第三章基因工程設(shè)計(jì)策略及操作流程2

外源DNA

載體DNA

重組分子原核細(xì)胞真核細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)

表達(dá)連接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)電穿孔或顯微注射受體細(xì)胞3.4基因的重組與轉(zhuǎn)移當(dāng)前1頁，總共98頁。3.4.1基因的體外連接重組含目的基因的外源DNA在體外通過限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶的作用與載體連接，獲得重組DNA的過程，稱為基因的體外連接重組?；虻捏w外重組有兩種方式：插入式和置換式。當(dāng)前2頁，總共98頁?；蝮w外重組的類型當(dāng)前3頁，總共98頁。插入式是用一種限制性內(nèi)切酶消化載體，在載體上此酶只有一個識別序列，實(shí)現(xiàn)外源片段插入載體的切口；置換式可用兩種限制性內(nèi)切酶或是在載體上有兩個識別序列的一種限制性內(nèi)切酶處理載體，載體被切成大小不等的兩個片段，把外源DNA與載體大片段連接，即置換了載體中原有的小片段，形成重組DNA分子。當(dāng)前4頁，總共98頁。形成重組DNA的實(shí)質(zhì)就是催化外源DNA與載體DNA間高效地形成3′,5′-磷酸二酯鍵，連接方式有很多種，具體使用時要根據(jù)外源DNA與載體DNA末端的性質(zhì)選擇合適的方法，以保證連接效率。當(dāng)前5頁，總共98頁。DNA連接酶當(dāng)前6頁，總共98頁。（1）互補(bǔ)黏性末端的連接互補(bǔ)黏性末端的產(chǎn)生是由于外源DNA和載體DNA用同一種限制性內(nèi)切酶切割或是用兩種同尾酶切割，但用同尾酶切割后產(chǎn)生的重組DNA分子喪失了原有的兩種限制性內(nèi)切酶的識別序列。當(dāng)前7頁，總共98頁。黏性末端的連接當(dāng)前8頁，總共98頁。A兩段DNA的連接依靠粘性末端當(dāng)前9頁，總共98頁。BDNA片斷與載體的連接依靠粘性末端當(dāng)前10頁，總共98頁。當(dāng)前11頁，總共98頁。ligasenick當(dāng)前12頁，總共98頁。C載體與載體的連接當(dāng)前13頁，總共98頁。

