培養(yǎng)發(fā)酵過程的異常觀察法：溶解氧水平異常變化、通過傳感器或取樣分析觀察PH的變化、尾氣中CO2異常變化污染的原因分析種子帶菌、空氣帶菌、設(shè)備滲漏、滅菌不徹底、操作失誤和技術(shù)管理不善分析污染雜菌的種類分析污染雜菌的時間分析污染雜菌的程度第7頁/共67頁雜菌污染的途徑及其預(yù)防種子帶菌及其預(yù)防：1.培養(yǎng)基及其器具徹底滅菌2.避免菌種在移接中污染3.避免菌種在培養(yǎng)和保藏中污染過濾空氣帶菌及其防治設(shè)備的滲漏或死角染菌及其防治培養(yǎng)基滅菌不徹底導(dǎo)致染菌及其防治操作不當(dāng)造成染菌噬菌體染菌及其防治第8頁/共67頁4.3發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)工業(yè)上具體措施包括：（1）使用的培養(yǎng)基和設(shè)備須經(jīng)滅菌；（2）好氧培養(yǎng)中使用的空氣應(yīng)經(jīng)除菌處理；（3）設(shè)備應(yīng)嚴密，發(fā)酵罐維持正壓環(huán)境；（4）培養(yǎng)過程中加入的物料應(yīng)經(jīng)過滅菌；（5）使用無污染的純粹種子。第9頁/共67頁滅菌的方法（1）化學(xué)法化學(xué)藥品滅菌法

（2）物理法干熱滅菌法濕熱滅菌法射線滅菌法過濾除菌法火焰滅菌法第10頁/共67頁4.4發(fā)酵培養(yǎng)基及設(shè)備管道滅菌4.4.1濕熱滅菌原理濕熱滅菌中的相關(guān)定義殺死微生物的極限溫度稱為致死溫度。在致死溫度下，殺死全部微生物所需的時間稱為致死時間；在致死溫度以上，溫度愈高，致死時間愈短。微生物的熱阻：是指微生物在某一特定條件（主要是溫度和加熱方式）下的致死時間。相對熱阻是指某一微生物在某條件下的致死時間與另一微生物在相同條件下的致死時間的比值。第11頁/共67頁微生物相對熱阻營養(yǎng)細胞和酵母細菌芽孢霉菌孢子病毒和噬菌體1.03×1062~101~5各種微生物對濕熱的相對熱阻濕熱滅菌的優(yōu)點蒸汽來源容易，操作費用低，本身無毒；蒸汽有強的穿透力，滅菌易于徹底；蒸汽有很大的潛熱；操作方便，易管理。第12頁/共67頁4.4.1濕熱滅菌的理論基礎(chǔ)

一，培養(yǎng)基濕熱滅菌需解決的工程問題1.將培養(yǎng)基中的雜菌總數(shù)N0

殺滅到可以接受的總數(shù)N（10－3），需要多高的溫度、多長的時間為合理。2.滅菌溫度和時間的確定取決于：（1）雜菌孢子的熱滅死動力學(xué)（2）反應(yīng)器的形式和操作方式（3）培養(yǎng)基中有效成分受熱破壞的可接受范圍二、微生物的熱死滅動力學(xué)方程第13頁/共67頁

實驗證明，微生物營養(yǎng)細胞的均相熱死滅動力學(xué)符合化學(xué)反應(yīng)的一級反應(yīng)動力學(xué)，即：N：任一時刻的活細菌濃度（個/L）t：時間（min）活菌的減少率與N的關(guān)系第14頁/共67頁

K：比熱死速率常數(shù)（min-1）取邊界條件t=0，N=N0，對（1）積分得或第15頁/共67頁lnN0/N=kt2.303logN0/N=ktt=2.303/klogN0/N對數(shù)殘存規(guī)律工廠的經(jīng)驗數(shù)據(jù)，高溫滅菌時間15－30s,維持8－25min。第16頁/共67頁培養(yǎng)基達到完全滅菌時，滅菌溫度和滅菌時間對培養(yǎng)基養(yǎng)分破壞的比較（以VitB1為準）滅菌溫度0C滅菌時間min營養(yǎng)成分破壞率（％）

10040099.3110366711515501204271300.581450.0821500.011第17頁/共67頁第18頁/共67頁4.4.2培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計一、無菌的標準根據(jù)微生物熱死滅方程，要求滅菌后達到絕對無菌是很難做到的，也是不必要的。因此在工程設(shè)計中常取N=10-3。二、分批滅菌分批滅菌的設(shè)計在發(fā)酵罐中進行實罐滅菌，是典型的分批滅菌。全過程包括升溫、保溫、降溫三個過程。第19頁/共67頁第20頁/共67頁孢子熱死亡的規(guī)律符合

