基因工程基因工程的載體

（優(yōu)選）基因工程基因工程的載體當前1頁，總共176頁。Office:Room409ofExperimentBuildingNo.3

:06358230050,

:glzhou@:448953745Instructor:GuoLiZHOUAssociateProfessor,Ph.D.UniversityofLiaocheng,Liaocheng,CHN基因工程的載體第3章

當前2頁，總共176頁。Generalizedoverviewofcloningstrategies,withfavouredroutesshownbyarrows.333*當前3頁，總共176頁。CONTENTS質粒載體噬菌體載體柯斯質粒載體人工染色體載體Specialistpurposevectors4當前4頁，總共176頁。重點與難點內容質粒載體的基本特性、圖譜識別及應用噬菌體載體的特性、類型、及應用其它類型載體的特性及其應用克隆載體與表達載體組成及區(qū)別5重點各種載體的選擇方法及應用難點當前5頁，總共176頁。

遺傳物質

+載體

重組的DNA分子

引入細胞或生物體內

復制與表達

穩(wěn)定地遺傳給下代引言6當前6頁，總共176頁。

1）獨立的一個包括啟動子（promoter)、編碼區(qū)（encodingregion)和終止子（terminator)的基因，or組成基因的某個元件，一般是不可以進入受體細胞的；

2）采用理化方法進入細胞后，也不容易在受體細胞內維持。所以，通過不同途徑能將承載的外源DNA片段帶入受體細胞，并在其中得以維持的DNA分子稱為基因工程載體。DNA7當前7頁，總共176頁。載體（vector)是由在細胞中能夠自主復制的DNA分子構成的一種遺傳成分；基因工程中，攜帶目的基因進入宿主細胞進行擴增和表達的工具稱為載體。目的基因能否有效轉入受體細胞，并在其中維持高效表達，在很大程度上決定于載體。載體的概念8當前8頁，總共176頁。載體的功能運送外源基因高效轉入受體細胞為外源基因提供復制能力或整合能力為外源基因的擴增或表達提供必要的條件載體的功能9當前9頁，總共176頁。

A、復制起點：能在受體中復制；B、篩選標記；C、限制性內切酶切割位點；D、載體的大?。涸瓌t上要求載體越小越好；E、適當?shù)目截悢?shù)；F、載體的安全性：質粒不能隨便轉移;G、外源基因的表達：啟動子。載體的要求10當前10頁，總共176頁。按功能分類克隆載體克隆一個基因或DNA片斷表達載體用于一個基因的蛋白表達整合載體把一個基因插入到染色體組中按來源分類質粒載體噬菌體載體柯斯質粒載體人工染色體載體載體的分類11當前11頁，總共176頁。載體的種類和特征質粒*受體細胞結構插入片斷舉例

E.coli環(huán)狀＜

8kbpUC18/19,T-載體等

λ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL系列，λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀＜

10kbM13mp系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli環(huán)狀≈300kbPeloBAC系列YAC(YeastArtificialchromosome)酵母細胞線性染色體100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳類細胞線性染色體＞

1000kb病毒載體動物細胞環(huán)狀SV40載體，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體動物細胞和細菌環(huán)狀pSVK3質粒，PBV,Ti質粒12當前12頁，總共176頁。1.質粒載體13*Whatareplasmids?當前13頁，總共176頁。1.1質粒的一般生物學特性Plasmidsareextrachromosomageneticelementsthatarenotessentialforbacteriatosurvivebutoftenconferadvantageoustraits(suchasantibioticresistance)onthehostcell.14定義：染色體之外的遺傳物質,可自主復制并穩(wěn)定遺傳*Whatareplasmids?當前14頁，總共176頁。1.1質粒的一般生物學特性15常見于原核細菌和真菌中,某些藍藻、真菌和綠藻中也有發(fā)現(xiàn)*絕大多數(shù)的是DNA（除了酵母的殺傷質粒（killerplasmid）是一種RNA質粒外）化學本質來源當前15頁，總共176頁。1.1質粒的一般生物學特性16對細菌的存活非必須，但常具有某些有利性狀（如抗生素抗性）*絕大多數(shù)為cccDNA（covalentlyclosedcircularDNA，共價、閉合、環(huán)狀DNA分子），極少的天然質粒是線狀的結構性質當前16頁，總共176頁。質粒的各種表型質粒在原核生物中分布廣泛，大小不一，從1-200kb不等，通常非宿主所必需。常具有各種特殊表型，表中已列出，如抗生素抗性、糖酵解、重金屬抗性、誘導植物腫瘤等等。17當前17頁，總共176頁。18當前18頁，總共176頁。Plasmidsarerepliconswhicharestablyinheritedinanextrachromosomalstate.191.2ThreeConformations（三種構型）染色體之外的可穩(wěn)定遺傳的復制子，多數(shù)為環(huán)狀dsDNA分子Q：什么叫復制子？當前19頁，總共176頁。雙鏈完整，則為cccDNA(共價閉合環(huán)狀DNA)雙鏈中只有一條完整，則為開環(huán)DNA(OCDNA)Mostplasmidsexistasdouble-strandedcircularDNAmolecules.IfbothstrandsofDNAareintactcirclesthemoleculesaredescribedascovalentlyclosedcirclesorcccDNA.Ifonlyonestrandisintact,thenthemoleculesaredescribedasopencirclesorOCDNA.20當前20頁，總共176頁。21松弛的cccDNA開環(huán)的DNA(ocDNA)超螺旋DNA(scDNA)DNA旋轉酶拓撲異構酶內切酶內切酶DNA連接酶在天然狀態(tài)下，噬菌體Ф×174RF2的DNA就是開環(huán)DNA的形式。當前21頁，總共176頁。*三種構型22當前22頁，總共176頁。同一質粒盡管分子量相同，不同的構型電泳遷移率不同：scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。開環(huán)DNA(ocDNA)多數(shù)是在提取過程中或其他原因使超螺旋DNA(scDNA)分子上一條鏈被打斷而形成一個切口，此時超螺旋DNA松開形成開環(huán)DNA分子。即使它們原系同一分子，但因其狀態(tài)不同，如L(線狀DNA)，OC，SC的區(qū)別，在凝膠電泳時的遷移率也不相同。ocDNA在電泳時通常跑得最慢。*三種構型23當前23頁，總共176頁。1.3分類:結合型和非結合型兩種Plasmidscanbecategorizedintooneoftwomajortype–conjugativeornon-conjugative–dependinguponwhetherornottheycarryasetoftransfergenes,calledthetragenes,whichpromotebacterialconjugation.

