CD在胃癌細胞SGC增殖

CD在胃癌細胞SGC增殖第1頁/共49頁報告內(nèi)容研究背景研究目標實驗方法與結(jié)果實驗結(jié)論第2頁/共49頁一、研究背景第3頁/共49頁胃癌概況

胃癌最常見的惡性腫瘤之一，惡性腫瘤致死占第二位。其惡性程度較高，轉(zhuǎn)移擴散嚴重，多數(shù)患者就診時已屬中晚期，因而死亡率較高。第4頁/共49頁MMP簡介

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個復雜的過程，其中細胞外基質(zhì)和基底膜的降解是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的重要步驟。這與細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶（extracellularmatrixmetalloproteinase，MMP）的參與密不可分。第5頁/共49頁

MMP是一個鋅離子依賴的蛋白酶家族，目前已發(fā)現(xiàn)26種。MMP的主要功能是降解細胞外基質(zhì)。腫瘤細胞利用MMP的基質(zhì)降解能力遷移到其他部位。在腫瘤與間質(zhì)交界處，MMP往往高表達。第6頁/共49頁

20世紀80年代，Biswas實驗室從人肺癌細胞株LX-1的細胞膜上分離得到了一種58kDa的糖蛋白，具有刺激成纖維細胞合成MMP-1的功能，將其命名為腫瘤膠原酶刺激因子（tumorcollagenasestimulatingfactor，TCSF）。第7頁/共49頁

進一步研究表明TCSF不僅能刺激MMP-1的產(chǎn)生，還能刺激MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-11等的產(chǎn)生，因此將其重命名為細胞外基質(zhì)金屬酶誘導因子（extracellularmatrixmetalloproteinaseinducer，EMMPRIN)。第六屆人類白細胞分化抗原協(xié)作組會議將EMMPRIN命名為CD147。第8頁/共49頁CD147的結(jié)構(gòu)

CD147屬單次跨膜糖蛋白，胞外段中的4個半胱氨酸殘基形成2個二硫鍵，構(gòu)成2個典型的半球形Ig結(jié)構(gòu)域。

第9頁/共49頁

細胞內(nèi)的CD147存在低糖基化（lowglycosylatedCD147，LG）和高糖基化（highglycosylatedCD147，HG）形式，分子量分別是32~44kDa、45~65kDa。只有HG形式能刺激MMP的產(chǎn)生。第10頁/共49頁CD147的功能

CD147是一種廣泛表達于細胞表面，在體內(nèi)分布廣泛，參與精子發(fā)生、胚胎發(fā)育、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移、炎癥反應(yīng)、病毒感染等多種生理和病理過程，是一個多功能的分子。第11頁/共49頁

免疫組化實驗證實CD147在多種惡性腫瘤中高表達，包括膀胱癌、皮膚癌、肺癌、乳腺癌、淋巴癌和胰腺癌等。并且腫瘤的惡性程度越高，CD147的表達水平也越高。第12頁/共49頁CD147在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用

1.促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移

CD147就是通過刺激成纖維細胞及腫瘤細胞本身產(chǎn)生多種MMP來降解基底膜和細胞外基質(zhì)，從而促進腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移的。第13頁/共49頁

2.誘導腫瘤血管生成

血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelialgrowth

factor，VEGF）是很多情況下血管生成過程的主要調(diào)節(jié)因子，包括腫瘤形成過程。CD147可以誘導VEGF的表達。第14頁/共49頁

3.促進腫瘤細胞多藥耐藥

在多種多藥耐藥的腫瘤細胞中都觀察到CD147的高表達。CD147可激活PI3K/AKT細胞存活信號通路。在大多數(shù)惡性腫瘤細胞中此通路均被激活。第15頁/共49頁胃癌中CD147的表達

日本Toyama大學的ZhengHC等研究表明：在正常胃黏膜發(fā)展為增生性或化生性胃黏膜，最后發(fā)展為胃癌的過程中，CD147的表達量是逐漸增加的，并且CD147的表達與腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及MMP-2、MMP-9和VEGF的表達呈正相關(guān)。第16頁/共49頁胃癌組織中CD147的表達CD147在胃癌組織中高表達第17頁/共49頁二.研究目標第18頁/共49頁

