第三章動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶演示文稿

第三章動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶演示文稿當(dāng)前1頁，總共39頁。優(yōu)選第三章動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶當(dāng)前2頁，總共39頁。概述動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)定義：是通過特定技術(shù)獲得優(yōu)良的動(dòng)物和植物細(xì)胞，然后在人工控制條件的反應(yīng)器中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，以獲得所需產(chǎn)物的技術(shù)過程。當(dāng)前3頁，總共39頁。概述獲取方法培養(yǎng)方式培養(yǎng)目的動(dòng)物細(xì)胞離心分離、雜交瘤技術(shù)、胰蛋白酶消化懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)獲得功能蛋白質(zhì)植物細(xì)胞機(jī)械搗碎、酶解、誘導(dǎo)愈傷組織、分離原生質(zhì)體固體培養(yǎng)、液體淺層培養(yǎng)、液體懸浮培養(yǎng)獲得次生代謝產(chǎn)物當(dāng)前4頁，總共39頁。第一節(jié)動(dòng)植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)動(dòng)植物細(xì)胞更復(fù)雜，調(diào)節(jié)層次更多。細(xì)胞水平個(gè)體水平（激素、神經(jīng)水平）下面著重從細(xì)胞水平討論。當(dāng)前5頁，總共39頁。第一節(jié)動(dòng)植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)一、細(xì)胞分化改變酶的生物合成原因：基因表達(dá)具有時(shí)空性如：胰蛋白酶主要在胰細(xì)胞中合成木瓜蛋白酶主要在果皮細(xì)胞中合成端粒酶在胚胎細(xì)胞、生殖細(xì)胞、干細(xì)胞、分化程度低的癌細(xì)胞中具活性。當(dāng)前6頁，總共39頁。第一節(jié)動(dòng)植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)2、基因擴(kuò)增加速酶的生物合成即通過增加基因的數(shù)量來調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一種方式。如：對藥物的抗性。3、增強(qiáng)子促進(jìn)酶的生物合成增強(qiáng)子能促進(jìn)同源或異源啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄活性。4、抗原誘導(dǎo)抗體酶的生物合成半抗原誘導(dǎo)法酶蛋白誘導(dǎo)法當(dāng)前7頁，總共39頁。第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶近年來通過植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶的研究已經(jīng)取得可喜進(jìn)展當(dāng)前8頁，總共39頁。含酶制品——嫩肉粉當(dāng)前9頁，總共39頁。第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶一、植物細(xì)胞的特性大生長及代謝率低營養(yǎng)要求簡單需光對剪切力敏感生產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物當(dāng)前10頁，總共39頁。第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶二、植物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)提高產(chǎn)率縮短周期易于管理，減輕勞動(dòng)強(qiáng)度提高產(chǎn)品質(zhì)量其他：需光照等當(dāng)前11頁，總共39頁。第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶外植體的選擇和處理→愈傷組織的誘導(dǎo)→細(xì)胞的獲取→細(xì)胞培養(yǎng)→分離純化→產(chǎn)物外植體的選擇與處理：選擇外植體、切取片段、消毒處理。植物愈傷組織直接分離法機(jī)械搗碎發(fā)：動(dòng)作輕柔酶分解法：纖維素酶、果膠酶等過濾、離心分離愈傷組織誘導(dǎo)法能迅速增殖、無特定結(jié)構(gòu)和功能的薄壁細(xì)胞團(tuán)外植體半固體培養(yǎng)基滅菌、冷卻生長素、分裂素插入培養(yǎng)25℃愈傷組織1-3周分散、接種原生質(zhì)體再生去除細(xì)胞壁后得到的微球體三、植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制（一）植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝流程植物細(xì)胞的獲?。寒?dāng)前12頁，總共39頁。第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶三、植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制（一）植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝流程外植體→細(xì)胞的獲取→細(xì)胞培養(yǎng)→分離純化→產(chǎn)物1、外植體的選擇與處理2、植物細(xì)胞的獲取3、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)4、分離純化當(dāng)前13頁，總共39頁。第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶三、植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制（二）植物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基1、植物細(xì)胞培養(yǎng)基的特點(diǎn)與微生物培養(yǎng)基的主要不同點(diǎn)如下：（1）植物細(xì)胞的生長和代謝需要大量的無機(jī)鹽（2）植物細(xì)胞需要多種維生素和植物生長激素（3）植物細(xì)胞要求的氮源一般為無機(jī)氮源（4）植物細(xì)胞一般以蔗糖為碳源當(dāng)前14頁，總共39頁。第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶三、植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制（二）植物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基2、幾種常用的植物細(xì)胞培養(yǎng)基