根據(jù)是否帶有一套的轉移基因（tra）可分為結合型和非結合型兩種Tra基因可促使細菌發(fā)生結合24當前24頁，總共176頁。25當前25頁，總共176頁。TraproteinfromconjugativeplasmidbomsiteMobgenemobmRNAMobproteinopenrecipientcellhelperplasmid即mob基因的產(chǎn)物可打開非接合質粒的oriT位點，借助接合質粒tra基因的產(chǎn)物，使非接合質粒被動遷移到受體細胞中，這種現(xiàn)象稱為遷移作用(mobilization)。質粒的可轉移性26當前26頁，總共176頁。R質粒因同時具有tra和mob，可以進行接合和轉移ColE1因僅有mob，沒有tra，所以僅能進行轉移，而不能接合。它只能通過F或F類似的質粒進行接合和轉移。27當前27頁，總共176頁。如果tra和mob都缺失，不能接合，也不能轉移。如果缺失了一部分的mob，且缺失的部分僅與轉移蛋白的拷貝有關，可通過另一組基因nic/bom來代償。順式作用元件nic/bom不會與其它質粒發(fā)生交換，因此從生物安全的角度看，非接合質粒是安全的。這是它作為載體的第一個有利條件。非接合質粒的高拷貝是人工構建載體的第二個有利條件！28當前28頁，總共176頁。1.3分類:松弛型和嚴緊型兩種Plasmidscanalsobecategorizedonthebasisoftheirbeingmaintainedasmultiplecopiespercell(relaxedplasmids)orasalimitednumberofcopiespercell(stringentplasmids).質粒拷貝數(shù)：即一個細胞內質粒的數(shù)量與染色體數(shù)量之比。每種質粒在相應的宿主細胞內保持相對穩(wěn)定的拷貝數(shù)。29還可根據(jù)每個細胞中質?？截悢?shù)的多寡分為兩類：松弛型和嚴緊型。*當前29頁，總共176頁。Generally,conjugativeplasmidsareofrelativelyhighmolecularweightandarepresentasonetothreecopiesperchromosome,whereasnon-conjugativeplasmidsareoflowmolecularweightandpresentasmultiplecopiesperchromosome.AnexceptionistheconjugativeplasmidR6K,whichhasamolecularweightof25×106daltonsandismaintainedasarelaxedplasmid.30嚴緊型質粒(stringentplasmids)：alimitednumberofplasmidcopiespercell。接合型質粒，分子量大，低拷貝數(shù)，1－3拷貝（質粒R6K例外）松弛型質粒（relaxedplasmid）：Relaxedplasmidsareplmidswithmultiplecopiespercell。非接合型質粒，分子量小，高拷貝數(shù)，10－60拷貝，不會自行接合轉移，較安全當前30頁，總共176頁。1.4INCOMPATIBILITYOFPLASMIDS

(質粒的不相容性)質粒的不相容性:在沒有選擇壓力的情況下，任何兩種含有相似復制子結構的不同質粒，不能在同一宿主細胞內穩(wěn)定的共存的現(xiàn)象。31不相容性質粒：不能共存于同一細胞內的不同質粒相容性質粒：可以共存于同一細胞內的不同質粒Plasmidincompatibility

istheinabilityoftwodifferentplasmidstocoexistinthesamecellintheabsenceofselectionpressure.ThetermincompatibilitycanonlybeusedwhenitiscertainthatentryofthesecondplasmidhastakenplaceandthatDNArestrictionisnotinvolved.當前31頁，總共176頁。MOLECULARMECHANISM

