花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)演示文稿

花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)演示文稿當(dāng)前1頁，總共51頁。（優(yōu)選）花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)當(dāng)前2頁，總共51頁?；ǖ慕Y(jié)構(gòu)當(dāng)前3頁，總共51頁。當(dāng)前4頁，總共51頁。四分體:醋酸洋紅染色四分體:Alexander’s染色單核期雙核期成熟花粉粒處于不同發(fā)育時(shí)期的煙草小孢子當(dāng)前5頁，總共51頁?；ㄋ幨腔ǖ男坌云鞴伲ㄋ幣囵B(yǎng)屬器官培養(yǎng)；花粉是單倍體細(xì)胞，花粉培養(yǎng)與單細(xì)胞培養(yǎng)相似花藥和花粉都可以在培養(yǎng)過程中誘導(dǎo)單倍體細(xì)胞系和單倍體植株。單倍體植株經(jīng)過染色體加倍就成為純合二倍體植株，這樣可縮短育種周期，獲得純系?；ㄅ嘁殉蔀橹参镉N的一種重要手段。

一、概述當(dāng)前6頁，總共51頁。植物的花粉是花粉母細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂形成的，其染色體數(shù)目只有體細(xì)胞的一半，叫做單倍體細(xì)胞(haploidcell)?；ǚ酆突ㄋ幍呐囵B(yǎng)(pollenandantherculture)是指花粉在培養(yǎng)基上改變其正常發(fā)育和機(jī)能，不經(jīng)受精而發(fā)生細(xì)胞分裂，由單個(gè)花粉粒發(fā)育成完整植株的技術(shù)。用離體培養(yǎng)花藥的方法使花粉發(fā)育成一個(gè)完整的植株，叫做單倍體植物(haplobiont)。一、概述當(dāng)前7頁，總共51頁?；ㄋ幣囵B(yǎng)是將花粉發(fā)育至一定階段的花藥接種到人工培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，以形成花粉胚或愈傷組織進(jìn)而分化成植株的技術(shù)。兩者的異同點(diǎn)培養(yǎng)目的相同，均獲得小孢子植株。花藥培養(yǎng)屬于器官培養(yǎng)；而花粉培養(yǎng)屬于細(xì)胞培養(yǎng)。花粉培養(yǎng)沒有藥壁組織干擾；可計(jì)數(shù)小孢子產(chǎn)胚率；可觀察雄核發(fā)育的全過程；單倍體產(chǎn)量高。但技術(shù)更復(fù)雜。當(dāng)前8頁，總共51頁。花藥或花粉培養(yǎng)的作用：供體植株小孢子（n）花培花粉植株（n）雄核發(fā)育自然加倍人工加倍純合植株DH（2n）一年內(nèi)獲得純系1、作物育種（1）縮短育種周期：常規(guī)育種需4-6年獲得純系，而小

孢子培養(yǎng)僅需一年。當(dāng)前9頁，總共51頁。大大縮短育種周期通過多次自交或近交獲得的幾乎是同質(zhì)結(jié)合的品系單倍體植株再通過某種手段使染色體組加倍（如秋水仙素處理）從而使植物恢復(fù)正常染色體數(shù)當(dāng)前10頁，總共51頁。例子：二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基因?yàn)锳Abb的純合單株常規(guī)方法：AAbb出現(xiàn)的概率為1/16，并且不能將AAbb與Aabb、aAbb區(qū)分開。

（2）提高了目標(biāo)基因型的選擇效率

AB

aB

Ab

abAB AABB AaBB AABb AaBbaB aABB aaBB aABb aaBbAb AabB AabB AAbb

Aabbab aAbB aabB aAbb aabb當(dāng)前11頁，總共51頁。例子：二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基因?yàn)锳Abb的純合單株單倍體方法：AAbb出現(xiàn)的概率為1/4。

