臨床微生物學檢驗：2細菌形態(tài)學檢查、培養(yǎng)和分離技術(shù)

2023/3/91細菌檢驗的基本技術(shù)（一）第一節(jié)細菌形態(tài)學檢查第二節(jié)細菌的培養(yǎng)和分離技術(shù)2023/3/92微生物檢驗流程2023/3/93第一節(jié)細菌的形態(tài)學檢查工具：顯微鏡顯微鏡檢查的目的：1.鏡檢可以了解標本中有無細菌及大致的菌量2.根據(jù)細菌形態(tài)、排列和染色性有助于對標本中的病原菌進行初步診斷，對臨床早期診斷和治療疾病有一定的參考意義方法：包括不染色標本檢查法和染色標本檢查法2023/3/94常用的顯微鏡（1）普通光學顯微鏡（lightmicroscope）光源：自然光或燈光，波長0.4μm最大分辨率：0.2μm（2）暗視野顯微鏡（darkfieldmicroscope）（3）相差顯微鏡（phasecontrastmicroscope）（4）熒光顯微鏡（fluorescencemicroscope）（5）電子顯微鏡（electronmicroscope）返回2023/3/95普通光學顯微鏡2023/3/96目的：主要用于檢查生活狀態(tài)下細菌的動力及運動狀況。常用的方法：懸滴法和壓滴法

有動力：可看到細菌自一處移至另一處，有明顯的方向性位移。

無動力：細菌呈現(xiàn)布朗運動，只在原地顫動而無位置的改變。一、不染色標本直接鏡檢2023/3/97懸滴法檢查細菌的動力2023/3/982023/3/99不染色標本鏡下結(jié)果觀察：動力（+），動力（-）用普通光學顯微鏡（高倍鏡）觀察時注意：調(diào)小顯微鏡的光柵2023/3/910

有些病原菌通過不染色標本的動力檢查可作出初步鑒定：如疑似霍亂患者“米泔水樣”便中發(fā)現(xiàn)穿梭樣運動細菌，可輔助診斷。

螺旋體輔助診斷2023/3/911（一）常用染料（色基+助色基）1．堿性染料：堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫、美藍等，電離后帶正電荷，常用于細菌染色（原因何在？）。2．酸性染料：有伊紅、剛果紅等，電離后帶負電荷。3．復(fù)合染料（中性染料）：復(fù)合染料有瑞氏染料（伊紅美藍）、姬姆薩染料（伊紅天青）等。

二、染色標本的顯微鏡檢查2023/3/912（二）常用的染色方法：正染色法和負染色法作用：染色標本的檢查，可觀察細菌的染色性、形態(tài)、排列、大小、某些特殊結(jié)構(gòu)等。染色的基本步驟：涂片、干燥、固定、染色。背景著色菌體著色2023/3/913細菌涂片的制作過程d菌懸液直接涂布2023/3/914正染色法：革蘭染色、抗酸染色、熒光染色等1．革蘭染色（gramstain）2023/3/915革蘭陽性球菌革蘭陰性桿菌2023/3/9162．抗酸染色（acid-faststain）可將細菌分為兩大類：

-抗酸性細菌

-非抗酸性細菌2023/3/9172023/3/918抗酸染色結(jié)果2023/3/9193．熒光染色（1）熒光染色法敏感性強，效率高而且容易觀察結(jié)果，在臨床細菌鑒定中有很大的實用價值。（2）主要用于結(jié)核分枝桿菌、麻風分枝桿菌、白喉棒狀桿菌及痢疾志賀菌等的檢測。結(jié)核分枝桿菌金胺O染色片2023/3/9204.特殊染色（1）鞭毛染色：可觀察到菌體上有無鞭毛、鞭毛的位置及數(shù)量，在細菌鑒定中，特別是非發(fā)酵菌的鑒定中很重要。（2）異染顆粒染色用于白喉棒狀桿菌染色。（3）芽孢和莢膜染色2023/3/921負染色法：墨汁染色，一般用于新型隱球菌檢查2023/3/922第二節(jié)細菌培養(yǎng)和分離技術(shù)主要內(nèi)容：一、培養(yǎng)基培養(yǎng)基的概念、培養(yǎng)基的組成成分、培養(yǎng)基種類、和培養(yǎng)基的制備二、細菌的人工培養(yǎng)與分離無菌技術(shù)、細菌的接種與分離方法、細菌培養(yǎng)方法、細菌的生長現(xiàn)象、臨床標本細菌培養(yǎng)時培養(yǎng)基的選擇2023/3/923

培養(yǎng)基（culturemedium）概念：是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)物制品。

一、培養(yǎng)基2023/3/924(一)培養(yǎng)基的組成成分1．營養(yǎng)物質(zhì)：碳源、氮源、無機鹽、生長因子等。蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖類、醇類、血液、無機鹽類、雞蛋和動物血清、生長因子2．水和凝固物質(zhì)

瓊脂（凝點和熔點相距大）3．抑制劑和指示劑2023/3/925（二）培養(yǎng)基種類（按用途分類）1．基礎(chǔ)培養(yǎng)基（basedmedium）2．營養(yǎng)培養(yǎng)基（nutrientmedium）3．鑒別培養(yǎng)基（differentialmedium）4．選擇培養(yǎng)基（selectivemedium）5．特殊培養(yǎng)基（specialmedium）2023/3/926（1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基(basedmedium)

含有基礎(chǔ)生長所需的基本營養(yǎng)成分，最常用的是肉浸液，俗稱肉湯（broth），主要成分含牛肉浸液和蛋白胨。2023/3/927（2）營養(yǎng)培養(yǎng)基（nutrientmedium）最常用的是血瓊脂平板、巧克力血平板等2023/3/928

