第三章薄層色譜法基礎(chǔ)演示文稿

第三章薄層色譜法基礎(chǔ)演示文稿當(dāng)前1頁(yè)，總共50頁(yè)。優(yōu)選第三章薄層色譜法基礎(chǔ)當(dāng)前2頁(yè)，總共50頁(yè)。薄層色譜法通常指以吸附劑為固定相的一種液相色譜法。即將固定相在玻璃、金屬或塑料等光潔的表面上均勻地鋪成薄層，試樣點(diǎn)在薄層的一端，流動(dòng)相借毛細(xì)作用流經(jīng)固定相,使被分離的物質(zhì)展開。一.前言定義:常用的薄層色譜法以吸附劑為固定相,屬于吸附色譜的范疇繼柱色譜和紙色譜之后發(fā)展起來(lái)的方法當(dāng)前3頁(yè)，總共50頁(yè)。薄層色譜與液相色譜法比較

HPLCTLC每次只能分析一個(gè)樣品在一塊板上點(diǎn)上多個(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行分離對(duì)樣品制備要求高，必須不含可吸留在柱上的雜質(zhì)，否則柱性能受損用畢一次棄去，可直接用樣品的粗提物點(diǎn)樣可用檢測(cè)器種類較少展開后可用多種手段檢測(cè)特點(diǎn)當(dāng)前4頁(yè)，總共50頁(yè)。薄層色譜與柱層析和紙層析比較

(1)快速(數(shù)十秒~數(shù)十分鐘)(2)分離效率高(多柱路)(3)靈敏度高

(斑點(diǎn)擴(kuò)散小,比紙色譜高10-100倍)(4)顯色方法多樣(腐蝕性顯色劑)(5)圖象易保存當(dāng)前5頁(yè)，總共50頁(yè)。比移值（Rf）

Rf=原點(diǎn)至組分點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)至流動(dòng)前沿的距離組分A的Rf=a/c

組分B的Rf=b/c相對(duì)比移值，即相對(duì)于某一物質(zhì)x的Rf值，用Rx表示。其定義為：Rx＝組分的Rf值／物質(zhì)x的Rf值組分A相對(duì)于物質(zhì)B的“相對(duì)比移值”

RB=a/b二.基本參數(shù)當(dāng)前6頁(yè)，總共50頁(yè)。三.薄層色譜的操作

吸附劑的選擇薄層板的制作展開劑的選擇點(diǎn)樣展開定位與顯色

薄層層析的定量測(cè)定當(dāng)前7頁(yè)，總共50頁(yè)。(一)薄層層析用的吸附劑常用的薄層層析吸附劑有硅膠、氧化鋁、纖維素、聚酰胺等。吸附劑的選擇：首先決定于樣品成分的性質(zhì)，即它們的溶解性、酸堿性、極性以及是否與吸附劑起化學(xué)反應(yīng)等；其次要考慮吸附劑、載體是否容易得到及其價(jià)格等。當(dāng)前8頁(yè)，總共50頁(yè)。當(dāng)前9頁(yè)，總共50頁(yè)。層析板是用專門的涂布器把漿狀的吸附劑（紙漿、纖維素、硅膠、中性氧化物、聚酰胺、多孔性玻璃粉，硅烷化鍵合硅膠等）均勻地涂在在薄層板（玻璃板、金屬板或彈性塑料板）上，干燥（110℃活化）后即可使用。(二)薄層板的制作當(dāng)前10頁(yè)，總共50頁(yè)。1）洗板當(dāng)前11頁(yè)，總共50頁(yè)。2）攪拌當(dāng)前12頁(yè)，總共50頁(yè)。3）涂板 當(dāng)前13頁(yè)，總共50頁(yè)。4）晾干當(dāng)前14頁(yè)，總共50頁(yè)。(三)薄層層析中展開劑的選擇