20μL的互補(bǔ)黏性末端連接反應(yīng)體系為：

2μLT4DNA連接酶緩沖液或E.coliDNA連接酶緩沖液

5μL外源DNA片段

5μL載體DNA片段

1μLT4DNA連接酶或E.coliDNA連接酶

其它用ddH2O補(bǔ)齊

充分混勻后，16℃過夜連接連接體系當(dāng)前14頁，總共98頁。連接效率的檢測可用瓊脂糖凝膠電泳法，以載體酶切片段、外源DNA酶切片段為對照，若只出現(xiàn)兩條與對照帶相同的條帶，表明連接反應(yīng)失敗；若出現(xiàn)一系列新帶，表明發(fā)生連接。為了保證連接效率，減少連接過程中的副產(chǎn)物，連接時要注意以下幾點(diǎn)：接反應(yīng)中外源DNA片段和載體DNA片段的濃度、防止載體自身環(huán)化、產(chǎn)生兩種重組DNA分子。當(dāng)前15頁，總共98頁。載體去磷酸化當(dāng)前16頁，總共98頁。雙酶切法當(dāng)前17頁，總共98頁。5’端與3’端并列靠近的時間太短，不容易被連接酶連接。T4DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5’5’5’5’3’3’3’3’-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’3’-OH-PP-HO-5’3’（2）平末端的連接當(dāng)前18頁，總共98頁。如果把由兩種不同限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平末端DNA片段進(jìn)行連接，得到的連接產(chǎn)物就喪失了原有的識別序列。如果將由同一種限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的平末端DNA片段進(jìn)行連接，得到的連接產(chǎn)物仍保留原有的識別序列或是出現(xiàn)一個新的識別序列。當(dāng)前19頁，總共98頁。平末端片段的連接當(dāng)前20頁，總共98頁。（3）末端修飾后的連接①片段末端同聚物加尾法：一個為平末端和一個為黏性末端的DNA片段之間的連接，也可以兩個平末端DNA片段間的連接。需要末端轉(zhuǎn)移酶（terminaltransforase）催化，在酶的作用下按照5′→3′方向?qū)⑺姆N脫氧核苷酸分子的任意一種依次添加到DNA片段的3′-OH末端，形成同聚物poly(dC)或poly(dG)或poly(dT)或poly(dA)。當(dāng)前21頁，總共98頁。待連接的DNA片段末端加上長度約10-40個核苷酸的互補(bǔ)的同聚物尾巴后，在T4DNA連接酶的作用下形成重組DNA分子，重組DNA分子中有缺口的部分可待其轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞后，利用受體細(xì)胞中的DNA聚合酶和DNA連接酶將缺口填補(bǔ)起來。當(dāng)前22頁，總共98頁。片段末端同聚物加尾法能把任何片段連接起來不能把插入片段再切下來當(dāng)前23頁，總共98頁。②黏性末端修飾為平末端適用于兩個DNA片段末端為非互補(bǔ)黏性末端的情況，也可用于一個片段為平末端另一片段為黏性末端的情況。將黏性末端改為平末端需要在核酸外切酶Ⅶ（exonucleaseⅦ，ExoⅦ）的作用下，將雙鏈DNA片段的5′或3′端突出部分的單鏈斷裂，使黏性末端的DNA片段變?yōu)槠侥┒?。?dāng)前24頁，總共98頁。黏性末端修飾為平末端當(dāng)前25頁，總共98頁。（4）末端加連桿的連接連桿又叫銜接物(linker)，是指用化學(xué)法合成的由10-12個核苷酸組成，具有一個或數(shù)個限制性酶識別位點(diǎn)的寡核苷酸片段。將連桿加在待連接的DNA分子的末端，然后用在連桿中具有識別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶處理，即可得到具有互補(bǔ)黏性末端的兩種DNA片段，再在DNA連接酶作用下實(shí)現(xiàn)連接。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：當(dāng)前26頁，總共98頁。這種方法適合于具有平末端的兩種DNA片段，或是具有平末端和黏性末端的兩種DNA片段，也適用于非互補(bǔ)黏性末端的兩種DNA片段的連接。當(dāng)前27頁，總共98頁。末端加連桿當(dāng)前28頁，總共98頁。當(dāng)前29頁，總共98頁。1978年康內(nèi)爾大學(xué)的吳瑞教授發(fā)明。5‘p-GATCCCGG-OH3’

GGCC-p5’

BamHIadapter用T4DNA連接酶連到DNA分子的兩端，直接成為人工粘性末端。①adapter一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點(diǎn)序列）。②adapter的作用（5）DNA接頭(adapter)連接法當(dāng)前30頁，總共98頁。Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-

GGCC--CCGG

-GGCCCTAG-P5’

5‘p-GATCCCGG-

GGCC-CCGG

GGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OH

GGCCCTAGGGCC-P5’

接頭自我連接當(dāng)前31頁，總共98頁。當(dāng)前32頁，總共98頁。3.4.2重組分子的轉(zhuǎn)移重組分子構(gòu)建完成后，必須導(dǎo)入到合適的受體細(xì)胞，才能實(shí)現(xiàn)復(fù)制、擴(kuò)增和表達(dá)。受體細(xì)胞又稱為宿主細(xì)胞，是指能夠攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞。當(dāng)前33頁，總共98頁。將重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法有很多種，如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、顯微注射和電穿孔等多種方式，在轉(zhuǎn)移重組分子時根據(jù)受體細(xì)胞的區(qū)別選擇合適的導(dǎo)入方法。一般原核細(xì)胞和低等真核細(xì)胞作受體時主要用轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染法，而高等動植物的真核細(xì)胞作受體時主要用顯微注射和電穿孔法。當(dāng)前34頁，總共98頁。感受態(tài)制備過程培養(yǎng)大腸桿菌OD600至Onice5-10min4℃離心收集菌用冰冷的0.1mMCaCl2重懸4℃離心收集菌4℃離心收集菌分裝、-70℃凍存用冰冷的0.1mMCaCl2重懸Onice30min用冰冷的0.1mMCaCl2重懸當(dāng)前35頁，總共98頁。（1）重組分子轉(zhuǎn)入原核細(xì)胞

