免疫增殖性疾病的免疫學檢驗

第九單元

免疫增殖性疾病免疫學檢驗免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第1頁概述免疫增殖病通常是指以漿細胞、淋巴細胞和巨噬細胞異常增生為特征疾病，其表現往往有免疫功效異常及免疫球蛋白質和量改變。與免疫學檢驗最為親密是B淋巴細胞異常增殖或其它造成免疫球蛋白異常免疫球蛋白病，免疫球蛋白病主要表現為高免疫球蛋白血癥。免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第2頁當臨床上考慮為多發(fā)性骨髓瘤、巨球蛋白血癥或其它漿細胞惡變等免疫球蛋白病時，普通先以血清蛋白區(qū)帶電泳、免疫球蛋白定量檢測或尿本－周蛋白定性作為初篩試驗。假如發(fā)覺有異常球蛋白區(qū)帶，繼而進行免疫固定電泳、免疫球蛋白亞型定量等檢測做深入定量分析和免疫球蛋白分類判定。免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第3頁試驗一

血清免疫固定電泳試驗免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第4頁試驗目標本試驗以血清免疫固定電泳試驗為例進行實習經過實習，熟悉血清免疫固定電泳試驗過程及注意事項；掌握血清免疫固定電泳檢測M蛋白基本原理與臨床意義。免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第5頁試驗原理將患者血清在瓊脂糖凝膠介質上經電泳分離后，將固定劑和各型Ig及其輕鏈抗血清加于凝膠表面各自泳道上，經孵育讓固定劑和抗血清在各自泳道對應凝膠內滲透并擴散，若有對應抗原存在，則在適當位置形成抗原抗體復合物并沉淀下來。電泳凝膠在洗脫液中漂洗，去除未結合蛋白質，僅保留貯存在凝膠內抗原抗體復合物。經染色后蛋白質電泳參考道和抗原抗體沉淀區(qū)帶被AcideViolet染色液著色。依據電泳移動距離分離出單克隆組分。免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第6頁試劑與器材AcideViolet染色液：用1L10%冰醋酸溶解AcideViolet。脫色液：用1L蒸餾水溶解CitricAcidDestain。清洗液：8L蒸餾水溶解Tris-BufferedSaline。電泳儀：spife3000全自動電泳儀。免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第7頁Spife3000全自動電泳儀免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第8頁操作步驟樣本處理：用生理鹽水將血清標本適當稀釋后備用，其中同一份血清第一泳道樣本稀釋3倍，第二至第六泳道樣本稀釋5倍。免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第9頁區(qū)帶電泳上樣

膠片準備

電泳免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第10頁沉淀反應加抗血清洗滌、烘干著色免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第11頁結果分析

對染色烘干后膠片進行判讀。將第一泳道作為血清蛋白分子量參考道，觀察第二至第六泳道有沒有對應特異性單克隆免疫球蛋白條帶。如圖12-1所表示,其中sp泳道為血清蛋白參考道，由下至上分別為白蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白。第2、3、4、5、6泳道分別為IgG、IgA、IgM、κ、λ抗血清泳道。免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第12頁免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第13頁注意事項標本需取新鮮血清進行分析，為防止抗原過剩引發(fā)帶現象，血清于加樣前應先作適當稀釋并混勻?？偯庖咔虻鞍姿剑?0g/L稀釋劑量加倍，當總免疫球蛋白水平＜5g/L稀釋劑量減半（除了ELP泳道）。一些樣本（尤其是含有冷球蛋白或冷凝膠）冷藏或冰凍后，可能變得粘稠或混濁。這種樣本可能因為擴散障礙而存在點樣問題。在這么情況下，加25μl液化劑于75μl血清中，混勻15s。然后按要求程序繼續(xù)進行。免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第14頁一些單克隆蛋白質可能因多聚體而造成全部免疫固定泳道上均出現單克隆片段。在這么情況下可加25μl還原劑（1％β-巰基乙醇）于75μl血清混勻并令其反應最少15min（至多3h)后按要求程序繼續(xù)進行。在電泳之前，凝膠與電泳槽貼合面充滿電泳介質，并確保二者之間無氣泡。免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第15頁在抗血清加入血清加樣孔后，確保血清與凝膠之間無氣泡。染色之前膠片一定要置于洗滌液中充分洗滌，以出去游離血清和抗血清成份，降低染色后凝膠背景色。免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第16頁臨床應用本法可對各類Ig及其輕鏈進行分型，最慣用于臨床常規(guī)M蛋白分型與判定。通慣用于單克隆Ig增殖病，單克隆Ig病，本周蛋白和游離輕鏈病、多組份單克隆Ig病，重鏈病、腦脊液寡克隆蛋白判別、多克隆Ig病診療和判別診療。免疫固定電泳優(yōu)點是分辨率高、敏感度高、操作周期短（僅需數小時）、結果易于分析。免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第17頁思索題結合試驗室免疫固定電泳分析系統(tǒng)，簡述血清免疫固定電泳影響原因及其克服方法。溫州醫(yī)學院陶志華免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第18頁試驗二