主要根據(jù)極性的不同來(lái)選擇流動(dòng)相展開劑。各種展開劑按其極性不同排序?yàn)椋和闊N<烯烴<醚類<硝基化合物<二甲胺<酯類<酮類<醛類<硫醇<胺類<酰胺<醇類<酚類<羧酸當(dāng)前15頁(yè)，總共50頁(yè)。選擇薄層條件的簡(jiǎn)圖

圖2化合物的極性、吸附劑的活度及展開劑極性間的關(guān)系

Stahl設(shè)計(jì)的用以選擇薄層條件的簡(jiǎn)圖（1）為被分離化合物的極性（2）為吸附劑的活度（3）為展開劑的極性。若將這三個(gè)因素各自固定在圓周的三分之一，轉(zhuǎn)動(dòng)圓盤正中的三角形，如果角A指向極性物質(zhì)，則角B指向活度小的吸附劑，角C就指向選用極性展開劑；如轉(zhuǎn)到A’，B’，C’處則又要作另外的選擇組合。當(dāng)前16頁(yè)，總共50頁(yè)。

極性較大的溶劑可以使化合物在薄層上移動(dòng)。極性較小的溶劑降低極性大的溶劑的洗脫能力，使Rf值降低。中等極性的溶劑往往起著使極性相差較大溶劑混合均勻的作用。在展開劑中加入少量酸、堿可以使某些極性物質(zhì)斑點(diǎn)集中，提高分離度。用粘度太大的溶劑時(shí)需要加入一種溶劑以降低展開劑的粘度，加快展開速度。例如環(huán)己烷-丙酮-二乙胺-水（10:5:2:5）這個(gè)系統(tǒng)中，水是極性大的溶劑，環(huán)己烷是極性小的溶劑，后者的加入可以降低分離物質(zhì)的Rf值，丙酮起著混勻整個(gè)系統(tǒng)及降低展開劑粘度的作用，少量二乙胺的加入控制了展開劑的pH值以使分離后的斑點(diǎn)不致拖尾，分離清晰。多元展開劑中各種溶劑的作用當(dāng)前17頁(yè)，總共50頁(yè)。

在具體工作中，展開劑的選擇還必須進(jìn)一步通過實(shí)踐，一般可用下列三種方法：

(1)查閱文獻(xiàn)

(2)微型薄層：用小玻片鋪上薄層，用各種經(jīng)初步選擇認(rèn)為可能應(yīng)用的展開劑展開，從而選擇適當(dāng)?shù)恼归_劑，再用于一般的薄層層析。用微型薄層，節(jié)省材料和時(shí)間。

(3)微量圓環(huán)技術(shù)當(dāng)前18頁(yè)，總共50頁(yè)。

將試樣溶液點(diǎn)于已準(zhǔn)備好的薄層上，點(diǎn)成同樣大小的圓點(diǎn)，用毛細(xì)管吸取各種經(jīng)初步選擇認(rèn)為可能應(yīng)用的展開劑，加到試樣點(diǎn)中心，讓展開劑自毛細(xì)管中慢慢流出進(jìn)行展開。

微量圓環(huán)技術(shù)

1用環(huán)己烷展開

2用苯展開

3用氯仿展開微量圓環(huán)技術(shù)

當(dāng)前19頁(yè)，總共50頁(yè)。(四)點(diǎn)樣1.樣品溶液一般用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等揮發(fā)性有機(jī)溶劑，最好用與展開劑極性相似的溶劑溶解試樣，配成0.5%~1%的試液。2.點(diǎn)樣量點(diǎn)樣量的多少與薄層的性能、厚薄及顯色劑的靈敏度有關(guān)。一般來(lái)說(shuō)，樣品量最小為幾ng，常用量為幾至幾十μg，制備型的分離可以點(diǎn)樣到mg量?？傊c(diǎn)樣量隨分離目的而定。3.點(diǎn)樣方式最好是直徑3—5mm的圓點(diǎn)。當(dāng)前20頁(yè)，總共50頁(yè)。常用的點(diǎn)樣方式

a一般點(diǎn)樣b徑向點(diǎn)樣c條狀點(diǎn)樣d線形小孔點(diǎn)樣e樣品填入溝槽當(dāng)前21頁(yè)，總共50頁(yè)。

徑向展開與普通展開的區(qū)別當(dāng)前22頁(yè)，總共50頁(yè)。4.點(diǎn)樣容器

定容毛細(xì)管微量注射器點(diǎn)樣器當(dāng)前23頁(yè)，總共50頁(yè)。(五)展開1.水蒸氣的影響2.溶劑蒸氣的影響3.展開槽4.展開方式5.幾種新型的展開技術(shù)6.展開操作當(dāng)前24頁(yè)，總共50頁(yè)。1.水蒸氣的影響