本實驗旨在運用RNA干擾技術(shù)抑制胃癌細胞株SGC7901中CD147基因的表達，研究該基因沉默后對腫瘤細胞生長、侵襲能力及化療藥物敏感性的影響，探討CD147在胃癌中的作用。第19頁/共49頁三、研究方法及結(jié)果第20頁/共49頁CD147shRNA真核表達載體的構(gòu)建與鑒定↓轉(zhuǎn)染SGC7901細胞，篩選穩(wěn)定表達干擾載體的SGC7901細胞株↓MTT法檢測SGC7901細胞增殖水平的變化↓明膠酶譜法檢測SGC7901細胞MMP-2、MMP-9分泌的變化↓SGC7901細胞體外侵襲力測定↓MTT檢測SGC7901細胞順鉑敏感性的變化技術(shù)路線技術(shù)路線第21頁/共49頁

胃癌細胞株SGC7901源自一位56歲女性胃腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤。研究表明其侵襲能力強，惡性程度高。我們前期研究表明，該細胞表面CD147是高表達的。第22頁/共49頁shRNA（shorthairpinRNA）表達載體的構(gòu)建pSilencer3.1-H1neo第23頁/共49頁shRNA模板的設(shè)計示意圖第24頁/共49頁干擾靶序列的選擇

參考陳翔等的報道，選取CD147mRNA370-390和808-828作為靶序列，相應(yīng)的shRNA分別命名為shRNA1和shRNA2。另外，設(shè)計一個陰性對照shRNA-control。第25頁/共49頁RNAi靶序列在CD147mRNA上的位置

1AGCGGTTGGAGGTTGTAGGACCGGCGAGGAATAGGAATCATGGCGGCTGC51GCTGTTCGTGCTGCTGGGATTCGCGCTGCTGGGCACCCACGGAGCCTCCG101GGGCTGCCGGCACAGTCTTCACTACCGTAGAAGACCTTGGCTCCAAGATA151CTCCTCACCTGCTCCTTGAATGACAGCGCCACAGAGGTCACAGGGCACCG201CTGGCTGAAGGGGGGCGTGGTGCTGAAGGAGGACGCGCTGCCCGGCCAGA251AAACGGAGTTCAAGGTGGACTCCGACGACCAGTGGGGAGAGTACTCCTGC301GTCTTCCTCCCCGAGCCCATGGGCACGGCCAACATCCAGCTCCACGGGCC351TCCCAGAGTGAAGGCTGTGAAGTCGTCAGAACACATCAACGAGGGGGAGA401CGGCCATGCTGGTCTGCAAGTCAGAGTCCGTGCCACCTGTCACTGACTGG451GCCTGGTACAAGATCACTGACTCTGAGGACAAGGCCCTCATGAACGGCTC501CGAGAGCAGGTTCTTCGTGAGTTCCTCGCAGGGCCGGTCAGAGCTACACA551TTGAGAACCTGAACATGGAGGCCGACCCCGGCCAGTACCGGTGCAACGGC601ACCAGCTCCAAGGGCTCCGACCAGGCCATCATCACGCTCCGCGTGCGCAG651CCACCTGGCCGCCCTCTGGCCCCTCCTGGGCATCGTGGCTGAGGTGCTGG701TGCTGGTCACCATCATCTTCATCTACGAGAAGCGCCGGAAGCCCGAGGAC751GTCCTGGATGATGACGACGCCGGCTCTGCACCCCTGAAGAGCAGCGGGCA801GCACCAGAATGACAAAGGCAAGAACGTCCGCCAGAGGAACTCTTCCTGAG851GCAGGTGGCCCGAGGACGCTCCCTGCTCCACGTCTGCGCCGCCGCCGGAG901TCCACTCCCAGTGCTTGCAAGATTCCAAGTTCTCACCTCTTAAAGAAAAC951CCACCCCGTAGATTCCCATCAT第26頁/共49頁設(shè)計好的shRNA插入序列shRNA15'-GATCCGTCGTCAGAACACATCAACTTCAAGAGAGTTGATGTGTTCTGACGACTTTTTTGGAAA-3’5'-AGCTTTTCCAAAAAAGTCGTCAGAACACATCAACTCTCTTGAAGTTGATGTGTTCTGACGACG-3'shRNA2