熱激法轉(zhuǎn)化（Ca2+有助于轉(zhuǎn)化）往感受態(tài)細(xì)胞中加入重組DNA分子置冰浴中培養(yǎng)30min后42℃熱休克90s實(shí)現(xiàn)感受態(tài)細(xì)胞對重組DNA分子的吸收。當(dāng)前36頁，總共98頁。（2）重組分子轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞酵母作為受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與細(xì)菌類似，先去除細(xì)胞壁游離出原生質(zhì)球，接著在有CaCl2和聚乙二醇的溶液中，重組DNA很容易被受體細(xì)胞吸收。當(dāng)前37頁，總共98頁。哺乳動物細(xì)胞作為受體細(xì)胞可用磷酸鈣沉淀法、病毒顆粒轉(zhuǎn)染法、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法、電穿孔法和顯微注射法等將外源基因?qū)?。外源基因?qū)胫参锛?xì)胞還可利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法。當(dāng)前38頁，總共98頁。作業(yè) 1.如何將兩端平齊末端的DNA進(jìn)行連接？都有哪些可能的方法？2.如何保證克隆在載體上的目的基因片段的方向性？3.試比較轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)染。4.受體細(xì)胞應(yīng)滿足的條件有哪些？5.請寫出真核生物電穿孔、顯微注射、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的全過程。當(dāng)前39頁，總共98頁。3.5重組體的篩選3.5.1遺傳表型篩選法遺傳表型篩選法是比較直接的篩選方法，是根據(jù)轉(zhuǎn)化子接受了重組DNA而與非轉(zhuǎn)化子在表型上存在差異進(jìn)行區(qū)分的一種方法。主要包括抗藥性篩選、插入失活篩選和顯色互補(bǔ)篩選。當(dāng)前40頁，總共98頁。（1）載體表現(xiàn)特征篩選抗藥性篩選利用載體DNA分子上攜帶的抗藥性基因進(jìn)行篩選。抗藥性基因主要有氨芐抗性基因（ampr）、氯霉素抗性基因（cmpr）、卡那霉素抗性基因（kanr）、四環(huán)素抗性基因（tetr）、鏈霉素抗性基因（smr）等。當(dāng)前41頁，總共98頁。插入失活篩選法可彌補(bǔ)抗藥性篩選的不足，可直接篩選出含重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞。這種方法利用質(zhì)粒載體的雙抗藥性。當(dāng)前42頁，總共98頁。插入失活篩選當(dāng)前43頁，總共98頁。-半乳糖苷酶

乳糖半乳糖葡萄糖X-gal半乳糖5-溴-4-氯靛藍(lán)++深藍(lán)色1.原理：載體上有一段-半乳糖苷酶基因（LacZ）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位點(diǎn)。受體菌基因組中有突變的-半乳糖苷酶基因（片段缺失）?？梢员籌PTG誘導(dǎo)表達(dá)。載體和受體菌基因組可以互補(bǔ)形成完整有功能的-半乳糖苷酶。藍(lán)白班篩選當(dāng)前44頁，總共98頁?；パa(bǔ)而產(chǎn)生的lacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）的作用下，在生色底物X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）存在時產(chǎn)生藍(lán)色沉淀物，使菌落顯藍(lán)色。如果外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，無法實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。當(dāng)前45頁，總共98頁。-半乳糖苷酶使X-gal分解成藍(lán)色產(chǎn)物。當(dāng)前46頁，總共98頁。藍(lán)白斑篩選當(dāng)前47頁，總共98頁。（2）插入序列表現(xiàn)特性篩選如果重組DNA分子中的插入序列在受體細(xì)胞中能夠?qū)崿F(xiàn)功能性表達(dá)，則可賦予受體細(xì)胞表現(xiàn)出插入序列編碼的表型特征，可利用此特點(diǎn)篩選含有重組子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。當(dāng)前48頁，總共98頁。從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分離質(zhì)粒，電泳、比較其分子量。分子量Marker載體重組克隆3.5.2結(jié)構(gòu)特征篩選法（1）凝膠電泳篩選凝膠電泳篩選法是利用了重組質(zhì)粒和非重組質(zhì)粒在分子大小上存在差異的性質(zhì)。將平板上長出的菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。當(dāng)前49頁，總共98頁。（2）菌落PCR篩選菌落PCR篩選是利用質(zhì)粒上的引物對質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增來鑒定重組子菌落。在多數(shù)載體DNA分子中，外源DNA插入位點(diǎn)兩側(cè)的序列是已知的。如果受體細(xì)胞中含有的是重組質(zhì)粒，以插入位點(diǎn)兩側(cè)序列的互補(bǔ)序列為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，則可獲得外源DNA。接著進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳在外源DNA的位置就應(yīng)該有對應(yīng)的條帶。當(dāng)前50頁，總共98頁。如果受體細(xì)胞中是非重組質(zhì)粒，以插入位點(diǎn)兩側(cè)序列的互補(bǔ)序列為引物進(jìn)行PCR，則在瓊脂糖凝膠電泳檢測時無法獲得與外源DNA相符的條帶。當(dāng)前51頁，總共98頁。（3）酶切鑒定