（質粒不相容性的分子機制）兩種含有不同復制子結構的不同質粒，在復制時各受自己的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調節(jié)，致使兩種質粒的最終拷貝數(shù)恒定，因此在經(jīng)過若干復制周期和細胞分裂周期后仍能共處于同一細胞內32兩種含有相似復制子結構的不同質粒，在復制時受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質粒的最終拷貝數(shù)不同，其中拷貝數(shù)多的質粒在以后的細胞分裂周期中更具優(yōu)勢*不相容性相容性當前32頁，總共176頁。HOSTRANGEOFPLASMIDSThehostrangeofaplasmidisdeterminedbyitsoriregion.PlasmidswhoseoriregionisderivedfromplasmidColE1havearestrictedhostrange:theyonlyreplicateinentericbacteria,suchasE.coli,Salmonella,etc.OtherpromiscuousplasmidshaveabroadhostrangeandtheseincludeRP4andRSF1010.Plasmidswithabroadhostrangeencodemost,ifnotall,oftheproteinsrequiredforreplication.Theymustalsobeabletoexpressthesegenesandthustheirpromotersandribosomebindingsitesmusthaveevolvedsuchthattheycanberecognizedinadiversityofbacterialfamilies.33不同的質粒有不同的宿主，但這都取決于質粒的復制起始位點。來源于ColE1質粒的復制起始位點ori，決定了這種質粒的宿主只能是腸道來源的細菌。而宿主范圍廣泛的質粒，則必須能表達多種蛋白才能適應不同的宿主。*當前33頁，總共176頁。PROTEINSENCODEDBYPLASMIDSPlasmidsencodeonlyafewoftheproteinsrequiredfortheirownreplicationandinmanycasesencodeonlyoneofthem.Alltheotherproteinsrequiredforreplication,e.g.DNApolymerases,DNAligase,helicases,etc.,areprovidedbythehostcell.Thosereplicationproteinsthatareplasmid-encodedarelocatedveryclosetotheori(originofreplication)sequencesatwhichtheyact.Thus,onlyasmallregionsurroundingtheorisiteisrequiredforreplication.Otherpartsoftheplasmidcanbedeletedandforeignsequencescanbeaddedtotheplasmidandreplicationwillstilloccur.Thisfeatureofplasmidshasgreatlysimplifiedtheconstructionofversatilecloningvectors.34質粒本身編碼的蛋白相當少，許多與復制有關的蛋白都由宿主提供；質粒自身編碼的與復制有關的蛋白則緊鄰復制起點ori；由于與質粒復制有關的序列都在ori附近區(qū)域，其他部位則可刪除或替換成其他基因，這非常有利于克隆載體的構建。*當前34頁，總共176頁。1.6質粒載體的選擇Anidealcloningvehiclewouldhavethefollowingfourdesirableproperties（載體應具備的基本條件）35Replicationoriginisalsoessential.(復制起始位點)—（質粒本身就具備這一特征。）Areasonablyhighcopynumber(高拷貝數(shù)）*lowmolecularweight(低分子量);abilitytoconferreadilyselectablephenotypictraitsonhostcells（篩選標記）;singlesitesforalargenumberofrestrictionendonucleases,preferablyingeneswithareadilyscorablephenotype.（大量的內切酶酶切位點；多克隆位點，它們應該位于某選擇性標志中）當前35頁，總共176頁。1.6質粒載體的選擇36*以增殖外源序列為目的（結構上主要為載體本身必需的序列，分子量較小）以表達外源序列為目的（結構上多了一些與外源基因轉錄、翻譯有關的序列，分子量較大）克隆載體表達載體當前36頁，總共176頁。表達質粒載體是指專用于在宿主細胞中高水平表達外源蛋白質的質粒載體根據(jù)表達的蛋白是否分泌到細胞外：非分泌型表達載體（胞內表達載體）和分泌型表達載體根據(jù)表達所用的受體細胞：原核細胞表達載體和真核細胞表達載體37當前37頁，總共176頁。38當前38頁，總共176頁。表達載體與克隆載體的區(qū)別強啟動子，一個可誘導的強啟動子可使外源基因有效的轉錄在啟動子下游區(qū)和ATG（起始密碼子）上游區(qū)有一個好的核糖體結合位點序列（SD序列），促進蛋白質翻譯在外源基因插入序列的下游區(qū)要有一個強轉錄終止序列，保證外源基因的有效轉錄和mRNA的穩(wěn)定性39當前39頁，總共176頁。表達型載體（expressionvector）

特點基因的啟動子序列和終止子序列一般無檢測標記基因克隆位點是確定的（即位于啟動子序列后）重組分子用凝膠電泳檢出（依賴于分子量差異）。結構轉化單元--宿主細胞轉化表達單元--外源基因表達40當前40頁，總共176頁。表達型載體（expressionvector）顯然,不同類型載體中所缺少的部分必須由外源基因提供。換言之,被表達的外源基因一旦確定,表達載體的類型也就確定了。用途表達外源基因以產(chǎn)生大量外源基因產(chǎn)物用于構建cDNA文庫41當前41頁，總共176頁。THEADVANTAGESOFALOWMOLECULARWEIGH