（3）鑒別培養(yǎng)基（differentialmedium）在培養(yǎng)基中加入特定的底物和酸堿指示劑，觀察細菌在生長過程中分解底物所釋放的不同產(chǎn)物，通過指示劑的反應(yīng)來鑒別細菌，如各種糖、苷、醇類發(fā)酵管等。

2023/3/929各種糖苷醇類發(fā)酵管常用指示劑：酚紅、溴甲酚紫、溴麝香草酚藍底物：各種糖、苷、醇類、氨基酸等①溴甲酚紫：酸性堿性2023/3/930②溴麝香草酚藍在酸堿環(huán)境中的顏色變化

酸性中間過渡堿性2023/3/931③酚紅堿性酸性2023/3/932④甲基紅：酸pH4.4紅色堿pH6.2黃色⑤中性紅：酸性pH＜6.8紅色，堿性黃色⑥厭氧指示劑：

亞甲藍和刃天青（無氧：都是無色，

有氧：亞甲藍藍色，刃天青紅色）2023/3/9332023/3/934雙糖鐵(KIA)培養(yǎng)基斜面觀察：乳糖底層觀察：葡萄糖、硫化氫、產(chǎn)氣⑦指示劑：多用酚紅（酸：黃，堿：紅）2023/3/935（4）選擇培養(yǎng)基（selectivemedium）培養(yǎng)基中加入抑制劑，抑制標本中雜菌生長，選擇性讓目的菌生長。SS平板2023/3/936腸道強選擇性培養(yǎng)基：SS瓊脂底物：乳糖指示劑：中性紅（酸性紅色，堿性淡黃色）抑制劑：膽鹽抑制革蘭陽性菌生長；枸櫞酸鹽和煌綠對大腸埃希菌生長有一定抑制2023/3/937腸道弱選擇性培養(yǎng)基：麥康凱瓊脂底物：乳糖指示劑：中性紅（酸性紅色，堿性淡黃色）抑制劑：膽鹽（抑制革蘭陽性菌生長）大腸埃希菌（紅色菌落）和福氏志賀菌（淡黃色菌落）在麥康凱（Mac)平板上2023/3/938（5）特殊培養(yǎng)基（specialmedium）皰肉培養(yǎng)基、巰基乙醇酸鈉培養(yǎng)基

L型培養(yǎng)基培養(yǎng)基按形狀分類

（瓊脂含量不同）2023/3/9液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基（三）培養(yǎng)基的制備調(diào)配溶解校正pH：最適pH一般為7.2-7.6分裝滅菌：最常用高壓滅菌法質(zhì)量檢驗：無菌試驗和效果檢查保存2023/3/940二、細菌的人工培養(yǎng)（一）無菌技術(shù)概念：防止環(huán)境中的微生物污染待檢物，同時防止待檢物中可能存在的病原微生物污染環(huán)境和實驗室人員的系列規(guī)范化操作技術(shù)。2023/3/9412023/3/9421．平板劃線分離法2．斜面固體接種法3．液體接種法4．半固體穿刺接種法5．傾注平板法6．涂布接種法掌握上述分離接種方法和目的（二）細菌的接種與分離方法2023/3/9432023/3/944分區(qū)劃線培養(yǎng)后結(jié)果2023/3/9452023/3/946菌懸液液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)種方法2023/3/947液體接種法

（鑒定、增菌）瓊脂斜面接種法（雙糖鐵培養(yǎng)基常用此法接種）半固體穿刺接種法（觀察動力、保存菌種）2023/3/948半固體穿刺接種后動力（+）和動力（-）結(jié)果

陽性陰性空白對照2023/3/949涂布接種法（姚敏試驗、菌落計數(shù)）傾注平板法

將標本經(jīng)適當稀釋后，取一定量加入已滅菌的平皿內(nèi)，傾入已溶化并冷卻至45℃左右的定量培養(yǎng)基，混勻，待凝固后倒置、培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)基內(nèi)的菌落數(shù)和稀釋倍數(shù)，即可計算出標本的細菌數(shù)。測定牛乳、飲水和尿液等標本細菌數(shù)時常用此方法。2023/3/951

1．需氧培養(yǎng)法

2．二氧化碳培養(yǎng)法

5%--10%CO23．厭氧培養(yǎng)法4.微需氧培養(yǎng)法5%O210%CO285%N2

（三）細菌培養(yǎng)方法（四）細菌的生長現(xiàn)象細菌在固體培養(yǎng)基上的生長現(xiàn)象菌落：單個細菌分裂繁殖而成的肉眼可見的細菌集落。圖菌苔：多個菌落連接而成的細菌群落。圖細菌在液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象圖

渾濁生長、表面生長、沉淀生長細菌在半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象2023/3/952各種菌落2023/3/954菌苔細菌生長現(xiàn)象觀察表面superficialgrowth沉淀precipitategrowth對照contrast混濁t(yī)urbidgrowth細菌在半固體中生現(xiàn)象2023/3/956根據(jù)標本來源和可能存在的病原菌，確定選用各種分離培養(yǎng)基。1.糞便或肛拭子標本：GN肉湯增菌，轉(zhuǎn)種或直接接種SS和Mac平板或中國藍平板，疑似霍亂接種堿性蛋白胨水。（五）培養(yǎng)基的選擇2023/3/9572.血液、骨髓和腦脊液標本：用血液增菌培養(yǎng)基(需氧、厭氧），再轉(zhuǎn)種血平板或巧克力平板或厭氧平板。2023/3/9583.痰標本：選擇血平板、巧克力平板、Mac或中國藍平板。4.尿液標本：選擇血平板、麥康凱5.膿標本：選擇血平板6.泌尿生殖道分泌物：血平板、巧克力平板7.其他標本：特殊培養(yǎng)選擇特殊培養(yǎng)基2023/3/