酶切鑒定是利用重組質(zhì)粒中外源DNA可選用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶再回收的原理。將平板上長出的菌落增殖培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，對提取的質(zhì)粒分子進(jìn)行酶切反應(yīng)，接著用瓊脂糖凝膠電泳。當(dāng)前52頁，總共98頁。重組質(zhì)粒會得到兩條帶，一條是與線性載體大小一致，另一條帶與插入的外源DNA大小一致，但非重組質(zhì)粒僅有一條帶，其位置與線性載體一致。當(dāng)前53頁，總共98頁。ABA或B當(dāng)前54頁，總共98頁。當(dāng)前55頁，總共98頁。不同克隆的酶切結(jié)果當(dāng)前56頁，總共98頁。3.5.3核酸分子雜交篩選法核酸分子雜交法是利用特異的核酸探針與待測核酸進(jìn)行雜交，檢測待測核酸中是否存在與探針互補(bǔ)的DNA片段。此法也可用于鑒別期望重組子和非期望重組子。在雜交前先將待測核酸變性，將其固定在硝酸纖維素膜上或尼龍膜上。當(dāng)前57頁，總共98頁。然后用探針與之孵育，洗去多余的探針，若最終有顯示的條帶則證明含有目的基因，反之則無。核酸分子雜交法根據(jù)待測核酸來源和固相支持物的不同可分為Southern雜交法、Northern雜交法、斑點(diǎn)印跡雜交法和菌落印跡原位雜交法。當(dāng)前58頁，總共98頁。當(dāng)前59頁，總共98頁。Southernblot篩選結(jié)果當(dāng)前60頁，總共98頁。Southern雜交是將待測DNA分子酶切后變性，轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)臑V膜上用已標(biāo)記的單鏈DNA或RNA探針雜交以檢測這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段。Northern雜交是將RNA分子變性及電泳分離后再用探針進(jìn)行檢測。當(dāng)前61頁，總共98頁。斑點(diǎn)印跡雜交是將變性的DNA或RNA核酸樣品直接轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)碾s交膜上，然后加探針進(jìn)行雜交以檢測核酸樣品中是否存在特異的DNA片段或RNA片段。菌落原位雜交是直接把菌落或噬菌斑印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，經(jīng)溶菌和變性處理后使DNA暴露出來并與濾膜原位結(jié)合，再用特異性DNA或RNA探針雜交，篩選出含有目的基因的菌落或噬菌斑。當(dāng)前62頁，總共98頁。當(dāng)前63頁，總共98頁。3.5.4免疫化學(xué)篩選法免疫化學(xué)篩選法是用抗體作為探針，而非DNA或RNA探針來鑒定目的基因的表達(dá)產(chǎn)物。免疫化學(xué)篩選法分為放射性抗體篩選、非放射性抗體篩選法和免疫沉淀篩選法。當(dāng)前64頁，總共98頁。（1）放射性抗體篩選在放射性抗體篩選法中，先將待檢測的菌落或噬菌體按原位印跡到硝酸纖維素膜上，裂解細(xì)胞使目的蛋白抗原釋放并結(jié)合在膜上，然后與第一抗體反應(yīng)生成抗原-抗體復(fù)合物。當(dāng)前65頁，總共98頁。接著再用放射性125I標(biāo)記了的第二抗體（抗第一抗體中特異性抗原決定簇的抗體）直接檢測，去除過剩的第二抗體，薄膜干燥后放射性自顯影，即可顯示出是否有所需的重組體。當(dāng)前66頁，總共98頁。放射性抗體檢測法過程當(dāng)前67頁，總共98頁。（2）非放射性抗體篩選由于放射性物質(zhì)的半衰期短和安全問題，研究人員開發(fā)出了非放射性標(biāo)記物。如第二抗體可用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶相偶聯(lián)，檢測目的蛋白抗原-抗體復(fù)合物，或者也可用于辣根過氧化酶偶聯(lián)的抗生物素蛋白來檢測與生物偶聯(lián)的第二抗體等。當(dāng)前68頁，總共98頁。待測基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗酶

待測基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗無色的底物有色的產(chǎn)物比色觀察酶

當(dāng)前69頁，總共98頁。（3）免疫沉淀篩選免疫沉淀篩選法是把與目的基因產(chǎn)物相對應(yīng)的標(biāo)記抗體加在有轉(zhuǎn)化子菌落的培養(yǎng)基中。利用抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的原理，如果在菌落周圍有白色圓圈，說明發(fā)生了抗體-抗原反應(yīng)，表明該菌落產(chǎn)生與抗體相對應(yīng)的抗原蛋白（目的基因產(chǎn)物）。當(dāng)前70頁，總共98頁。對于不能被分泌到菌體外的蛋白質(zhì)可先進(jìn)行原位溶菌處理（溶菌酶、原噬菌體誘發(fā)）。當(dāng)前71頁，總共98頁。3.5.5轉(zhuǎn)譯篩選法利用克隆的DNA同所編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物之間的對應(yīng)關(guān)系進(jìn)行篩選，分為雜交抑制轉(zhuǎn)譯篩選和雜交選擇轉(zhuǎn)譯篩選。當(dāng)前72頁，總共98頁。作業(yè) 1．舉例說明插入失活的基本原理。2.何謂ɑ-互補(bǔ)？何謂安慰性誘導(dǎo)物？3.如何用PCR來檢測目的基因是否被克隆？他是基于什么原理？當(dāng)前73頁，總共98頁。3.6克隆基因的表達(dá)3.6.1克隆基因的表達(dá)系統(tǒng)基因工程的表達(dá)系統(tǒng)分為原核和真核兩類，常用的原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和鏈霉菌等，真核表達(dá)系統(tǒng)有酵母、絲狀真菌、昆蟲細(xì)胞和哺乳類細(xì)胞。當(dāng)前74頁，總共98頁。原核生物作表達(dá)系統(tǒng)具有生長迅速、培養(yǎng)條件簡單等優(yōu)點(diǎn)，但大多缺乏轉(zhuǎn)錄后加工和對蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化、磷酸化等修飾的能力。真核細(xì)胞作宿主表達(dá)系統(tǒng)雖能去除外源基因中的內(nèi)含子，并可對蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯后加工，但其選擇標(biāo)記少、轉(zhuǎn)化效率低。當(dāng)前75頁，總共98頁。克隆基因的表達(dá)：外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基因表達(dá)載體重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞在宿主細(xì)胞中表達(dá)出蛋白提取蛋白宿主細(xì)胞：原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。當(dāng)前76頁，總共98頁。3.6.2克隆基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)與調(diào)控轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的第一步，也是基因表達(dá)調(diào)控的主要層次?；蛟谵D(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄的起始階段和終止階段，調(diào)控方式有順式作用和反式作用兩類，每一類中又有正調(diào)控和負(fù)調(diào)控兩種形式。當(dāng)前77頁，總共98頁。順式調(diào)控是一段非編碼DNA序列對基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用，反式調(diào)控是一種蛋白質(zhì)作用于某一順式作用元件來影響基因的轉(zhuǎn)錄。正調(diào)控促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行，而負(fù)調(diào)控是抑制轉(zhuǎn)錄的發(fā)生。當(dāng)前78頁，總共98頁。(1)原核的轉(zhuǎn)錄起始與轉(zhuǎn)錄終止RNA聚合酶與啟動子的直接結(jié)合；強(qiáng)啟動子如Lac、Trp。當(dāng)前79頁，總共98頁。當(dāng)前80頁，總共98頁。