在吸附薄層色譜的展開過程中，空氣的相對(duì)濕度以及展開槽中的水蒸氣必須嚴(yán)格控制，微量的水也能對(duì)色譜分離結(jié)果產(chǎn)生較大的影響。硅膠薄層板吸附水蒸氣的速度很快，0.25mm厚、20×20cm的薄層板在50%相對(duì)濕度中約3分鐘就失去活性的一半，而15分鐘時(shí)吸附的水分已達(dá)到最大值，因此，點(diǎn)樣速度的快慢，空氣相對(duì)濕度的大小，都可以影響分離以及重現(xiàn)性。適宜的相對(duì)濕度范圍也決定于溶質(zhì)和溶劑的極性。當(dāng)前25頁(yè)，總共50頁(yè)。2.溶劑蒸氣的影響

“邊緣效應(yīng)”：Stahl在用氯仿-甲醇（95：5）為展開劑展開麥角生物堿時(shí)發(fā)現(xiàn)，對(duì)同一種生物堿，在薄層板中部的Rf值比在邊緣的Rf值小，稱此現(xiàn)象為“邊緣效應(yīng)”（edgeeffect）。展開槽中被展開劑蒸氣飽和后再進(jìn)行展開就可以消除。圖5在未飽和展開槽中薄層板上出現(xiàn)的“邊緣效應(yīng)”當(dāng)前26頁(yè)，總共50頁(yè)。3.展開槽

普通展開槽雙底展開槽水平展開槽當(dāng)前27頁(yè)，總共50頁(yè)。4.展開方式(1)近水平展開：將點(diǎn)樣后的薄層板下端浸入展開劑0.5cm，薄層上端墊高使薄層與水平成5-10o的角。(2)上行展開：將點(diǎn)樣后的薄層放在盛有展開劑的直立型的展開槽中，展開劑由薄層下端借毛細(xì)管作用上升至前沿。(3)下行展開(4)雙向展開當(dāng)前28頁(yè)，總共50頁(yè)。薄層板玻璃板上涂吸附劑層SiO2Al2O3上行法薄層板層析缸展開劑層析缸展開劑濾紙條下行法薄層板當(dāng)前29頁(yè)，總共50頁(yè)。幾種新型的展開技術(shù)(1)程序蒸氣展開（Vapor-programmed，VP）(2)圓形色譜（RadialChromatography）(3)熱板色譜(HotplatesChromatography)(4)多次展開（MultipleDevelopment）(5)程序多次展開（programmedMultipleDevelopment，PMD）(6)階式展開（stepwisedevelopment）(7)梯度展開（gradientdevelopment）當(dāng)前30頁(yè)，總共50頁(yè)。6展開操作1.展開槽的密閉目的是使展開槽被展開劑蒸氣飽和并使展開劑組成不變。2.展開槽的飽和為避免“邊緣效應(yīng)”，在薄層板用展開劑蒸氣飽和有時(shí)是必要的。3.展開距離常規(guī)薄層最長(zhǎng)展距為20cm;高效薄層展距最長(zhǎng)為10cm。4.展開溫度當(dāng)前31頁(yè)，總共50頁(yè)。展距對(duì)結(jié)果的影響，硅膠HPTLC分離洋甘菊油，

a）3cm、b）5cm、c）7cm、d）9cm。展距對(duì)結(jié)果的影響當(dāng)前32頁(yè)，總共50頁(yè)。(六)薄層層析的定性檢測(cè)