（低分子量的優(yōu)點）Theplasmidismucheasiertohandle,i.e.itismoreresistanttodamagebyshearing,andisreadilyisolatedfromhostcells.（易處理，如抵抗物理剪切力強，易從宿主中分離提取）Low-molecular-weightplasmidsareusuallypresentasmultiplecopies,andthisnotonlyfacilitatestheirisolationbutleadstogenedosageeffectsforallclonedgenes.（多為多拷貝形式，這樣利于提?。￤ithalowmolecularweightthereislesschancethatthevectorwillhavemultiplesubstratesitesforanyrestrictionendonuclease.(分子量低，則內切酶識別位點少)42轉化效率與質粒DNA分子大小相關，小分子量的質粒轉化率高；質?？寺≥d體分子量小，可承載較大的外源DNA片斷。當前42頁，總共176頁。多克隆位點（MCS）Polylinkerormultiplecloningsites(MCS)isashortDNAsequence,carryingsitesformanydifferentrestrictionendonulceases.（載體上人工構建的。一段短的DNA序列，攜帶有許多不同限制性內切酶識別位點。）43*BycombiningthemwithinanMCS,thesitesaremadecontiguous,sothatanytwositeswithinitcanbecleavedsimultaneouslywithoutexcisingvectorsequences.AnMCSincreasesthenumberofpotentialcloningstrategiesavailablebyextendingtherangeofenzymesthatcanbeusedtogeneratearestrictionfragmentsuitableforcloning.當前43頁，總共176頁。44Fig.MapofplasmidpUC18.(b)Thepolylinkerregion.Thishasmultiplerestrictionsitesimmediatelydownstreamfromthelacpromoter(Plac).Thein-frameinsertusedtocreatetheMCSishatched.PlasmidpUC19isidenticalwithpUC18apartfromtheorientationofthepolylinkerregion,whichisreversed.Whataremeans?當前44頁，總共176頁。1.6.1第一個用于基因克隆的天然質粒PSC101野生型質粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點少、遺傳標記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質粒為基礎進行人工構建451973年，世界上第一例有目的的重組實驗所采用的質粒載體pSC101當前45頁，總共176頁。天然質粒的缺陷？（1）分子量大，拷貝數(shù)低，酶切位點少第一個用于基因克隆的天然質粒pSC101，分子量9.1kb。但只有一個EcoRI切點充當克隆位點，Tetr作為篩選標志。（2）篩選標志不理想ColE1質粒的篩選標志是大腸桿菌素E1（colicinE1）。colicinE1能殺死不含ColE1質粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位點EcoRI正好位于這個基因的內部。因此可通過插入失活篩選。但細菌群體容易自發(fā)突變出抗colicinE1的細胞.46當前46頁，總共176頁。人工改造的克隆載體PBR322及插入失活原理47pBR322是經(jīng)人工改造的一種較為理想的大腸桿菌質粒載體，應用最為廣泛?，F(xiàn)在已經(jīng)被許多更優(yōu)良的新型克隆載體所替代。分子量在歷次的改造中有一定的變化（4362~4363~4361）“p”表示它是一種質粒；

“BR”則是分別取自該質粒的兩位主要構建者F．Bo1ivar和姓氏的頭一個字母，

“322”系指實驗室編號，以與其他質粒載體如pBR325，pBR327，pBR328等相區(qū)別。Innamingplasmids,pisusedtodesignateplasmid,andthisisusuallyfollowedbytheinitialsoftheworker(s)whoisolatedorconstructedtheplasmid.

Numbersmaybeusedtoclassifytheparticularisolate.當前47頁，總共176頁。48ConstructionofpBR322involvedaseriesofmanipulationstogettherightpiecesofDNAtogether,withthefinalresultcontainingDNAfromthreesources.當前48頁，總共176頁。THEPEDIGREEOFPBR322(PBR322的譜系)491）復制起始位點：源于ColE1衍生質粒pMB1。目前實驗室使用的大腸桿菌質粒大多也是由這少數(shù)幾個野生型質粒構建的。2）Apr基因：源于pSF2124質粒轉座子Tn3。3）Tcr基因：源于pSC101質粒。當前49頁，總共176頁。AsummaryoftheoriginsofpBR322.

50當前50頁，總共176頁。PBR322的篩選方式：

INSERTIONALINACTIVATION（插入失活）其中有7種限制酶：EcoRV,NheI,BamHI,SphI,SalI,XmaIII和NruI，它們的識別位點是位于四環(huán)素抗性基因內部，另外有2種限制酶：ClaI和HindIII的識別位點是存在于這個基因的啟動區(qū)內，在這9個限制位點上插入外源DNA都會導致tetr基因的失活；51還有3種限制酶(ScaI、PvuI和PstI)在氨芐青霉素抗性基因（ampr）內具有單一的識別位點，在這個位點插入外源DNA則會導致ampr基因的失活。*這種因DNA插入而導致基因失活的現(xiàn)象，稱之為插入失活效應。當前51頁，總共176頁。52當外源DNA片段插入Tcr基因后，導致Tcr基因失活，使質粒變成只對Amp有抗性?；蛘咄庠椿虿迦階mpr基因中，則會導致Ampr基因失活，這個質粒就變成只對Tc有抗性。這樣通過對抗生素的雙抗或單抗來篩選是否有外源片段插入。篩選標記－插入失活*當前52頁，總共176頁。1.6.2PUC18/19(ALACselectionplasmid)

（PUC18/19和藍白斑篩選原理）UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基礎上改造而成.53pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC12、pUC13、pUC18、pUC19當前53頁，總共176頁。StructureofpUC18/19ori：來自pBR322質粒。Amprgene：來自pBR322質粒PromoteroflacZ：來自大腸桿菌lacZ’gene：大腸桿菌lacZ的-肽鏈序列，是LacZ

的氨基端片段54MCS（mutiplecloningsite,多克隆位點）：10個連續(xù)的單酶切位點，位于lacZ’基因的5’端。當前54頁，總共176頁。pUC18/19與pBR322在結構上的主要差別在于：用乳糖操縱子的一個DNA片段（466bp）替換了pBR322選擇標記Tcr

基因——于是篩選原理也不同（藍白斑篩選）。此DNA片段含有乳糖操縱子的啟動子、調節(jié)因子和β－半乳糖苷酶的α-肽基因。55Q：lac操縱子的結構？當前55頁，總共176頁。Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactoside）：是-半乳糖苷酶的作用底物，無色，但酶解后可生成有色物質—5-溴-4-氯靛藍IPTG：誘導物，與LacI的基因產(chǎn)物——阻遏蛋白結合，使之轉變?yōu)闊o活性形式而不能與操作子結合，于是RNA聚合酶就能起始LacZ’基因的轉錄（肽）。56當前56頁，總共176頁。

Blue/White

Screening(藍白斑篩選)Theactivityoftheenzymeβ-galactosidaseiseasily

monitoredbyincludinginthegrowthmediumthe

chromogenicsubstrate5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside(X-gal).Thiscompoundiscolourless

butoncleavagereleasesablueindolylderivative.Onsolidmedium,coloniesthatareexpressingactive