（2）提高了目標(biāo)基因型的選擇效率

單倍體

二倍體

AB-------------------------->AABB

aB---------------------------->aaBB

Ab---------------------------->AAbb ab---------------------------->

aabb供體親本AaBb花培當(dāng)前12頁，總共51頁。

植株不受顯隱性的影響，在誘變育種中能在當(dāng)代及時(shí)獲得突變個(gè)體，加倍后成為穩(wěn)定的純系。

（3）誘變育種中的作用

當(dāng)前13頁，總共51頁。2、物種進(jìn)化研究可探索親本染色體組的構(gòu)成。分析單倍體植物減數(shù)分裂時(shí)，形成二價(jià)體的數(shù)目和形狀，能確定染色體組內(nèi)是否存在同源染色體。

3、遺傳分析單倍體植株中基因不受顯隱性的影響，每一個(gè)基因的作用均能表現(xiàn)出來。能用來研究基因的性質(zhì)及其作用。還可用于基因的劑量效應(yīng)分析。4、構(gòu)建連鎖圖譜雙單倍體（DH）群體是永久性群體，能有效地用于遺傳圖譜的構(gòu)建5、用于遺傳轉(zhuǎn)化能直接表達(dá)外源基因，不受顯隱性影響當(dāng)前14頁，總共51頁。

花藥培養(yǎng)簡(jiǎn)史1964年：印度學(xué)者古哈(Guha)和馬斯瓦瑞（Maheswari）將南洋金花花藥培養(yǎng)發(fā)育成胚1967年：包金(Bourgin)和尼奇(Nitsch)花藥培養(yǎng)獲得煙草植株1973年：我國(guó)首次報(bào)道了小麥花藥培養(yǎng)獲得再生植株目前：許多農(nóng)作物及經(jīng)濟(jì)植物通過花粉培養(yǎng)都能誘導(dǎo)成植株當(dāng)前15頁，總共51頁?；ㄋ幣囵B(yǎng)的主要目的，是培育花粉粒的單倍體植株，并使單倍體加倍，作為育種材料的來源。利用雜種花藥離體培養(yǎng)獲得的再生植株，由不同基因型的配子發(fā)育而來，具有豐富的變異類型，選擇出有利的變異類型，經(jīng)過經(jīng)濟(jì)性狀鑒定后，選出優(yōu)良者直接用于生產(chǎn)或配制雜交組合，獲得優(yōu)良雜交種子。構(gòu)建永久性分離群體－雙單倍體系（Doubledhaploid)，用于基因定位。雙單倍體：是指單倍體細(xì)胞（花粉或卵細(xì)胞）經(jīng)過人工或自發(fā)加倍后得到雙單倍體細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化可發(fā)育為單雙倍體植株。

花藥培養(yǎng)與單倍體育種當(dāng)前16頁，總共51頁。

1、胚狀體發(fā)育途徑 小孢子經(jīng)歷胚發(fā)生的各個(gè)階段，最后子葉展開，形成花粉植株。2、愈傷組織發(fā)育途徑小孢子分裂數(shù)次形成愈傷，再分化形成花粉植株。此途徑產(chǎn)生的植株會(huì)出現(xiàn)變異且倍性復(fù)雜?；ǚ壑仓晷螒B(tài)發(fā)生方式當(dāng)前17頁，總共51頁。胚狀體發(fā)育途徑部分花藥通過胚狀體途徑形成小植株煙草花藥培養(yǎng)當(dāng)前18頁，總共51頁。通過胚狀體途徑再生形成小植株煙草花藥培養(yǎng)當(dāng)前19頁，總共51頁。胚狀體發(fā)育途徑a)球形胚d)魚雷形胚蕓苔屬小孢子培養(yǎng)當(dāng)前20頁，總共51頁。愈傷組織發(fā)育途徑部分花藥產(chǎn)生愈傷組織接種在平板上的水稻花藥水稻花藥培養(yǎng)當(dāng)前21頁，總共51頁。愈傷組織轉(zhuǎn)接種到再生培養(yǎng)基愈傷組織分化形成再生植株水稻花藥培養(yǎng)當(dāng)前22頁，總共51頁?；ㄋ幣囵B(yǎng)1、取材鏡檢，根據(jù)花粉的發(fā)育時(shí)期，選取大小適宜的花蕾。