積分得（8）

在分批滅菌過程中

因為升溫、冷卻階段T是時間t的函數(shù)，K不是常數(shù)，所以：

式中Kh是保溫階段的孢子比熱死亡速度常數(shù)第21頁/共67頁保證間歇滅菌成功的要素（1）內(nèi)部結(jié)構(gòu)合理(主要是無死角)，焊縫及軸封裝置可靠，蛇管無穿孔現(xiàn)象（2）壓力穩(wěn)定的蒸汽（3）合理的操作方法。發(fā)酵罐的接管圖第22頁/共67頁培養(yǎng)基間歇滅菌過程中應(yīng)注意的問題（1）溫度和壓力的關(guān)系（2）泡沫問題（3）投料過程中，麩皮和豆餅粉等固形物在罐壁上殘留的問題（4）滅菌結(jié)束后應(yīng)立即引入無菌空氣保壓三、連續(xù)滅菌的設(shè)計1，連續(xù)滅菌的流程（1）噴射加熱連續(xù)滅菌噴射加熱連續(xù)滅菌流程第23頁/共67頁典型的噴射加熱連續(xù)滅菌時的溫度和時間曲線圖（2）薄板換熱器連續(xù)滅菌薄板換熱器連續(xù)滅菌流程第24頁/共67頁薄板換熱器連續(xù)滅菌時的溫度和時間曲線圖（3）噴淋冷卻連續(xù)滅菌噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程第25頁/共67頁連消器噴射加熱器第26頁/共67頁薄板換熱器維持罐第27頁/共67頁第28頁/共67頁第29頁/共67頁四、連續(xù)滅菌與間歇滅菌的比較1，連續(xù)滅菌的優(yōu)缺點優(yōu)點–保留較多的營養(yǎng)質(zhì)量–容易放大–較易自動控制；–糖受蒸汽的影響較少；–縮短滅菌周期；–在某些情況下，可使發(fā)酵罐的腐蝕減少；–發(fā)酵罐利用率高；–蒸汽負荷均勻。缺點–設(shè)備比較復(fù)雜，投資較大。第30頁/共67頁優(yōu)點–設(shè)備投資較少–染菌的危險性較小–人工操作較方便–對培養(yǎng)基中固體物質(zhì)含量較多時更為適宜缺點–滅菌過程中蒸汽用量變化大，造成鍋爐負荷波動大，一般只限于中小型發(fā)酵裝置。2，分批滅菌的優(yōu)缺點五、影響滅菌的因素第31頁/共67頁

采用一臺連續(xù)滅菌設(shè)備，培養(yǎng)液流量為18m3/h，發(fā)酵罐裝料量為36m3，原始污染度為106個，要求滅菌度N＝10-3個罐，滅菌溫度為398k，查圖得此時得反應(yīng)速度常數(shù)＝11min-1，試求維持時間t。第32頁/共67頁解：發(fā)酵罐培養(yǎng)液原有菌數(shù)：＝36×106×103×103＝3.6

×1013(個/罐）

由公式得：

t=2.303/klgN0/N第33頁/共67頁（1）培養(yǎng)基成分對滅菌的影響油脂，糖類及一定濃度的蛋白質(zhì)可增加微生物的耐熱性，另一些物質(zhì)，如高濃度的鹽類，色素等可削弱其耐熱性。（2）培養(yǎng)基的物理狀態(tài)對滅菌的影響（3）培養(yǎng)基中微生物數(shù)量對滅菌的影響（4）培養(yǎng)基中氫離子濃度對滅菌的影響培養(yǎng)基中氫離子濃度直接影響滅菌的效果。培養(yǎng)基的酸堿度越大，所需殺滅微生物的溫度越低。第34頁/共67頁（5）微生物細胞中水分對滅菌的影響細胞含水越多，蛋白質(zhì)變性的溫度越低（6）微生物細胞菌齡對滅菌的影響老細胞水分含量低、低齡細胞水分含量高（7）空氣排除情況對滅菌的影響（8）攪拌對滅菌的影響（9）泡沫對滅菌的影響第35頁/共67頁六、發(fā)酵罐的滅菌