β-galactosidaseareblueincolourwhilethosewithouttheactivityarewhiteincolour.Thisisoftenreferredtoasblue/whitescreening.SinceXgalisnotaninducerofb-galactosidase,thenon-substrate(gratuitous)inducerisopropyl-β-D-thiogalactoside(IPTG)isalsoaddedtothemedium.57*當前57頁，總共176頁。藍白斑篩選原理58插入了外源基因后，由于插入位置是LacZ’基因的5’端，基因結構被破壞，則不能產(chǎn)生肽，于是沒有活性的-半乳糖甘酶，X-gal也不被水解，底物就仍為白色。重組菌落就是白色，非重組菌就是藍色?！^藍白斑篩選。沒插入外源序列時，誘導物IPTG與LacI的基因產(chǎn)物——阻遏蛋白結合，使之轉變?yōu)闊o活性形式而不能與操作子結合，

LacZ’基因正常轉錄表達，產(chǎn)生的肽與宿主細胞產(chǎn)生的-半乳糖甘酶的C端部分互補，形成有活性的四聚體結構的β半乳糖苷酶，可將底物X-gal水解，產(chǎn)生藍色化合物。載體上：LacZ’基因（carryingtheN-terminal

fragmentofthelacZgene，編碼-半乳糖甘酶的N端部分，肽，146aa）。宿主：lacZ基因缺陷型，只表達-半乳糖甘酶的C端部分*當前58頁，總共176頁。-Complementation(—互補)pUC質粒結構中的lacZ’基因所編碼的—肽鏈（是β-半乳糖苷酶基因的N端末端）可參與-互補作用。這種載體適合于可編碼β—半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞。雖然質粒和宿主編碼的片段各自均無活性，但它們共處一個細胞中時可融為一體，形成具有酶學活性的蛋白質。這種使LacZ基因缺失各一部分突變體的互補，叫做α-互補。59*當前59頁，總共176頁。IPTG誘導的結果：MCS無外源基因插入時，互補，產(chǎn)生藍色菌斑。（說明藍色代表非重組子）MCS有外源基因插入時，不互補，產(chǎn)生白色菌斑。（說明白色代表重組子）60通過看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道是否有DNA插入。*溫馨提示：南開大學曾考過相關的考研題目！當前60頁，總共176頁。1.6.3T

Vector（T載體和TA克隆原理）現(xiàn)象：普通的Taq酶會自動給PCR產(chǎn)物的3’末端添加一個A。原理：普通的Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物3’末端加上一個非模板依賴的A，而T載體是一種帶有3’T突出端的線性載體，在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR產(chǎn)物直接插入到質粒載體MCS中。操作最簡單，快速和高效，是Taq聚合酶PCR產(chǎn)物的最佳克隆方法由Invitrogen公司（SanDiego，CA）發(fā)展而來的商業(yè)性試劑盒，用于PCR產(chǎn)物的克隆和測序。61*當前61頁，總共176頁。1.6.3T

VECTOR（T載體和TA克隆原理）62*TA克隆的優(yōu)點不需使用含限制酶序列的引物；不需把PCR產(chǎn)物做平端處理；不需在PCR擴增產(chǎn)物上加接頭，即可直接進行克隆。

當前62頁，總共176頁。PMD18-T圖譜63當前63頁，總共176頁。PSK-T載體圖譜pSK-Tvector兩側的3`端，具有突出的堿基T，可以和PCR產(chǎn)物3’末端的A堿基互補，從而大大提高PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率?？赏ㄟ^α互補的顏色反應來篩選重組子64當前64頁，總共176頁。PUC18-T克隆載體圖譜65當前65頁，總共176頁。1.6.4TIPlasmid(TI質粒與植物基因工程)Ti（tumor-inducingplasmid）質粒：根癌農(nóng)桿菌含有一種內源質粒，大小因種類而異，在200－250kb之間。當農(nóng)桿菌同植物接觸時，Ti質粒中有一段DNA，大約在15kb-30kb，稱為T-DNA（transferred-DNA），能轉移并整合到植物基因組中，刺激植物細胞不受控制的分裂，形成瘤。66*當前66頁，總共176頁。1.6.4TIPlasmid(TI質粒與植物基因工程)67章魚堿型胭脂堿型農(nóng)桿堿型農(nóng)桿菌素型琥珀堿型根據(jù)其誘導的植物冠癭瘤中所合成的冠癭堿種類，Ti質粒進行分類*由于載體上還會有其他與翻譯有關的基因構建，因此Ti質粒是一種表達載體。當前67頁，總共176頁。冠癭瘤和根癌農(nóng)桿菌68上：電鏡下的根癌農(nóng)桿菌右：冠癭瘤把瘤組織培養(yǎng)在不加生長素和細胞分裂素的培養(yǎng)基上，能夠無限制的分裂和生長。當前68頁，總共176頁。TI質粒分為4個功能區(qū)：Con區(qū)：與細菌間接合轉移的有關基因，調控Ti質粒在農(nóng)桿菌之間的轉移

