熒光免疫標記技術(shù)

熒光免疫標記技術(shù)第一頁，共三十七頁，2022年，8月28日知識目標技能目標素質(zhì)目標1.重點掌握免疫熒光顯微技術(shù)、免疫熒光技術(shù)在醫(yī)學檢驗中的應(yīng)用2.熟悉熒光的基礎(chǔ)知識、熒光免疫分析常用儀器和設(shè)備3.了解熒光抗體的制備1.會使用熒光顯微鏡等常用儀器和設(shè)備2.會用熒光免疫技術(shù)檢測抗原抗體3.能將熒光免疫測定與臨床應(yīng)用相聯(lián)系通過學生相互鼓勵、嚴謹、認真操作，各小組共同協(xié)作完成任務(wù)，培養(yǎng)了與人合作、與人溝通的能力任務(wù)目標第二頁，共三十七頁，2022年，8月28日1熒光標記物的制備

2熒光免疫組織化學技術(shù)3其他熒光免疫技術(shù)任務(wù)對象第三頁，共三十七頁，2022年，8月28日

任務(wù)過程

復習提問

案例導入

講解與示教學生操作討論分析

評價、考核

課后思考題教學環(huán)節(jié)2′30′2′10′40′5′1′第四頁，共三十七頁，2022年，8月28日

患兒，男，間斷發(fā)熱五天，伴咳嗽3天。體溫最高39度，病程第2天查血常規(guī)正常，診斷“呼吸道感染”并靜滴“阿奇霉素”3天，無明顯改變，即而出現(xiàn)咳嗽，為陣發(fā)性刺激性咳嗽，少痰，胸片提示：雙肺紋理增粗，右上肺片影。復查血常規(guī)仍正常?；純悍尾扛腥鞠的姆N病原體所致？如何快速診斷？案例導入第五頁，共三十七頁，2022年，8月28日老師糾正點評

學生操作一位學生操作演示學生分組再操作第六頁，共三十七頁，2022年，8月28日【主要試劑與器材】1.抗原基質(zhì)片固定有核抗原，可采用小鼠肝組織切片或印片經(jīng)丙酮固定即可。目前有商品化試劑供應(yīng)。2.標記抗體FITC標記的羊抗人IgG，有商品化試劑供應(yīng)。臨用時稀釋至工作濃度。。4.緩沖甘油9份甘油和1份PBS混勻。5.待檢血清，陰性、陽性對照血清。6.其它熒光顯微鏡、染色缸、吸管、微量加樣器等。實驗操作第七頁，共三十七頁，2022年，8月28日【操作方法】1.自冰箱中取出抗原基質(zhì)片，平衡至室溫，用記號筆畫圈標記。2.將待檢血清和對照血清用PBS作1∶10稀釋，用微量加樣器加50μl待檢血清或?qū)φ昭逵诨|(zhì)片上，水平置于濕盒中37oC溫箱反應(yīng)30min。3.以PBS沖洗抗原基質(zhì)片，再分別浸于盛有PBS染色缸中，反復漂洗3次，每次5min。4.取出玻片，吹干，加50μl最適工作濃度的標記抗體，平置于濕盒內(nèi)，37oC溫箱反應(yīng)30min。

5.重復步驟3，洗去未結(jié)合的熒光抗體。6.滴加緩沖甘油封片，用熒光顯微鏡觀察。實驗操作第八頁，共三十七頁，2022年，8月28日【結(jié)果判斷】1.熒光顯微鏡下見肝細胞核呈黃綠色，為陽性；反之為陰性。2.根據(jù)熒光分布情況，可分為四種熒光核型：⑴均質(zhì)型:細胞核呈均勻一致的熒光。⑵周邊型:細胞核周圍呈現(xiàn)熒光，核中央染色弱或無熒光。⑶斑點型：細胞核呈現(xiàn)斑點狀熒光。⑷核仁型：核仁部分呈現(xiàn)熒光。實驗操作實驗操作第九頁，共三十七頁，2022年，8月28日【注意事項】1.滴加的血清或標記抗體應(yīng)充分覆蓋滿抗原片。樣品之間防止交叉污染。反應(yīng)時應(yīng)置于濕盒內(nèi)，防止干燥。2.每次沖片應(yīng)徹底，防止非特異熒光的干擾。3.熒光受溫度影響較大，不能及時觀察時應(yīng)注意低溫避光保存。實驗操作第十頁，共三十七頁，2022年，8月28日【應(yīng)用與評價】

熒光抗體技術(shù)應(yīng)用較廣，可用于病原微生物鑒定及其抗體的檢測；自身免疫病自身抗體的檢測，免疫細胞表面抗原的檢測等。此方法檢測ANA，主要用于初步篩查，具有簡便、快速、敏感等特點。實驗操作第十一頁，共三十七頁，2022年，8月28日討論分析提出問題展開討論

用什么可以觀察到熒光？為什么有熒光就能做出診斷？第十二頁，共三十七頁，2022年，8月28日

免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescencetechnique）又稱熒光抗體技術(shù)。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。該技術(shù)的主要優(yōu)缺點主要優(yōu)點：特異性強、敏感性高、速度快。主要缺點：非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復雜。免疫熒光技術(shù)討論分析第十三頁，共三十七頁，2022年，8月28日

免疫熒光技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性和敏感性與顯微示蹤的精確性相結(jié)合。

以熒光素作為標記物，與已知的抗體(或抗原)結(jié)合、但不影響其免疫學特性。然后將熒光素標記的抗體作為標準試劑，用于檢測和鑒定未知的抗原。在熒光顯微鏡下，可以直接觀察呈現(xiàn)特異熒光的抗原抗體復合物及其存在部位。免疫熒光技術(shù)-基本原理討論分析第十四頁，共三十七頁，2022年，8月28日