血清IgG定量檢測可

匯報范圍評價試驗免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第19頁可匯報范圍指能夠匯報全部結果范圍，包含兩種類型范圍，即分析測量范圍和臨床可匯報范圍。分析測量范圍指對沒有進行任何預處理（稀釋，濃縮等）標本，分析方法能夠直接測定出待測物范圍，也就是系統(tǒng)最終輸出值（活性或濃度）與被分析物活性或濃度成線性百分比范圍，它反應整個系統(tǒng)輸出特征。概述免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第20頁臨床可匯報范圍是指對臨床診療、治療有意義待測物濃度范圍。此范圍假如超出了分析測量范圍，可將標本經過稀釋、濃縮等預處理使待測物濃度處于分析測量范圍內，最終結果乘以稀釋倍數。免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第21頁試驗目標掌握血清IgG定量檢測可匯報范圍評價原理和方法學，了解血清IgG測定方法學性能。免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第22頁試驗原理因為抗原抗體反應特殊性，免疫學檢測項目應使用多點定標繪制標準曲線，在繪制標準曲線上查閱結果。因為計算機技術發(fā)展，儀器可對反應響應呈不一樣表現結果做適當處理，直接以最終計量單位方式匯報檢驗結果，在此情況下，評價患者結果可匯報范圍時，可無須再去評價響應結果真實曲線狀態(tài)，只要將樣品作不一樣程度稀釋或配制后，將預期值和實際檢測值作比較，繪制在坐標紙上應呈一條經過原點、斜率為1直線。直線所達限值即為該方法患者結果可匯報范圍。免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第23頁試劑與器材選取與檢測儀器相配套試劑、校準品及其它輔助試劑參考選取檢測系統(tǒng)中血清IgG檢測范圍選擇低濃度標本和高濃度標本免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第24頁操作步驟按標本操作規(guī)程做好項目校準、常規(guī)質控，確保檢測系統(tǒng)處于良好狀態(tài)。試驗標本配制，將血清IgG高（H）和低（L）樣品按：5L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、5H關系各自配制混合，形成系列評價試驗樣品。并計算各樣品預期值。將系列評價試驗樣品上機檢測，每標本重復檢測2~4次，結果統(tǒng)計于下表。依照稀釋關系，計算各試驗樣品預期值。按試驗要求，每個樣品做6次重復測定，得6個實測值，它們和預期值形成6對數據。免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第25頁結果分析免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第26頁觀察結果有沒有顯著數據差異，若有顯著差異時，應判斷是否為離群點。在坐標紙上，以X表示各樣品預期值，以Y表示各樣品實測值，將試驗結果點在圖上。若全部試驗點在坐標紙上呈顯著直線趨勢，用直線回歸對數據進行統(tǒng)計，得直線回歸方程Y=bX+a，若b在0.97～1.03范圍內，a靠近于0，則可直接判斷測定方法可匯報范圍在試驗已包括濃度。若b不在0.97～1.03范圍內，a較大，試著舍去某組數據，另作回歸統(tǒng)計。若縮小分析范圍后，回歸式有顯著改進，若b靠近于1，a趨于0。此時，縮小分析范圍可作為真實可匯報范圍。免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第27頁注意事項

進行可匯報范圍試驗評價樣品必須與真實標本盡可能相同，也要與真實標本含有相同基質狀態(tài)。評價樣品要5個或以上系列濃度試驗樣品，濃度范圍遍布整個預期可匯報范圍。最高濃度樣品應到達可匯報范圍上限。若收不到低值樣品，可搜集高值樣品，經系列不一樣程度稀釋，形成系列評價樣品。一天內做完本試驗，普通每個試驗樣品做2～4次重復測定。綜合全部結果作統(tǒng)計學處理。免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第28頁應仔細閱讀試劑說明書，一些檢測項目不宜用稀釋方法獲取系列濃度臨床新鮮血清標本，可采取商品質控物、校準品等。臨床可匯報范圍評價要對分析標本進行最大稀釋度評價試驗，以此作為臨床可匯報范圍上限；假如低限有臨床意義時，可增加分析標本反應量來進行檢測下限評價試驗，并以此作為臨床可匯報范圍下限。免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第29頁臨床應用可匯報范圍評價是評價在此范圍內不一樣患者標本匯報結果間比值與各標本內含有分析物確實存在這么百分比關系。免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第30頁思索題若血清IgG低值為0.5g/L（L）、高值為40.0g/L（H），請計算按：5L、4L+1H、3L+2H、1L+4H、5H關系配制系列試驗樣品理論濃度分別為多少？溫州醫(yī)學院陶志華免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第31頁病案討論

免疫增殖性疾病免疫增殖性疾病的免疫學檢驗第32頁某患者，男，48歲。主述“乏力，臉色蒼白，骨骼疼痛、背痛”六個月，體檢發(fā)覺：皮膚黏膜蒼白，不足骨骼壓痛，伴肝脾腫大。輔助檢驗發(fā)覺：（1）血象：Hb8.2g/dl，WBC血小板紅細胞、白細胞和血小板鏡檢形態(tài)學正常，分類可見幼粒、幼紅細胞，紅細胞呈緡錢狀排列；