轉(zhuǎn)錄終止有兩種類型一種是不依賴于ρ因子的終止另一種終止機(jī)制是依賴于ρ因子的終止當(dāng)前81頁，總共98頁。(2)真核的轉(zhuǎn)錄起始與轉(zhuǎn)錄終止真核生物的啟動子由核心啟動子元件和上游啟動子元件兩部分構(gòu)成。核心啟動子元件是保證基礎(chǔ)水平轉(zhuǎn)錄所必須的最少的DNA序列，包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和TATAbox。上游啟動子元件決定著轉(zhuǎn)錄起始的頻率與效率，包括GCbox和CAATbox。在轉(zhuǎn)錄起始時需要其他的蛋白質(zhì)因子參與，這些蛋白質(zhì)因子稱為轉(zhuǎn)錄因子。當(dāng)前82頁，總共98頁。真核生物的RNA聚合酶有三種，其中RNA聚合酶Ⅱ負(fù)責(zé)mRNA的合成，對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子為轉(zhuǎn)錄因子II，為反式作用因子。反式作用因子與啟動子親和力高，則表明此啟動子有很高的轉(zhuǎn)錄起始效率。增強(qiáng)子是順式正調(diào)控元件，對基因轉(zhuǎn)錄有極強(qiáng)的激活作用。當(dāng)前83頁，總共98頁。3.6.3克隆基因在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控真核生物的mRNA加工包括三個內(nèi)容：5′端加帽、3′端加尾、RNA剪接。由于原核生物沒有切除內(nèi)含子的能力，因此當(dāng)用原核生物表達(dá)真核基因時，應(yīng)先從真核細(xì)胞中分離mRNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，cDNA有完整的編碼序列但無內(nèi)含子，將cDNA與載體連接導(dǎo)入原核細(xì)胞中表達(dá)。當(dāng)前84頁，總共98頁。3.6.4克隆基因在翻譯水平的表達(dá)與調(diào)控翻譯是基因表達(dá)的最后一個階段，翻譯的效率會受翻譯起始復(fù)合物的形成、mRNA的穩(wěn)定性、密碼子偏愛性、反義RNA、翻譯起始因子的修飾等因素影響。當(dāng)前85頁，總共98頁。(1)原核生物在翻譯起始的調(diào)控起始密碼子AUGSD序列融合蛋白被認(rèn)為是避免細(xì)菌蛋白酶破壞的最好選擇在插入真核基因時，閱讀框應(yīng)與原核DNA片段的密碼子閱讀框一致，翻譯時才不致產(chǎn)生閱讀框改變的情況當(dāng)前86頁，總共98頁。（2）真核生物在翻譯起始的調(diào)控mRNA5′端先與翻譯起始因子中的CBP（capbindingprotein，帽子結(jié)合蛋白）結(jié)合然后eIF-4A和eIF-4B與之結(jié)合，為小亞基提供結(jié)合位點(diǎn)，形成40S-Met-tRNAiMet-eIF-3與eIF-4A和eIF-4B形成復(fù)合物接著此復(fù)合物從帽子結(jié)構(gòu)開始沿著mRNA掃描，尋找起始密碼子AUG。當(dāng)前87頁，總共98頁。作為起始密碼子的AUG兩側(cè)翼序列有兩個保守堿基，AUG上游3個堿基位必定是A，少數(shù)情況下是G，而下游4個堿基位必定是G。這段序列（NNPuNNAUGG）對翻譯很重要，稱為Kozak序列。當(dāng)掃描時遇到了具有Kozak序列的AUG時，復(fù)合物在此處停留下來，60S大亞基結(jié)合，形成翻譯起始復(fù)合物。當(dāng)前88頁，總共98頁。（3）反義RNA反義RNA是翻譯水平上的一種新的調(diào)控方式。反義RNA是能與mRNA5′端互補(bǔ)的RNA分子。反義RNA分子以堿基互補(bǔ)配對方式與mRNA成為雜合分子，阻止了mRNA的翻譯。當(dāng)前89頁，總共98頁。細(xì)菌鐵蛋白的翻譯就受反義RNA的調(diào)控細(xì)菌鐵蛋白是用來儲存細(xì)胞中過剩的鐵離子。細(xì)胞中無論鐵離子濃度高或濃度低時，細(xì)菌鐵蛋白的編碼基因bfr基因都以相同速率轉(zhuǎn)錄成mRNA，而anti-bfr基因的轉(zhuǎn)錄卻受鐵離子濃度的調(diào)控。鐵離子濃度高時，anti-bfr基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制，bfr基因翻譯成細(xì)菌鐵蛋白。當(dāng)鐵離子濃度低時，anti-bfr基因大量表達(dá)，與bfr基因的mRNA形成雜合雙鏈，阻止了bfr基因的翻譯。當(dāng)前90頁，總共98頁。當(dāng)前91頁，總共98頁。3