藥品微生物限度檢查法

藥品微生物限度檢查法第一頁，共四十八頁，2022年，8月28日微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原、輔料受微生物污染程度的方法，也是評價生產(chǎn)企業(yè)的藥用原料、輔料、設(shè)備、器具、工藝流程、環(huán)境和操作者衛(wèi)生狀況的重要手段和依據(jù)。檢查項目包括染菌量及控制菌檢查。2023/3/92第二頁，共四十八頁，2022年，8月28日微生物限度檢查法起草的指導(dǎo)思想較完善檢查法：也是目前國際上常用的一種方法。是以瓊脂平板上的細(xì)菌、霉菌或酵母菌形成的一個獨立可見的菌落為計數(shù)依據(jù)。該法測定結(jié)果只反映在規(guī)定條件下所生長的細(xì)菌、霉菌和酵母菌的菌落數(shù)。增加試驗的可操作性

使方法更具科學(xué)性，保證檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。2023/3/93第三頁，共四十八頁，2022年，8月28日檢驗全過程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，在環(huán)境潔凈度10000級和局部潔凈度100級單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，以防止再污染。單向流空氣區(qū)域、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期按中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T16292～16294-1996《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》進(jìn)行潔凈度驗證。

操作環(huán)境2023/3/94第四頁，共四十八頁，2022年，8月28日潔凈級別潔凈級別塵粒數(shù)/m3浮游菌個/m2沉降菌個/0.5h微粒直徑≥0.5um微粒直徑≥5um100≤3,500≤0≤5≤110000≤350,000≤2000≤100≤3100000≤3,500,000≤20,000≤500≤102023/3/95第五頁，共四十八頁，2022年，8月28日檢驗量檢驗量即一次試驗所用的供試品量（g、ml或cm2）一般應(yīng)隨機抽取不少于檢驗用量（兩個以上最小包裝單位）的3倍量供試品。除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗量為10g或10ml；中藥膜劑為50cm2貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。要求檢查沙門菌的供試品其檢驗量應(yīng)增加10g或10ml2023/3/96第六頁，共四十八頁，2022年，8月28日供試液的制備根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需用水浴加溫時，溫度不應(yīng)超過45℃。供試液從制備至加入檢驗用培養(yǎng)基，不得超過1小時。除另有規(guī)定外，常用的供試品制備方法如下：2023/3/97第七頁，共四十八頁，2022年，8月28日（1）液體供試品取供試品10ml,加稀釋劑至100ml中混勻，作為1:10供試液。水溶性液體制劑可用混合的供試品原液直接作為供試液。（2）固體、半固體或黏稠性供試品取供試品10g加稀釋劑至100ml中，用勻漿儀或其它適宜的方法，混勻后，作為1:10供試液。

供試液的制備2023/3/98第八頁，共四十八頁，2022年，8月28日非水溶性供試品取供試品5g(5ml)，加入司盤805g、單硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯8010g的無菌溶化混合物（溫度低于45℃）的燒杯中，用無菌玻棒攪拌成團(tuán)后，慢慢加入45℃左右的稀釋劑至100ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1:20供試液。特殊供試液制備方法2023/3/99第九頁，共四十八頁，2022年，8月28日特殊供試液制備方法

取供試品10g，加至含玻璃珠和20ml的無菌十四烷酸異丙酯的容器中，充分振搖，使供試品溶解，再加入約45℃的稀釋劑，振搖5-10分鐘，萃取，待油水明顯分層，取其水層作為1:10供試液。十四烷酸異丙酯的滅菌方法：采用薄膜過濾法除菌，選用孔徑為0.22um的脂溶性濾膜，在140℃干熱滅菌2小時。2023/3/910第十頁，共四十八頁，2022年，8月28日特殊供試液制備方法非水溶性膜劑供試品取50cm2,剪碎，加適量的稀釋劑（通常為每1ml或每2ml含1cm2）,浸泡，振搖，以供試品浸液作為1:10或1:20供試品。2023/3/911第十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日特殊供試液制備方法

腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品取供試品10g，加至100mlpH6.8磷酸鹽緩沖液（腸溶制劑）中或pH7.6磷酸鹽緩沖液（結(jié)腸制劑），置45℃水浴中，振搖，使溶解，作為1:10的供試液。2023/3/912第十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日特殊供試液制備方法