2、消毒

70％酒精擦洗花蕾表面，或70％酒精浸泡30-60s后在1％次氯酸鈉溶液中浸泡10-20min或在0.1％的氯化汞溶液中消毒3-10min，無菌水沖洗3-5次。3、培養(yǎng)固體或液體培養(yǎng)基均可。先進(jìn)行脫分化培養(yǎng)，至小孢子大量分裂形成胚或愈傷，并突破花藥壁表面，形成突出物（2-3周）；后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，形成小植株。當(dāng)前23頁，總共51頁?；ǚ叟囵B(yǎng)(一)花粉的分離與純化1、自然散落法(漂浮培養(yǎng)散落小孢子收集法)

將花藥接種在預(yù)處理液或液體培養(yǎng)基上，待花粉自動(dòng)散落后，收集培養(yǎng)。2、擠壓法在燒杯或研缽中擠壓花藥，將花粉擠出后收集培養(yǎng)。3、機(jī)械游離（1）磁攪拌法用磁力攪拌器攪拌培養(yǎng)液中的花藥，使花粉游離出來；（2）超速旋切法通過攪拌器中的高速旋轉(zhuǎn)刀具破碎花蕾、穗子、花藥，使小孢子游離出來（此法應(yīng)用最廣）。4、小孢子純化對(duì)上述方法獲得的小孢子混合物進(jìn)行分級(jí)過篩、梯度離心處理純化小孢子當(dāng)前24頁，總共51頁。梯度離心前（小孢子形態(tài)、活力不一致）30%蔗糖梯度離心后（獲得均一的小孢子群體）當(dāng)前25頁，總共51頁。(二)花粉培養(yǎng)方式1、平板培養(yǎng)花粉置瓊脂固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。2、液體培養(yǎng)花粉懸浮在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，需震蕩，以利通氣。3、雙層培養(yǎng)花粉置固體-液體雙層培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)基制作方法：先鋪一層瓊脂固體培養(yǎng)基，凝固后，在表面加入少量液體培養(yǎng)基。