培養(yǎng)基的滅菌如果是采用連續(xù)滅菌法。則發(fā)酵罐應(yīng)在加入滅菌的培養(yǎng)基前先行單獨滅菌。通常是用蒸汽加熱發(fā)酵罐的夾套或蛇管并從空氣分布管中通入蒸汽，充滿整個容器后，再從排氣管中緩緩排出。容器內(nèi)的蒸汽壓力保持1公斤，20分鐘。在保溫結(jié)束后，關(guān)鍵是隨即通入無菌空氣，使容器保持正壓，防止形成真空而吸入帶菌的空氣。七、補料液的滅菌

在發(fā)酵過程中，往往要向發(fā)酵罐中補入各種不同的料液。這些料液都必需經(jīng)過滅菌。滅菌的方法則視料液的性質(zhì)、體積和補料速率而定。如果補料量較大，而具有連續(xù)性時，則采用連續(xù)滅菌較為合適。也有利用過濾法對另補料液進行除菌。補料液的分批滅菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。所有的附屬設(shè)備和管道都要經(jīng)過滅菌。第36頁/共67頁4.5空氣除菌4.5.1空氣中微生物的分布和發(fā)酵工業(yè)對空氣無菌程度的要求無菌空氣的概念

通過除菌處理使空氣中含菌量降低在一個極低的百分數(shù)，從而能控制發(fā)酵污染至極小機會。此種空氣稱為“無菌空氣”。空氣中微生物的分布一般設(shè)計時以含量為103~104個／m3進行計算。第37頁/共67頁提問引出新課請問你在實驗室已接觸過哪些“無菌空氣”的例子？第38頁/共67頁發(fā)酵對空氣無菌程度的要求酵母菌培養(yǎng)氨基酸液體曲抗生素一般按染菌機率為10-3來計算，即1000次發(fā)酵周期所用的無菌空氣只允許1~2次染菌。第39頁/共67頁4.5.2空氣除菌方法1、輻射滅菌α射線、X射線、β射線、γ射線、紫外線、超聲波2、加熱滅菌利用空壓機所產(chǎn)生的熱來進行滅菌第40頁/共67頁3、靜電除菌對1μm的微粒去除率達99％，消耗能量小，每處理1000m3的空氣每小時只耗電0.4~0.8kW。空氣的壓力損失小，一般僅(3~15)×133.3Pa。但對設(shè)備維護和安全技術(shù)措施要求較高。靜電除塵器1-鋼絲（電暈電極）；2-鋼管（沉淀電極）；3-高壓絕緣瓷瓶；4-鋼板；5-空氣出口；6-封頭；7-鋼板；8-法蘭；9-空氣出口第41頁/共67頁用靜電除菌凈化空氣有如下優(yōu)點：(1)阻力小，約1.01325×104Pa；(2)染菌率低，平均低于10~15％；(3)除水、除油的效果好；(4)耗電少。

缺點是設(shè)備龐大，需要采用高壓電技術(shù)，且一次性投資較大；對發(fā)酵工業(yè)來說，—其捕集率尚嫌不夠，需要采取其它措施。4、介質(zhì)過濾常用的過濾介質(zhì)：棉花、玻璃纖維、活性炭、超細玻璃纖維紙、石棉濾板、燒結(jié)材料、新型過濾介質(zhì)。第42頁/共67頁4.5.3空氣過濾除菌（一）、空氣過濾除菌流程第43頁/共67頁第44頁/共67頁1、高空采風(fēng)、兩次冷卻、兩次分油水、適當(dāng)加熱流程

特點：兩次冷卻、兩次分油水、適當(dāng)加熱?？諝獾谝淮卫鋮s到30～35℃，第二級冷卻至20～25℃，經(jīng)分水后加熱到30～35℃，因為溫度升高，相對濕度下降。第45頁/共67頁第46頁/共67頁

2、冷熱空氣直接混合式空氣除菌流程

特點：省去一級冷卻和分離設(shè)備及空氣再加熱設(shè)備，簡化了流程，使冷卻水用量也降低了。壓縮空氣從貯罐出來分兩路，一部分進冷卻器，經(jīng)分離器分離水、油霧后與另一部分未處理過的高溫壓縮空氣混合，使混合后的空氣溫度為30～35℃，相對濕度為50～60%。

第47頁/共67頁第48頁/共67頁其他幾種空氣除菌流程第49頁/共67頁高效前置過濾除菌流程

在壓縮機前設(shè)置一臺高效過濾器，這樣便可降低過濾器負荷（即多次過濾），達到空氣除菌的要求。

第50頁/共67頁第51頁/共67頁第