熒光是指一個分子或原子吸收了給予的能量后，即刻引起發(fā)光；停止能量供給，發(fā)光亦瞬即停止。熒光素是一種可吸收激發(fā)光的光便能產(chǎn)生熒光，并能作為染料使用的有機化合物，亦稱熒光色素。發(fā)生原理---基態(tài)激發(fā)態(tài)產(chǎn)生特點：激發(fā)---即刻產(chǎn)生停止激發(fā)---瞬間消失種類---光致熒光，化學熒光，X線熒光，陰極射線熒光討論分析熒光第十五頁，共三十七頁，2022年，8月28日熒光壽命---熒光物質(zhì)被瞬時光脈沖激發(fā)后產(chǎn)生的熒光衰減到一定程度所用時間。熒光淬滅---熒光物質(zhì)的熒光輻射能力在受到激發(fā)光較長時間的照射后發(fā)生的減弱現(xiàn)象。淬滅劑---苯胺、硝基苯、酚等熒光（標記）物質(zhì)的保存熒光討論分析第十六頁，共三十七頁，2022年，8月28日

熒光色素:能夠產(chǎn)生明顯熒光并能作為染料使用的有機化合物稱為熒光色素或熒光染料。用于標記抗體的熒光色素，必須具有化學上的活性基因，能與蛋白質(zhì)穩(wěn)定結(jié)合，且不影響標記抗體的生物活性及抗原抗體的特異性結(jié)合。討論分析異硫氰酸熒光素(FITC)第十七頁，共三十七頁，2022年，8月28日熒光FITC+RB200標記討論分析第十八頁，共三十七頁，2022年，8月28日光源：高壓汞燈、氙燈、鹵素燈濾板：隔熱濾板、激光濾板（UG、BG）、吸收濾板（OG、GG）光路：透射光、落射光熒光顯微鏡討論分析第十九頁，共三十七頁，2022年，8月28日a透射光b落射光

討論分析第二十頁，共三十七頁，2022年，8月28日

熒光顯微鏡臺式機---FACSCalibur雙激光---488nm 635nm四熒光參數(shù)分選、濃縮系統(tǒng)討論分析第二十一頁，共三十七頁，2022年，8月28日大型機---FACSVantageSE

多激光多波長八熒光參數(shù)高速分選單細胞點對點分選討論分析第二十二頁，共三十七頁，2022年，8月28日基本原理---熒光顯微鏡；熒光Ab；標本（組織或細胞中Ag)技術(shù)類型：直接法---熒光素標記Ab直接檢測間接法---熒光素標記二抗補體結(jié)合法---熒光素標記抗補體Ab雙結(jié)合法---兩種熒光素標記Ab重點熒光免疫顯微技術(shù)討論分析第二十三頁，共三十七頁，2022年，8月28日討論分析第二十四頁，共三十七頁，2022年，8月28日間接免疫熒光檢測自身抗核抗體討論分析第二十五頁，共三十七頁，2022年，8月28日FALSSensorLaser前向角散射光（FSC）：反映細胞的大小熒光免疫顯微技術(shù)討論分析第二十六頁，共三十七頁，2022年，8月28日FALSSensor90LSSensorLaser側(cè)向角散射光（SSC）：反映細胞內(nèi)的顆粒多少

熒光免疫顯微技術(shù)討論分析第二十七頁，共三十七頁，2022年，8月28日雙色直接染色細胞T細胞B細胞熒光免疫顯微技術(shù)討論分析第二十八頁，共三十七頁，2022年，8月28日直方圖分析：對細胞的某一個單參數(shù)進行統(tǒng)計分析橫坐標為熒光或散射光強度縱坐標為細胞數(shù)熒光免疫顯微技術(shù)第二十九頁，共三十七頁，2022年，8月28日討論分析第三十頁，共三十七頁，2022年，8月28日間接免疫熒光法示意圖討論分析第三十一頁，共三十七頁，2022年，8月28日熒光免疫顯微技術(shù)在醫(yī)學檢驗中的應(yīng)用：細菌檢驗---細菌培養(yǎng)物、感染組織、病人分泌排泄物等（菌種鑒定）病毒檢驗---特殊意義亦可檢測血清中Ab(間接法)---流行病學調(diào)查和臨床回顧性診斷寄生蟲檢驗---間接法測Ab,如抗瘧Ab、阿米巴Ab等自身Ab檢測討論分析第三十二頁，共三十七頁，2022年，8月28日配分與評分標準序號考核要點分值評分標準得分12抗原基質(zhì)片，平衡至室溫(2)記號筆畫圈標記

待檢血清和對照血清用PBS作1∶10稀釋

(2)微量加樣器50μl待檢血清或?qū)φ昭逵诨|(zhì)片上⑶水平置于濕盒中37oC溫箱反應(yīng)30min11111不符合要求將此分扣除不符合要求將此分扣除考核第三十三頁，共三十七頁，2022年，8月28日配分與評分標準序號考核要點分值評分標準得分3⑴以PBS沖洗抗原基質(zhì)片(2)浸于盛有PBS染

色缸中⑶反復漂洗3次⑷每次5min111不符合要求將此分扣除考核第三十四頁，共三十七頁，2022年，8月28日配分與評分標準序號考核要點分值評分標準得分4⑴取出玻片，吹干(2)

加50μl最適工作濃度的標記抗體⑶平置于濕盒內(nèi)，37oC溫箱反應(yīng)30min111不符合要求將此分扣除考核第三十五頁，共三十七頁，2022年，8月28日序號考核要點