具抑菌活性的供試品當(dāng)供試品有抑菌活性時，應(yīng)消除其抑菌活性后，再依法檢查。常用的方法有：培養(yǎng)基稀釋法離心沉淀集菌法3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，500轉(zhuǎn)/分離心5分薄膜過濾法中和法2023/3/913第十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日菌數(shù)報告規(guī)則

細(xì)菌數(shù)酵母菌平均菌落數(shù)在30-300，霉菌平均菌落數(shù)在30-100之間的稀釋級作為菌數(shù)報告的依據(jù)。當(dāng)僅有１個稀釋級的菌落數(shù)符合上述規(guī)定，以該級的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。2023/3/914第十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日菌數(shù)報告規(guī)則

當(dāng)同時有2個稀釋級的菌落數(shù)符合上述規(guī)定時，視兩者比值（比值為高稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值除以低稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值）而定。若比值不大于2，以兩稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的均值報告菌數(shù)；若比值大于2但不超過5時，以低稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。當(dāng)出現(xiàn)比值大于5或高稀釋級的菌落數(shù)大于或等于低稀釋級的菌落數(shù)等異常情況時，應(yīng)查明原因再行檢查，必要時，應(yīng)進(jìn)行方法的重新驗證。2023/3/915第十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日菌數(shù)報告規(guī)則當(dāng)各稀釋級的平均菌落數(shù)均小于30，以最低稀釋級的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。各稀釋級的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均菌落數(shù)小于1時，以＜1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。2023/3/916第十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日菌數(shù)報告規(guī)則各各稀釋級菌落平均數(shù)比值菌落數(shù)報告1：101：102

1：103不可計不可計不可計39240.5164295271411902046604－1.62.210.2－－164003775027100異常2405160003800027000240＜102023/3/917第十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日操作要點一個細(xì)菌、霉菌或酵母菌的菌落均可由一個或多個菌細(xì)胞生長繁殖而成，因此供試品中所測得的菌落數(shù)，實際為菌落形成單位數(shù)（colonyformingunity,cfu）·供試品檢驗的全過程必須符合無菌技術(shù)要求。培養(yǎng)基、稀釋劑、實驗器具等的滅菌，按滅菌法（見附錄）的要求采用驗證合格的滅菌程序滅菌。2023/3/918第十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日操作要點作供試品稀釋時，每一稀釋級都要更換吸管?！ぜ?xì)菌培養(yǎng)48h，真菌培養(yǎng)72h，計數(shù)。如菌落極小，不易辨認(rèn)可適當(dāng)延長培養(yǎng)時間。再點計菌落數(shù)。含蜂蜜、王漿的液體制劑，用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基測定霉菌數(shù)，用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基測定酵菌數(shù)，并且合并計數(shù)。若同一稀釋級兩個平板的菌落平均數(shù)不小于15，則兩個平板的菌落數(shù)不能相差1倍或以上。使用滅菌吸管時，管尖不要接觸可能污染的任何容器或用具。供試液稀釋及注皿時應(yīng)振搖后取均勻的供試液，以免造成實驗誤差。2023/3/919第十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日操作要點培養(yǎng)基的分裝量不得超過容器的2/3以免滅菌時溢出。包裝時，塞子必須塞緊，以免松動或脫落造成染菌?！づ囵B(yǎng)基配制后應(yīng)在2h內(nèi)滅菌，避免細(xì)菌繁殖?！缇蟮呐囵B(yǎng)基應(yīng)保存在2-25℃防止被污染，可在三周內(nèi)用畢。已溶化的培養(yǎng)基應(yīng)一次用完，一般開啟后不宜再用，更不要反復(fù)加熱溶化注皿時培養(yǎng)基應(yīng)在45±1℃，高于45℃時易造成細(xì)菌受損或致死，低于45℃時易凝固，影響混勻，因此使用前可用水浴保溫效果較好。傾注培養(yǎng)基于平皿中與樣品搖勻時，切勿濺到皿蓋邊和皿蓋上，以免影響實驗結(jié)果。2023/3/920第二十頁，共四十八頁，2022年，8月28日操作要點采用薄膜過濾法時，水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml，沖洗液、沖洗量及沖洗方法同方法驗證試驗。每片濾膜的總過濾量不宜過大，以避免濾膜上的微生物受損傷。2023/3/921第二十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日操作要點●每張濾膜取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液直接過濾或加至適量稀釋劑中混勻，過濾，用適宜的沖洗液沖洗濾膜，沖洗方法及沖洗量同“計數(shù)方法的驗證”，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜，濾膜貼于平板上時不得有空隙或氣泡，否則影響微生物生長。