Ori區(qū)：Ori區(qū)上的基因調控Ti質粒的自我復制。69Vir區(qū)上的基因能激活T-DNA轉移，使根癌農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性*從Ti質粒上被切割下來轉移到植物細胞的一段DNA，含有編碼植物激素（生長素）和冠癭堿的基因Vir區(qū)T－DNA區(qū)當前69頁，總共176頁。章魚堿型pTiAch5和胭脂堿型pTic58質?；驁D70T－DNA區(qū)Vir區(qū)Ori區(qū)Con區(qū)當前70頁，總共176頁。T-DNACompleteTi-plasmidDNAisnotfoundinplanttumourcellsbutasmall,specificsegmentoftheplasmid,about23kbpinsize,isfoundintegratedintheplantnuclearDNAatanapparentlyrandomsite.ThisDNAsegmentiscalledT-DNA(transferredDNA).Itcarriesgenesthatconferbothunregulatedgrowthandtheabilitytosynthesizeopinesuponthetransformedplanttissue.However,thesegenesarenon-essentialfortransferandcanbereplacedwithforeignDNA.71Ti質粒進入植物細胞的只是一小部分，約23kb。能轉移到植物細胞內的這一小段DNA片段稱為T－DNA（transferred-DNA）*當前71頁，總共176頁。BORDERSEQUENCE(邊界序列)IntheTiplasmiditself,theT-DNAisflankedby25bpimperfectdirectrepeatsknownasbordersequence.T－DNA左右兩端邊界各有一個25bp長的正向重復序列(左邊界(leftborder,LB)，右邊界(rightborder,RB))，在不同Ti質粒中高度保守。它在T-DNA的切除及整合過程具有重要意義。右邊界的存在對外源基因整合到植物基因組中相當重要，但左邊界則非必須。DeletionoftherightborderrepeatabolishesT-DNAtransfer,buttheleft-handbordersurprisinglyappearstobenon-essential.72*當前72頁，總共176頁。BORDERSEQUENCE(邊界序列)73邊界序列對T－DNA轉移和整合不可缺少；已證實只要保留兩端邊界序列，雖然中間序列不同程度被外源片斷所替換，仍可轉移整合到植物基因組中－Ti質粒遺傳轉化的理論依據(jù)。*當前73頁，總共176頁。TI質粒作為轉基因載體的缺陷轉化后會產(chǎn)生植物激素，阻礙轉化細胞的再生（因此這部分基因序列要刪除）；冠癭堿合成基因對轉基因植物意義不大（因此這部分基因序列也要刪除）；Ti質粒長約200-800kb，過于龐大（因此要刪除部分無關緊要的序列）；Ti質粒不能在大腸桿菌中復制（因此要增加大腸桿菌的復制起始位點）。左右邊界序列要保留。74當前74頁，總共176頁。75當前75頁，總共176頁。76當前76頁，總共176頁。(一）Ti質粒的改造-雙元載體系統(tǒng)（binaryvetor）又叫二元載體系統(tǒng)，是指農(nóng)桿菌中用于把T-DNA區(qū)域轉入受體細胞的雙質粒系統(tǒng)。其中一個質粒帶有毒性基因，另一質粒帶有改造過的T-DNA區(qū)域，用于攜帶外源基因。77雙元載體系統(tǒng)當前77頁，總共176頁。雙元表達載體系統(tǒng)主要包括兩個部分一部分為卸甲Ti質粒，這類Ti質粒由于缺失了T－DNA區(qū)域，完全喪失了致瘤作用，主要是提供Vir基因功能，激活處于反式位置上的T－DNA的轉移。另一部份是微型Ti質粒(Mini-Tiplasmid)，它在T－DNA左右邊界序列之間提供植株選擇標記如NPTII基因以及LacZ基因等。

雙元載體系統(tǒng)的構建的原理是Ti質粒上的Vir基因可以反式激活T－DNA的轉移。與共整合載體所不同的是，它不依賴兩個質粒之間的同源序列，不需要共整合過程就能在農(nóng)桿菌內獨立復制。78當前78頁，總共176頁。雙元表達載體系統(tǒng)主要包括兩個部分79當前79頁，總共176頁。80當前80頁，總共176頁。81當前81頁，總共176頁。（二）TI質粒的改造—共整合載體系統(tǒng)指含有目的基因的中間表達載體與改造后的受體Ti質粒通過同源重組所產(chǎn)生的一種復合型載體，通常又稱為共整合載體(co-integratedvector)；由于該載體的T-DNA區(qū)與Ti質粒Vir區(qū)連鎖，因而又稱為順式載體(cis-vector)。

82共整合載體當前82頁，總共176頁?；驹怼舱陷d體系統(tǒng)先通過pBR322插入一段T-DNA區(qū)段構建中間載體，克隆目的基因。再將含有中間載體的大腸桿菌與含有Ti質粒的農(nóng)桿菌進行細胞融合，兩個質粒通過T-DNA的同源區(qū)段發(fā)生同源重組，最后在農(nóng)桿菌內得到Vir共整合的Ｔi質粒載體。83當前83頁，總共176頁。構建過程—共整合載體系統(tǒng)一種在一個普通大腸桿菌的克隆載體(如pBR322質粒)中插入了一段合適的T-DNA片段而構成的小型質粒。84中間載體當前84頁，總共176頁。構建過程—共整合載體系統(tǒng)1）中間載體的表達構建在中間載體中加上能在植物細胞中表達的各種啟動子，可使外源基因在植物細胞中表達；當啟動子與顯性選擇標記基因及報告基因連接，構成嵌合基因(chimericgene)時，這些標記基因同樣能表達，從而可提供用于篩選和鑒定的表型。這類含植物啟動子的中間載體稱為中間表達載體(intermediateexpressionvector)。85當前85頁，總共176頁。2）植物表達載體的構建中間表達載體是不能將外源基因轉化進植物細胞。因此，必須將中間表達載體引入到上述已改造的受體Ti質粒中，并構建成能侵染植物細胞的基因轉化載體(它是由兩種以上質粒構成的復合型載體，故稱之為載體系統(tǒng))，才能在植物基因轉化中應用。86當前86頁，總共176頁。為利用根癌農(nóng)桿菌的Ti質粒，發(fā)展了一元載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)。一元載體系統(tǒng)是指首先將目的基因插入到中間表達載體上，篩選出含有目的基因的重組分子，然后將重組質粒轉化到根癌農(nóng)桿菌中，重組質粒與Ti質粒上的同源序列發(fā)生同源重組，將外源基因整合到Ti質粒上，用于侵染植物細胞。T-DNA重組分子就可整合到植物細胞染色體DNA上。最后利用植物選擇標記基因篩選轉化細胞。