1）MS培養(yǎng)基硝酸鹽濃度高，廣泛用于培養(yǎng)植物細(xì)胞、組織及原生質(zhì)體。2）B5培養(yǎng)基銨的濃度較低，適于雙子葉植物特別是木本植物的組織、細(xì)胞培養(yǎng)。3）White培養(yǎng)基無機(jī)鹽濃度低，適用于生根培養(yǎng)。4）KM-8P培養(yǎng)基主要用于原生質(zhì)體培養(yǎng)。當(dāng)前15頁，總共39頁。第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶三、植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制（二）植物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基3、植物細(xì)胞培養(yǎng)基的配制為取用方便及減小誤差，先配成母液保存?zhèn)溆?。?）大量元素母液：即含有N、P、S、K、Ca、Mg、Na等大量元素的無機(jī)鹽混合液。一般配成10倍濃度的母液。需單獨(dú)溶解，按順序攪拌混合。避免生成沉淀。（2）微量元素母液：即含有B、Mn、Zn、Co、Cu、Mo、I等微量元素的無機(jī)鹽混合液。一般配制成100倍濃度的母液。當(dāng)前16頁，總共39頁。第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶三、植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制（二）植物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基3、植物細(xì)胞培養(yǎng)基的配制（3）鐵鹽母液：單獨(dú)配制，一般采用敖和鐵，通常配制成100倍濃度母液。（4）維生素母液：是各種維生素和氨基酸的混合液，一般配成100倍濃度母液。（5）植物激素母液：各種植物激素單獨(dú)配制成母液。一般濃度為100mg/L.（注：一般難溶于水，需先用有機(jī)溶劑或酸、堿溶解，再用水定容。）當(dāng)前17頁，總共39頁。第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶三、植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制（三）溫度的控制：一般室溫（25℃左右）溫度高，有利細(xì)胞生長；溫度低，有利于次級(jí)代謝產(chǎn)物積累。（四）pH的控制：一般微酸性（Ph5.0~6.0）（五）溶解氧的控制:通風(fēng)攪拌供給（不能太劇烈）。當(dāng)前18頁，總共39頁。第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶三、植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制（六）光照的控制：對強(qiáng)度及時(shí)間有要求。（七）前體的添加：前提指處于目的代謝途徑上游的物質(zhì)。（八）刺激劑的應(yīng)用：微生物細(xì)胞壁碎片、果膠酶、纖維素酶等微生物胞外酶。當(dāng)前19頁，總共39頁。第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶四、植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶的工藝過程1、大蒜愈傷組織的誘導(dǎo)2、大蒜細(xì)胞懸浮培養(yǎng)3、超氧化物歧化酶的分離純化當(dāng)前20頁，總共39頁。

第三節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶由于動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)具有明顯的表達(dá)產(chǎn)物的優(yōu)點(diǎn)，為傳統(tǒng)微生物發(fā)酵所無法取代，因此，生物技術(shù)中許多有價(jià)值的生物制品，需要借助于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)而獲得，這種需求極大地促進(jìn)了動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展。當(dāng)前21頁，總共39頁。第三節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶早在1907年，美國的Harrison在世界上首次將蛙的神經(jīng)組織在試管內(nèi)培養(yǎng)成功，建立起動(dòng)物組織體外培養(yǎng)的第一塊基石。1950年前后，Enders及其同事發(fā)表了第一篇關(guān)于在培養(yǎng)細(xì)胞中生長病毒的報(bào)告，開拓了以動(dòng)物病毒為研究對象的新領(lǐng)域。作為大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，Copsik等人成功的進(jìn)行了有關(guān)倉鼠腎細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)。當(dāng)前22頁，總共39頁。第三節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到有許多基因產(chǎn)物不能在原核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，它們需要經(jīng)過真核細(xì)胞所特有的翻譯后修飾，以及正確的切割、折疊后，才能形成與自然分子一樣的功能和抗原性。使得動(dòng)物細(xì)胞一躍成為一種重要的宿主細(xì)胞，用以生產(chǎn)多種生物制品等。這些采用大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)貴重藥品在臨床診斷、治療和預(yù)防等方面都有重要意義。當(dāng)前23頁，總共39頁。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物培養(yǎng)的不同點(diǎn)a.動(dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，適應(yīng)環(huán)境能力差；b.生長速度緩慢，易受微生物污染，培養(yǎng)時(shí)需要抗生素；c.大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞需附著在固體或半固體的表面生長；d.對營養(yǎng)要求嚴(yán)格；e.大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)，不可簡單地套用微生物培養(yǎng)的經(jīng)驗(yàn)。當(dāng)前24頁，總共39頁。