展開完畢后，把薄層從層析缸中取出，用鉛筆劃出或小針刺出展開劑前緣的位置，隨即進(jìn)行顯色，以確定各個(gè)斑點(diǎn)的位置、Rf值和顯色情況，從而判斷試樣中含有哪些組分。有色物質(zhì)經(jīng)展開后呈現(xiàn)明顯的色斑，很易判斷。對(duì)于無(wú)色物質(zhì)，可根據(jù)化合物的性質(zhì)，用物理檢出法、化學(xué)檢出法、酶與生物檢出法和放射性檢出法進(jìn)行顯色。

當(dāng)前33頁(yè)，總共50頁(yè)。1物理檢出法

1.紫外光一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于未知化合物，展開后在用顯色劑以前，都應(yīng)先在紫外燈下進(jìn)行察看。紫外光常用兩種波254nm與365nm。如果化合物能吸收紫外光同時(shí)放出熒光，可用此熒光定位。

2.碘元素碘的最大特點(diǎn)是與物質(zhì)的反應(yīng)往往是可逆的，當(dāng)化合物定位以后在空氣中放置時(shí)，碘即升華揮去，可以回到組分的原來(lái)狀態(tài)，有利于薄層的進(jìn)一步處理。

3.水水可作為一種非破壞性顯色劑，用于硅膠薄層，當(dāng)許多憎水性化合物展開后，用水噴薄層板，對(duì)光觀察，在半透明的薄層板上，顯出白色不透明的斑點(diǎn)。當(dāng)前34頁(yè)，總共50頁(yè)。2.化學(xué)檢出法

化學(xué)檢出法是在薄層上使用一種或數(shù)種化學(xué)試劑與被檢出物質(zhì)反應(yīng)，生成有顏色的化合物而定位。這種試劑叫顯色劑。顯色劑一般分為兩類，即通用顯色劑和專屬性顯色劑。當(dāng)前35頁(yè)，總共50頁(yè)。1通用顯色劑

(1)濃硫酸或50%的硫酸溶液：極大多數(shù)有機(jī)物質(zhì)，噴此種顯色劑后立刻或在加熱到110—120℃并經(jīng)數(shù)分鐘后出現(xiàn)棕色到黑色斑點(diǎn)。

(2)酸堿指示劑溶液：例如0.3%溴甲酚綠甲醇溶液，在綠色背景上顯現(xiàn)黃色斑，表示是脂肪族羧酸。常用的通用顯色劑還有：5%磷鉬酸乙醇、堿性高錳酸鉀溶液、硝酸銀-氫氧化銨試劑、熒光顯色劑等。

2專屬性顯色劑

指能使某一類或少數(shù)幾類官能團(tuán)或化合物顯色的試劑。例如2%2，4-二硝基苯肼乙醇溶液噴后在120℃加熱10分鐘，醛酮在黃橙色背景上顯紅色或橙色斑。當(dāng)前36頁(yè)，總共50頁(yè)。3原位化學(xué)衍生化

在色譜分析的綜合技術(shù)中，尤其對(duì)痕量組分的檢測(cè)，衍生化反應(yīng)已成為重要手段之一。在薄層色譜中，有些化合物本身無(wú)色，又無(wú)紫外吸收與熒光，同時(shí)也找不到合適的顯色劑，或者有性質(zhì)近似的化合物共存很難分離，這時(shí)可考慮在原位進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)，使之產(chǎn)生紫外吸收、熒光、顯色，或使性質(zhì)發(fā)生較大差異以利于分離。當(dāng)前37頁(yè)，總共50頁(yè)。

4生物與酶檢出法(bioautography)