87當前87頁，總共176頁。88當前88頁，總共176頁。89當前89頁，總共176頁。90當前90頁，總共176頁。植物表達載體PCAMBIA1300圖譜91質粒載體左邊界右邊界植物標記基因，MCS質粒載體卡那霉素抗性基因潮霉素抗性基因來源于CaMV的啟動子左邊界右邊界在大腸桿菌中的復制起點當前91頁，總共176頁。右邊界左邊界大腸桿菌的復制起點Gus基因（報告基因）92當前92頁，總共176頁。CAMV35S啟動子是植物基因工程中常用來構建表達載體的一個啟動子序列來自花椰菜花葉病毒，由于啟動整個CaMV基因組的一小段重疊序列轉錄產(chǎn)物的沉降系數(shù)為35S，故將編碼該轉錄產(chǎn)物的啟動子稱之為35S啟動子。該啟動子包括TATA盒、CAAT盒、倒轉重復序列和增強子核心序列（GTGG/TTTG）。CaMV35S啟動子加上來自AMV（苜蓿花葉病毒）的一段44bp的引導序列，可使其表達強度增加5倍（44bp序列是翻譯增強序列）。將加倍的CaMV35S啟動子與AMV引導序列結合構成一個復合串聯(lián)啟動子，比未修飾的啟動子表達增強20倍。93當前93頁，總共176頁。其他類型的啟動子馬鈴薯塊莖特異蛋白基因啟動子小麥胚乳特異表達的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因（ADPG-lucosepyrphosphorylase)啟動子番茄果實成熟特異性表達的多聚半乳糖醛酸酶基因(polygalacturnase)啟動子花粉特異表達基因啟動子（lat52）木質部特異表達的苯丙氨酸脂肪酶基因(pal)啟動子94當前94頁，總共176頁。報告基因是標記基因的一種。通常其編碼產(chǎn)物能夠被快速地測定，常用來判斷外源基因是否已經(jīng)成功地導入寄主細胞（器官或組織）并檢測其表達活性的一類特殊用途的基因，不需要依賴外界的壓力。常見的有：1、綠色熒光蛋白基因（GFP，greenfluorescenceprotein）2、β-葡萄糖苷酸酶基因（GUS基因，β-D-glucuronidase）3、熒光素酶基因（LUC，fireflyluciferase）4、氯霉素乙酰轉移酶基因（CAT基因）95*當前95頁，總共176頁。報告基因必須具備的條件有：(1)已被克隆和全序列已測定;

(2)表達產(chǎn)物在受體細胞中不存在，即無背景，在被轉染的細胞中無相似的內源性表達產(chǎn)物;

(3)

報告基因編碼的產(chǎn)物的檢測應該快速、簡便、靈敏度高而且重現(xiàn)性好，表達產(chǎn)物能進行定量測定；(4)

細胞內其它的基因產(chǎn)物不會干擾報告基因產(chǎn)物的檢測

96當前96頁，總共176頁。JELLYFISHAEQUOREAVICTORIA:ONEOFTHEOLDESTSPECIESONTHEEARTH97當前97頁，總共176頁。綠色熒光蛋白（GFP）GFP的首個重大改變是錢永健在1995年完成。GFP的單點突變（S65T）顯著提高了GFP的光譜性質，熒光強度和光穩(wěn)定性也大大增強。突變后的GFP激發(fā)峰轉移至488nm，而發(fā)射峰仍保持在509nm，這和常用的FITC濾光片匹配，提高了GFP的應用潛力。98Heim,R.,Cubitt,A.B.,&TsienR.Y.Improvedgreenfluorescence.Nature.1995Feb23;373(6516):663-4.*當前98頁，總共176頁。99GFP標記的微管表達綠色熒光蛋白的線蟲當前99頁，總共176頁。GUS基因GUS基因就是β-葡萄糖苷酸酶基因。該基因產(chǎn)物為β-葡萄糖苷酸酶，是一種水解酶，相當穩(wěn)定而不易降解。測定方法非常簡單，且可使用底物

在原位顯現(xiàn)出酶的活性，以肉眼即可檢測其產(chǎn)物，非常方便。常用的組織化學方法檢測GUS基因的表達：以無色的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸（X-Gluc）作為反應底物，將被檢材料用含有底物的緩沖液浸泡。若該組織細胞含有gus基因且有表達，在適宜的條件下，該酶就可將X-Gluc水解生成藍色產(chǎn)物。這是由其初始產(chǎn)物經(jīng)氧化二聚作用形成的靛藍染料，它使具Gus活性的部位呈現(xiàn)藍色，用肉眼或在顯微鏡下可看到，且在一定程度下根據(jù)染色深淺可反映出Gus活性。因此利用該方法可觀察到外源基因在特定器官、組織、甚至單個細胞內的表達情況.100*當前100頁，總共176頁。用GUS活性檢測轉基因擬南芥A：組成型啟動子CaMV35S的轉基因擬南芥