第三節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動(dòng)物細(xì)胞生長十分緩慢，并易為大多數(shù)微生物污染物所破壞。支原體對動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的威脅最大，因?yàn)槠涓腥玖?qiáng)且不易檢出。因此，大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)成功的必要條件是要有一個(gè)設(shè)備精良的細(xì)胞庫。在細(xì)胞庫中的冷凍細(xì)胞不受污染。當(dāng)前25頁，總共39頁。

第三節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的配方十分復(fù)雜，并且還需補(bǔ)充血清。原料的質(zhì)量控制和培養(yǎng)基的生產(chǎn)是大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的主要問題。因?yàn)檠鍋碓蠢щy，質(zhì)量不穩(wěn)定，殘留血清給產(chǎn)物提純帶來困難等。當(dāng)前26頁，總共39頁。第三節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)主要用于生產(chǎn)下列功能蛋白質(zhì)：疫苗激素多肽生長因子酶單克隆抗體非抗體免疫調(diào)節(jié)劑狂犬病疫苗——培養(yǎng)VERO（非洲綠猴腎細(xì)胞）生產(chǎn)重組人白細(xì)胞干擾素當(dāng)前27頁，總共39頁。一、動(dòng)物細(xì)胞的特性（1）沒有細(xì)胞壁，細(xì)胞適應(yīng)能力差，十分脆弱。（2）體積比微生物大，比植物細(xì)胞稍小。（3）相互粘連以集群形式存在。（4）營養(yǎng)要求復(fù)雜，培養(yǎng)基一般要添加血清。當(dāng)前28頁，總共39頁。二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)（1）主要用于功能蛋白質(zhì)和多肽的生產(chǎn)（2）生長較慢，15-100h（3）需要添加抗生素以防染菌（4）無細(xì)胞壁，體積較大，對剪切力敏感，要求嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件如通風(fēng)、攪拌、pH、滲透壓等（5）大部分動(dòng)物細(xì)胞有錨地依賴性，需要貼壁培養(yǎng)（6）培養(yǎng)基成分復(fù)雜，分離純化復(fù)雜，成本較高，多用于高價(jià)值藥物的生產(chǎn)（7）原代細(xì)胞培養(yǎng)50代之后即會(huì)退化死亡，需要重新分離細(xì)胞當(dāng)前29頁，總共39頁。三、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方式1、懸浮培養(yǎng)：血液細(xì)胞等對剪切力敏感2、貼壁培養(yǎng)：上皮、成纖維細(xì)胞等。滾瓶培養(yǎng)微載體培養(yǎng)3、固定化細(xì)胞培養(yǎng)吸附法包埋法培養(yǎng)瓶CGIII-12懸浮、貼壁培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶機(jī)當(dāng)前30頁，總共39頁。細(xì)胞培養(yǎng)微載體系統(tǒng)當(dāng)前31頁，總共39頁。四、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制工藝流程：制備細(xì)胞懸液→接種→培養(yǎng)→收集培養(yǎng)液→分離純化目的物當(dāng)前32頁，總共39頁。培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的步驟1.無菌取出目的細(xì)胞所在的組織用培養(yǎng)液漂洗干凈；2.用無菌刀割掉多余部分并切成小組織塊；3.小組織塊置于解離液中離散細(xì)胞；4.低速離心洗滌細(xì)胞后，將目的細(xì)胞吸移到培養(yǎng)瓶中。當(dāng)前33頁，總共39頁。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)當(dāng)前34頁，總共39頁。小鼠組織塊，用胰蛋白酶處理后變成單個(gè)細(xì)胞，24h后（貼壁生長）的成纖維細(xì)胞當(dāng)前35頁，總共39頁。（一）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的組成成分氨基酸：必需氨基酸谷氨酰胺作碳源及能源維生素血清提供或補(bǔ)充B族維生素、Vc等無機(jī)鹽調(diào)節(jié)滲透壓、提供必需元素等葡萄糖作碳源及能源激素維持正常的分裂與代謝（血清提供或添加）生長因子血清提供或添加當(dāng)前36頁，總共39頁。（二）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的配制自制：配制母液并過濾除菌備用無血清培養(yǎng)基特定營養(yǎng)成分的添加購買：商品化培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)用小牛血清無血清動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基Wako(和光純藥)細(xì)胞培養(yǎng)無血清培養(yǎng)基SericinGIT當(dāng)前37頁，總共39頁。（三）溫度的控制溫度影響生長與代謝36.