生物檢出法又稱生物自顯影法是用生物檢定法檢出薄層上具有生物效應(yīng)的物質(zhì)如抗生素的方法。基于檢出物質(zhì)的生物活性，將薄層板與已培養(yǎng)有適當(dāng)微生物的瓊脂表面接觸，并置適宜溫度的培育箱內(nèi)，經(jīng)過一段時(shí)間后觀察抑菌點(diǎn)，有抗生素斑點(diǎn)處的培養(yǎng)基微生物生長(zhǎng)受到抑制，整個(gè)瓊脂板出現(xiàn)了抑菌點(diǎn)，由此抑菌點(diǎn)可對(duì)該抗生素組分定位。酶檢出法實(shí)際上是一種酶抑制技術(shù)，用于薄層色譜檢出某些有機(jī)磷農(nóng)藥。當(dāng)前38頁(yè)，總共50頁(yè)。5放射顯影法（Autoradiography）

就是用含放射性同位素的化合物在薄層上顯示位置的方法。具體方法是使薄層上同位素的輻射線透過照相底片，顯影以后由于銀粒而顯出潛影，在一定劑量范圍內(nèi)，放射性物質(zhì)斑點(diǎn)使底片所呈暗度與斑點(diǎn)中放射性物質(zhì)的濃度成正比，因此不僅可定位，還可定量。當(dāng)前39頁(yè)，總共50頁(yè)。(七)薄層層析的定量測(cè)定

展開后，薄層分離所得斑點(diǎn)中化合物可進(jìn)一步定量，其測(cè)定方法可分為兩大類：一類為洗脫測(cè)定法，將所需測(cè)定的斑點(diǎn)中的組分用適當(dāng)溶劑洗脫，再選用適當(dāng)方法定量；另一類為直接測(cè)定法，色譜分離后，直接用肉眼觀察比較或用儀器掃描斑點(diǎn)而測(cè)定其含量。當(dāng)前40頁(yè)，總共50頁(yè)。1洗脫測(cè)定法1斑點(diǎn)的定位2斑點(diǎn)的洗脫:用吸集器將斑點(diǎn)位置的吸附吸下，然后用洗脫溶劑洗脫。3測(cè)定(1)紫外分光光度法：洗脫液調(diào)整至一定體積，在此化合物最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定。同時(shí)把樣品斑點(diǎn)相應(yīng)位置薄層吸附劑同樣取下做空白對(duì)照。(2)比色法：選擇靈敏度高、專屬性好的比色反應(yīng)測(cè)定化合物含量，是比較常用的方法。(3)其它方法：極譜、庫(kù)侖滴定、熒光測(cè)定等。當(dāng)前41頁(yè)，總共50頁(yè)。吸集器及減壓洗脫裝置

吸集器

減壓洗脫當(dāng)前42頁(yè)，總共50頁(yè)。2直接測(cè)定法1目測(cè)法樣品經(jīng)色譜分離后，直接觀察所得斑點(diǎn)的大小和顏色的深淺，并與標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下展開所得到的一系列已知不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)斑點(diǎn)相比較，而近似地判斷樣品中所測(cè)成分的含量。2測(cè)面積法展開后色譜上的斑點(diǎn)面積與化合物含量間，符合一定的線性關(guān)系。3儀器測(cè)定法當(dāng)前43頁(yè)，總共50頁(yè)。3儀器測(cè)定法

用光密度計(jì)或稱薄層掃描儀（TLCScanner）掃描定量，該方法已成為薄層定量的主要方法。

1.吸收測(cè)定法展開后的薄層，用一定波長(zhǎng)單色光束進(jìn)行掃描，記錄其吸光度的變化，得到掃描曲線。利用樣品掃描曲線上峰高或面積與標(biāo)準(zhǔn)品相比較，可得出樣品含量。

2.熒光測(cè)定法化合物本身有熒光或經(jīng)過適當(dāng)處理后生成熒光化合物者可測(cè)量其熒光強(qiáng)度而進(jìn)行定量。

3.熒光淬滅法由熒光減弱的程度測(cè)出斑點(diǎn)中化合物的含量當(dāng)前44頁(yè)，總共50頁(yè)。吸收測(cè)定法的分類

根據(jù)對(duì)光測(cè)定方式的不同，可分為三種：透射法反射法透射—反射法

透射法掃描反射法掃描

L光源；MC單色器；P薄層板；S斑點(diǎn)；