2023/3/922第二十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日操作要點

·菌落數(shù)在100以內(nèi)時按實有數(shù)據(jù)報告。菌落數(shù)大于100時，取兩位有效數(shù)字報告，第三位按數(shù)字修約規(guī)則處理。2023/3/923第二十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日異常情況處理菌落蔓延：培養(yǎng)中由于一些菌落蔓延生長而影響另一些菌落生長，甚至掩蓋了另一些菌落，干擾計數(shù)。原因：有動力和培養(yǎng)環(huán)境濕度過大造成，給動力菌造成泳動的條件，促使形成蔓延菌落機會增多。2023/3/924第二十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日加TTC：于傾注培養(yǎng)基前，在每1000ml營養(yǎng)瓊脂內(nèi)加入滅菌1%TTC溶液1ml混勻后傾注平皿。開蓋干燥：將已凝固的瓊脂平板開蓋，倒置斜放于凈化工作臺上，開機1-2h后合蓋，再放培養(yǎng)箱中防止方法2023/3/925第二十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日防止方法換陶瓦蓋：將已凝固的瓊脂平板蓋換上新近干熱滅菌的陶瓦蓋。2023/3/926第二十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日異常菌數(shù)報告

在特殊情況下，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長的霉菌、酵母菌多于玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上菌落數(shù)則以營養(yǎng)瓊脂平板的霉菌、酵母菌菌落數(shù)報告，反之如玫瑰紅鈉瓊脂平板生長了細(xì)菌，且多于營養(yǎng)瓊脂平板的菌落數(shù)，則以玫瑰紅鈉瓊脂平板的細(xì)菌數(shù)報告2023/3/927第二十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日

控制菌的檢查大腸埃希菌檢驗程序供試品→供試液

↓不少于100ml的膽鹽乳糖增菌液

↓35~37℃18~24h取0.2ml

↓5mlMUG培養(yǎng)基中

↓35~37℃5、24h366nm紫外光下觀察↓加靛基質(zhì)試劑┌────────────┐MUG陽性，靛基質(zhì)陽性MUG陰性，靛基質(zhì)陽性MUG陰性，靛基質(zhì)陰性MUG陽性，靛基質(zhì)陰性↓↓取膽鹽乳糖培養(yǎng)液劃線報告曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板↓36±1℃18~24h

┌────────────┐

陽性陰性↓↓鏡檢、適宜的生化試驗報告↓2023/3/928第二十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日大腸埃希菌檢驗程序

供試品→供試液

↓不少于100ml的膽鹽乳糖增菌液

↓35~37℃18~24h取0.2ml

↓5mlMUG培養(yǎng)基中

↓35~37℃5、24h366nm紫外光下觀察↓加靛基質(zhì)試劑┌────────────┐MUG陽性，靛基質(zhì)陽性MUG陰性，靛基質(zhì)陽性MUG陰性，靛基質(zhì)陰性MUG陽性，靛基質(zhì)陰性↓↓取膽鹽乳糖培養(yǎng)液劃線報告曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板↓36±1℃18~24h