4、看護(hù)培養(yǎng)利用花藥或花藥愈傷組織釋放出的活性物質(zhì)促進(jìn)花粉小孢子發(fā)育。5、微室培養(yǎng)利用小的蓋玻片和凹穴載玻片形成微室進(jìn)行花粉培養(yǎng)6、條件培養(yǎng)基培養(yǎng)利用培養(yǎng)過花藥的液體培養(yǎng)基或含失活花藥提取物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)?；ㄋ帡l件培養(yǎng)基、子房條件培養(yǎng)等。當(dāng)前26頁，總共51頁?？醋o(hù)培養(yǎng)圖解當(dāng)前27頁，總共51頁。確定取材時(shí)間選擇大致處于所需要時(shí)期的花蕾。由于花粉發(fā)育時(shí)期和植株的某些外部形態(tài)特征之間的大致相關(guān)性，因此利用這些外部標(biāo)志，選擇符合條件的花蕾，經(jīng)鏡檢確定花粉發(fā)育的準(zhǔn)確時(shí)期。在水稻中，以單核靠邊期的花粉對(duì)誘導(dǎo)單倍體植株較為適宜，在外部形態(tài)上可根據(jù)葉枕距為5～15cm，穎片（禾本科植物小穗基部，由苞片轉(zhuǎn)變而成）淡黃綠色、雄蕊長(zhǎng)度接近穎片長(zhǎng)度的1/2這些條件來判斷?；ㄋ幣囵B(yǎng)技術(shù)當(dāng)前28頁，總共51頁。在培養(yǎng)基中加入活性炭能促進(jìn)花藥培養(yǎng)水稻的柱頭-花藥當(dāng)前29頁，總共51頁。選取主穗（一級(jí)側(cè)枝）的花蕾，因?yàn)橐患?jí)側(cè)枝的花蕾發(fā)育良好，數(shù)量大，發(fā)育同步。操作過程中不應(yīng)使花藥受到損傷，若受損傷，則應(yīng)淘汰，因?yàn)閾p傷常常會(huì)刺激花粉壁形成二倍體的愈傷組織。注意事項(xiàng)水稻花藥培養(yǎng)當(dāng)前30頁，總共51頁。水稻花藥培養(yǎng)旗葉鞘用70％酒精擦洗一遍剝?nèi)テ烊~鞘，取出稻穗左手持穗，右手用鑷子取出花藥，無菌培養(yǎng)皿中70％酒精，洗2遍用接種環(huán)接種到培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天后，花藥變黑褐色，20天花藥裂開，長(zhǎng)出淡黃色的花粉愈傷組織，先形成芽，后長(zhǎng)出根，形成幼苗。當(dāng)前31頁，總共51頁。光照(12~18h，5,000~10,000lx，28℃)黑暗(12-16h，22℃)周期交替進(jìn)行?；ㄋ幣囵B(yǎng)的條件當(dāng)前32頁，總共51頁。①花粉發(fā)育時(shí)期是影響培養(yǎng)效果的重要因素在誘導(dǎo)花粉進(jìn)行雄性發(fā)育(指小孢子沿孢子體途徑發(fā)育成花粉植株)過程中，不同物種花粉最適的發(fā)育時(shí)期不同，對(duì)多數(shù)植物來說，單核中期或晚期的花粉最容易形成花粉胚或花粉愈傷組織。如南洋金花、煙草和芍藥中的最適時(shí)期是第一次有絲分裂時(shí)期或稍前后，禾本科植物在單核早期(大麥)或單核中期(玉米、小麥)反應(yīng)最好，番茄在減數(shù)分裂中期時(shí)更適宜。1、影響花藥誘導(dǎo)頻率的因素當(dāng)前33頁，總共51頁。②花藥供體植株的生長(zhǎng)條件對(duì)花藥培養(yǎng)反應(yīng)的影響很大例如：水稻、小麥、大麥等禾本科植物，主莖穗比分蘗穗花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率明顯地提高，同步化程度高。當(dāng)前34頁，總共51頁。③培養(yǎng)基是花藥培養(yǎng)中影響花粉啟動(dòng)和再分化的重要條件我國(guó)科學(xué)工作者對(duì)水稻、小麥的花藥培養(yǎng)基做了改進(jìn)，研制出N6培養(yǎng)基。在N6培養(yǎng)基上，水稻花粉的出愈率大幅度提高。N6培養(yǎng)基的特點(diǎn)是銨離子濃度較低。隨后，進(jìn)一步降低銨鹽和硝酸鹽濃度，同時(shí)附加生物素，研制出C17和W14培養(yǎng)基，它們可以大幅度提高小麥的花藥出愈率。以馬鈴薯提取液為基本成分的馬鈴薯培養(yǎng)液，現(xiàn)在被廣泛地應(yīng)用于小麥花藥培養(yǎng)，效果良好。