5'GATCCGTGACAAAGGCAAGAACGTCTTCAAGAGAGACGTTCTTGCCTTTGTCATTTTTTGGAAA-3’5'AGCTTTTCCAAAAAATGACAAAGGCAAGAACGTCTCTCTTGAAGACGTTCTTGCCTTTGTCACG-3’shRNA-control5‘GATCCACTACCGTTGTTATAGGTGTTCAAGAGACACCTATAACAACGGTAGTTTTTTTGGAAA-3'5'AGCTTTTCCAAAAAAACTACCGTTGTTATAGGTGTCTCTTGAACACCTATAACAACGGTAGTG-3’第27頁/共49頁2、CD147shRNA表達載體的構(gòu)建：

將合成的三對片段分別用水浴中加熱后退火備用，與經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切的pSilencer3.1-neo質(zhì)粒連接，構(gòu)建成CD147shRNA表達載體，重組質(zhì)粒分別命名為pSilencer-shRNA1，pSilencer-shRNA2和pSilencer-shRNA-control。第28頁/共49頁重組質(zhì)粒測序鑒定結(jié)果DNA測序表明，3個重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。pSilencer/shRNA1測序圖（紅線為插入片段）第29頁/共49頁轉(zhuǎn)染及篩選

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染48h后用含0.4μg/ml的G418的完全培養(yǎng)基篩選2周，然后改為半量維持。將抗G418的陽性細胞克隆用有限稀釋法分離出來并逐步擴增以待進一步分析。篩選出的細胞克隆分別命名為SGC7901/shRNA1，SGC7901/shRNA2和SGC7901/shRNA-control。第30頁/共49頁Real-timePCR檢測CD147mRNA表達水平

與SGC7901相比，SGC7901/shRNA1和SGC7901/shRNA2細胞中CD147mRNA相對表達量分別下降至72.4%和17.3%

。第31頁/共49頁1234HGLGCD147β-actinLane1:SGC7901.Lane2:SGC7901/shRNA-controlLane3:SGC7901/shRNA1Lane4:SGC7901/shRNA2HG代表高糖基化形式的CD147，LG代表低糖基化形式的CD147。Westernblot結(jié)果與Real-timePCR結(jié)果相符。第32頁/共49頁接種細胞

培養(yǎng)細胞

加入MTT呈色

終止培養(yǎng)

比色

結(jié)果計算

抑制率(%)=(對照組A值-實驗組A值)／對照組A值×100%

24h、48h、72h時間點MTT細胞增殖實驗第33頁/共49頁

與SGC7901和SGC7901/shRNA-control相比，培養(yǎng)24h、48h、72h后SGC7901/shRNA2細胞增殖能力均顯著降低.而陰性對照組SGC7901/shRNA-control增殖能力無顯著改變。第34頁/共49頁明膠酶譜法檢測細胞上清中MMP-2和MMP-9的活性

明膠酶包括72kDa的明膠酶A（基質(zhì)金屬蛋白酶-2，MMP-2）和92kDa的明膠酶B(基質(zhì)金屬蛋白酶-9，MMP-9)。其作用底物為基底膜中的Ⅳ型膠原和變性的間質(zhì)膠原（明膠），其活性與腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。第35頁/共49頁

明膠酶譜法是一種測定明膠酶活性的常用方法。收集細胞培養(yǎng)上清液，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法可將這兩種明膠酶按分子量大小分開，顯示兩條負染條帶，根據(jù)條帶的面積和亮度可判定明膠酶的活性。第36頁/共49頁明膠酶譜結(jié)果MMP-2MMP-9

123Lane1:SGC7901.Lane2:SGC7901/shRNA-control.Lane3:SGC7901/shRNA2**BSGC7901/shRNA2細胞上清液中MMP-2和MMP-9的活性明顯降低第37頁/共49頁Transwell原理

Matrigel是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質(zhì)成分，含有層粘連蛋白、Ⅳ型膠原等。將Matrigel鋪在Transwell侵襲小室的多孔濾膜上，能形成與天然基底膜極為相似的基底膜結(jié)構(gòu)。第38頁/共49頁Transwell結(jié)果穿過Transfer侵襲小室的染成紫色的細胞（×400）SGC7901SGC7901/shRNA-controlSGC7901/shRNA2第39頁/共49頁SGC7901/shRNA2細胞體外侵襲能力顯著降低B*第40頁/共49頁順鉑敏感性實驗

抗腫瘤藥物順鉑的使用濃度以血漿峰濃度（Peak

PlasmaConcentration，PPC)為標準。參照Sondak等的報道，順鉑的PPC為3.0μg/ml。本實驗中使用的順鉑濃度為：