┌────────────┐

陽性陰性↓↓鏡檢、適宜的生化試驗報告↓報告2023/3/929第二十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日注意事項配制MUG培養(yǎng)基時，務(wù)必校正pH值，滅菌后pH不得過7.4否則pH值偏高，MUG分解本身則顯熒光。供試品培養(yǎng)液接種于MUG培養(yǎng)基中，培養(yǎng)時間一般在4h、24h觀察是否產(chǎn)生熒光，如熒光很微弱，不能準(zhǔn)確判斷時，可延長培養(yǎng)時間至48h再觀察結(jié)果。由于大腸埃希菌各菌株間的GUD的活性不完全相同，對底物和底物的濃度反應(yīng)的差異；培養(yǎng)基中選擇因子的影響；培養(yǎng)時間、溫度；pH的改變；大量競爭菌和樣品本身物質(zhì)成分的干擾等，對結(jié)果的判斷亦有影響。2023/3/930第三十頁，共四十八頁，2022年，8月28日注意事項觀察供試品MUG管時，可與陽性對照管、陰性對照管同時在366nm紫外燈下觀察。在曙紅亞甲藍(lán)瓊脂或麥康凱瓊脂平板上生長的可疑菌落，務(wù)必挑選2-3個以上菌落分別做IMViC試驗鑒別。在IMViC試驗中，以滅菌接種環(huán)沾取菌苔，首先接種于枸椽酸鹽瓊脂斜面上，然后再接種于蛋白胨水等其它培養(yǎng)基上，切務(wù)將培養(yǎng)基帶入枸椽酸鹽瓊脂斜面上，以免產(chǎn)生假陽性結(jié)果。2023/3/931第三十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日大腸菌群大腸菌群作為水質(zhì)糞便污染的指示菌已有80多年歷史。大腸菌群的定義：是指37℃生長時能發(fā)酵乳糖，在24h內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭陰性無芽孢桿菌，符合上述定義的細(xì)菌除大腸埃希氏桿菌屬外，還包括腸桿菌科的腸桿菌屬、枸椽酸菌屬、克雷伯菌屬等，實際上基本包括人和了正常家畜腸道內(nèi)的全部需氧的革蘭陰性桿菌，較大腸埃希菌更具代表性，且存活時間較長。故檢出大腸埃希菌，一般認(rèn)為藥品受糞便的近期污染；而檢出大腸菌群，則表示藥品受糞便的近期或遠(yuǎn)期污染。以大腸菌群作為口服藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)的控制菌，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義，更能反映藥品的衛(wèi)生質(zhì)量。2023/3/932第三十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日操作方法取乳糖膽鹽發(fā)酵管3支，分別加入1:10供試液1ml(供試品量0.1g或0.1ml),1:100供試液1ml(供試品量0.01g或0.01ml),1:1000供試液1ml（供試品量0.001g或0.001ml），同時作陰性對照，各管置36±1℃培養(yǎng)18-24h,陰性對照應(yīng)無菌生長。2023/3/933第三十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日結(jié)果判斷

乳糖膽鹽發(fā)酵管若無菌生長，或有菌生長但不產(chǎn)酸產(chǎn)氣（或產(chǎn)酸不產(chǎn)氣）→報告未檢出大腸菌群；如有產(chǎn)酸產(chǎn)氣，應(yīng)做確證試驗，將產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管劃線接種于EMB或麥康凱瓊脂平板上培養(yǎng)18-24h，如平板上無菌落生長可判該管未檢出大腸菌群。如平板上有菌落生長并與藥典所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，鏡檢為革蘭陰性無芽孢桿菌的菌落，應(yīng)取上述平板上的可疑菌落4-5個各接種1支乳糖發(fā)酵管，培養(yǎng)24－48h,凡產(chǎn)酸產(chǎn)氣，革蘭陰性無芽孢桿菌，判該管檢出大腸菌群，反之判該管未檢出大腸菌群。2023/3/934第三十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日沙門菌檢驗程序供試品10g(10ml)

↓200ml的營養(yǎng)肉湯中

↓35~37℃18~24h四硫磺酸鹽增菌液

↓35~37℃18~24hDHL，EMB或MacC↓35~37℃18~24h┌────────────┐無典型菌落三糖鐵瓊脂（TSI）↓↓35~37℃18~24h報告┌────────────┐斜面未見紅色（斜面黃色）斜面紅色（黃色）底層未見黃色（底層無黑色）底層黃色（黑色）↓↓血清凝集、生化試驗報告2023/3/935第三十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日注意事項