當(dāng)前35頁，總共51頁。培養(yǎng)基中的植物生長(zhǎng)物質(zhì)的種類會(huì)影響花粉發(fā)育的途徑一般在禾本科植物中，常用1～5mg/L2,4-D或NAA誘導(dǎo)花粉愈傷組織形成，再將愈傷組織轉(zhuǎn)移至降低或去除生長(zhǎng)素或補(bǔ)加細(xì)胞分裂素類物質(zhì)的分化培養(yǎng)基上，以誘導(dǎo)器官分化和再生植株形成。當(dāng)前36頁，總共51頁。培養(yǎng)基中糖的種類對(duì)花粉胚的誘導(dǎo)和分化有顯著影響朱至清等(1990)報(bào)道在過濾滅菌的條件下，若以0.21mg/L葡萄糖取代液體培養(yǎng)基中同等濃度的蔗糖，小麥花粉胚的誘導(dǎo)頻率可增加2～10倍。一般說來，高蔗糖濃度可以抑制體細(xì)胞的生長(zhǎng)而對(duì)花粉的生長(zhǎng)無妨礙。最適蔗糖濃度：煙草的為3％水稻為3％～6％玉米則為12％～15％當(dāng)前37頁，總共51頁。以1～5℃預(yù)低溫處理小麥幼穗，能提高花粉愈傷組織的產(chǎn)量。例如，在4℃下冷凍石刁柏花蕾，預(yù)處理4天、8天和12天，愈傷組織誘導(dǎo)率比室溫對(duì)照分別提高2.4倍、1.9和1.5倍。各種植物要求預(yù)處理的溫度和時(shí)間不同。2、低溫預(yù)處理可以提高花粉胚的誘導(dǎo)頻率當(dāng)前38頁，總共51頁。小麥要求先高溫培養(yǎng)64天之后，再轉(zhuǎn)入28～30℃下培養(yǎng)。一直高溫培養(yǎng)效果并不好。較高的溫度雖能誘導(dǎo)較高頻率的花粉愈傷組織，但愈傷組織分化白化苗的頻率也高?？刂婆囵B(yǎng)溫度仍是減少白化苗的一個(gè)有效措施。培養(yǎng)溫度是影響花藥反應(yīng)的一個(gè)重要因素當(dāng)前39頁，總共51頁。3、花藥培養(yǎng)過程花藥材料的選取關(guān)鍵選取處于合適發(fā)育期的花藥，離體培養(yǎng)后才能啟動(dòng)花粉發(fā)育。實(shí)踐表明，從減數(shù)分裂期至雙核期的花藥，均有可能誘導(dǎo)離體孤雄發(fā)育。大多數(shù)園藝植物的花藥培養(yǎng)，成功率最高的時(shí)期為單核期，或單核中晚期。當(dāng)前40頁，總共51頁。黃心烏花藥培養(yǎng)甜椒花藥培養(yǎng)當(dāng)前41頁，總共51頁。草莓花藥愈傷組織再生植株花藥植株當(dāng)前42頁，總共51頁。杜蘭小麥的花藥培養(yǎng)A花藥在BAD-3誘導(dǎo)下，3周后形成胚狀體和愈傷組織B另一個(gè)花藥在BAC-1培養(yǎng)基中已愈傷組織中長(zhǎng)出葉片C

更多的花藥在BAD-3培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出愈傷組織與子葉D

從BAC-1轉(zhuǎn)移到BAD-1分化培養(yǎng)基中形成的愈傷組織E

在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-6周，愈傷組織開始分化根和綠色的新芽F

在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-8周，可形成大量的根和幼莖G在MS再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)8周后，可由最初的花藥形成小植株H由花藥形成的健壯小植株I

花藥形成的植株在同樣的MS再生培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，可因培養(yǎng)條件改變而形成不正常的植株當(dāng)前43頁，總共51頁?；ǚ壑仓耆旧w可自發(fā)加倍人工措施染色體加倍傳統(tǒng)方法是用秋水仙素處理。較大濃度的秋水仙素溶液處理單倍體植株，時(shí)間為24～96h。浸泡試管苗方法處理芽方法浸根方法單倍體植株的二倍化當(dāng)前44頁，總共51頁。花藥培養(yǎng)脫毒1974年日本：花藥培養(yǎng)可以脫除草莓病毒；花藥采取時(shí)期單核期：花蕾4-6mm，花藥1mm