①在作氰化鉀試驗時，應(yīng)注意密封管口，夏天分裝培養(yǎng)基宜在冰浴中進(jìn)行，防止氰化鉀分解，產(chǎn)生氫氰酸逸出，致使培養(yǎng)基內(nèi)氰化鉀濃度降低，不能抑制細(xì)菌生長，造成假陽性。②氰化鉀為劇毒品，操作時須謹(jǐn)慎，用后培養(yǎng)基每管加數(shù)粒硫酸亞鐵和20%氫氧化鉀0.5ml去毒，然后再滅菌、洗滌。2023/3/936第三十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日銅綠假單胞菌檢驗程序

供試品

↓

供試液↓BL增菌液↓35~37℃18~24h溴代十六烷三甲胺平板

↓35~37℃18~24h氧化酶、革蘭染色鏡檢↓┌────────────┐氧化酶陰性氧化酶陽性非革蘭陰性無芽孢桿菌革蘭陰性無芽孢桿菌↓↓綠膿菌素報告┌────────────┐綠膿菌素陽性綠膿菌素陰性↓↓生化試驗報告2023/3/937第三十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日注意事項

銅綠假單胞菌污染藥品后，因生產(chǎn)工藝和藥物的影響，在溴代十六烷基三甲胺平板上的菌落形態(tài)可產(chǎn)生非典型形態(tài)。為防止漏檢，在挑取疑似菌落時，宜取2~3個以上菌落，分別進(jìn)行檢驗，以提高銅綠假單胞菌的檢出率。做氧化酶試驗時，試驗菌苔必須新鮮，陳舊培養(yǎng)物反應(yīng)不可靠試驗應(yīng)避免與鐵、鎳等金屬接觸，不可用普通接種針（環(huán)）（白金材料除外），挑取菌苔，否則易出現(xiàn)假陽性。宜用玻璃棒或木棒。2023/3/938第三十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日注意事項試劑宜新鮮配制，放置過久，二鹽酸二甲基對苯二胺氧化變色不可用。該反應(yīng)需在有氧條件下進(jìn)行，勿滴加試劑過多，以免浸沒培養(yǎng)物，使之與空氣隔絕，造成假陰性反應(yīng)。綠膿菌素是銅綠假單胞菌鑒定的重要特征，但色素的產(chǎn)生受許多因素的影響，除菌株差異及變異外，培養(yǎng)條件是重要因素，溫度、培養(yǎng)基成分等皆可影響色素產(chǎn)生。培養(yǎng)基中瓊脂、蛋白胨等均應(yīng)事先測試，選用適宜品牌，實驗時并用陽性菌株作對照試驗。2023/3/939第三十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日金黃色葡萄球菌檢驗程序供試品

↓

供試液↓營養(yǎng)肉湯（亞碲酸鈉肉湯）↓35~37℃18~24h卵黃氯化鈉平板或甘露醇氯化鈉平板

↓35~37℃18~24h┌────────────┐無菌落營養(yǎng)瓊脂斜面↓↓35~37℃18~24h報告血漿凝固酶試驗，革蘭染色鏡檢2023/3/940第四十頁，共四十八頁，2022年，8月28日注意事項

金黃色葡萄球菌在上述三種分離培養(yǎng)基上的典型菌落為金黃色。但由于受藥物影響或非典型菌株存在，可呈橙黃色、檸檬色或白色。做控制菌檢查，對非典型菌落也有必要進(jìn)行凝固酶試驗做金黃色葡萄球菌的篩查，以防漏檢金黃色葡萄球菌。培養(yǎng)基存放時間和培養(yǎng)時間影響色素產(chǎn)生，故培養(yǎng)基應(yīng)新鮮配制。培養(yǎng)時間宜48h以上。做血漿凝固酶試驗應(yīng)用新鮮培養(yǎng)物及新鮮血漿。如用舊培養(yǎng)物及血漿易導(dǎo)致假陰性反應(yīng)。此外，觀察結(jié)果時不宜搖動試管，因凝固初期凝塊不結(jié)實易破壞，引起假陰性反應(yīng)。2023/3/941第四十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日梭菌的檢驗程序供試液10ml2份（1份置80℃水浴保溫10分）↓100ml皰肉培養(yǎng)基↓厭氧培養(yǎng)72~96h┌────────────┐未渾濁、產(chǎn)氣、消化碎肉、臭氣0.2ml↓↓報告含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂平板↓厭氧培養(yǎng)48~72h┌────────────┐無菌生長過氧化氫酶試驗↓↓