B：根特異性啟動子PsMTA的轉基因擬南芥

101當前101頁，總共176頁。轉基因煙草萌發(fā)花粉的GUS組織化學染色CK-102當前102頁，總共176頁。GUS基因組織化學染色35S-莖橫切CK-莖橫切103當前103頁，總共176頁。選擇基因（篩選標記基因）也是標記基因的一種。選擇基因（又稱選擇標記基因或篩選標記基因），其編碼產(chǎn)物可使抗生素或除草劑失活。這種基因在執(zhí)行其選擇功能時，通常存在檢測慢（蛋白酶作用需要時間）、依賴外界篩選壓力（如抗生素、除草劑）等缺陷。主要是各種抗生素抗性基因、使除草劑失活的基因104*當前104頁，總共176頁。其他載體穿梭質粒載體（shuttleplasmidvecotr）人工構建的、具有兩種不同復制起點和選擇標記、因此可以在兩種不同的寄主細胞中復制和存活的質粒載體。105大腸桿菌枯草桿菌穿梭載體大腸桿菌釀酒酵母穿梭載體大腸桿菌動物細胞穿梭載體當前105頁，總共176頁。2.噬菌體載體2.1λvector2.2M13vector106當前106頁，總共176頁。2.1λVECTOR（

λ

載體）TheDNAofphageλ,intheforminwhichitisisolatedfromthephageparticle,isalinearduplexmoleculeofabout48.5kbp.線性雙鏈DNA分子，長度為48.5kb(48502bp);蛋白質外殼1982年由Sanger等完成測序107高效率高特異性侵染宿主細胞(這種高感染性能使外源基因高效導入受體細胞)自主復制繁殖性能使外源基因在宿主細胞中高效擴增噬菌體或病毒的DNA能被開發(fā)成為基因工程的有用載體，因為當前107頁，總共176頁。2.1.1COSSITE(COS位點,科斯位點)Ateachendofphageλareshortsingle-stranded5’projectionsof12nucleotides,whicharecomplementaryinsequenceandbywhichtheDNAadoptsacircularstructurewhenitisinjectedintoitshostcell,i.e.λDNAnaturallyhascohesivetermini,whichassociatetoformthecossite.在λDNA分子兩端各有12nt的單鏈5’粘性末端，且兩者的核苷酸序列互補，當λ噬菌體進入細菌細胞后，其DNA可迅速通過粘性末端互補配對而成雙鏈環(huán)狀DNA分子，這種由噬菌體粘性末端結合形成的雙鏈區(qū)域稱為cos位點（cohesiveendsite）108*當前108頁，總共176頁。109當前109頁，總共176頁。2.1.2LIFECYCLEOFPHAGEλcos連接成環(huán)后，噬菌體與宿主細胞進行位點特異性重組，將自身基因組重組到宿主染色體中，隨宿主染色體的復制而復制；110*cos連接成環(huán)后DNA雙向復制，復制到后期變成滾環(huán)復制形式大量增殖DNA，頭部蛋白大量表達，同時將DNA切割成一個個單獨λ基因組后包裝進成熟的噬菌體頭部，尾部蛋白加到頭部形成成熟的噬菌體，最后裂解宿主細胞。溶菌周期溶源周期當前110頁，總共176頁。Replicationofphage-λDNAinlyticandlysogeniccycles.111當前111頁，總共176頁。112當前112頁，總共176頁。天然的它作為載體的兩個難題，怎么辦呢？113當前113頁，總共176頁。2.1.3GENOMEOFPHAGEλ

114當前114頁，總共176頁。115左臂：從A到J長約20kb，編碼構成頭部、尾部、尾絲對組裝完整噬菌體所需要的蛋白質。要保留中段(J-N)：長約20kb，是λDNA整合和切出，溶原生長所需的序列，但非裂解生長所必需?？蓜h除右臂(N-R)：長約10kb，與調控、DNA合成、免疫、后期功能控制、宿主細胞裂解有關。要保留當前115頁，總共176頁。天然的它作為載體的兩個難題，解決啦！116利用λ噬菌體作載體，主要是將外源基因替代或插入中段序列，使其隨左右臂一起包裝成噬菌體，去感染大腸桿菌，并隨噬菌體的裂解（溶菌）繁殖而繁殖。設計去除λDNA上的多余序列和一些限制性酶切點：因為λDNA較大，序列中的限制性酶切點過多，妨礙其應用。Thetechniqueofmutagenesisinvitromaybeusedtomodifyremainingsitesthatarenotrequired.當前116頁，總共176頁。

phageλcanaccommodateonlyabout5%morethanitsnormalcomplementofDNA.λ噬菌體頭部外殼蛋白質容納DNA的能力是有一定限度的。上限：正常野生型DNA總量的105％左右，下限：正常野生型DNA總量的75％。117*2.1.4Capacityofλvector（λ噬菌體的容量）λ噬菌體的容量范圍：75%~105%當前117頁，總共176頁。按野生型λDNA分子長度為48.5kb計算，λ噬菌體的包裝上限是51kb。編碼必要基因的DNA區(qū)段占28kb，因此λ載體克隆外源DNA的理論極限值應是23kb。這比質粒載體能插入的DNA長得多；而且包裝的λ噬菌體感染大腸桿菌要比質粒轉化細菌的效率高得多，所以λ噬菌體載體常用于構建cDNA文庫或基因組文庫。但λ噬菌體載體的克隆操作要比質粒載體復雜。118*2.1.4Capacityofλvector（λ噬菌體的容量）理論上的極限值可達23kb，但事實上較為有效的克隆范圍僅為15kb左右。但在一般的情況下，15kb左右大小的DNA片段已足夠容納一個完整的基因及其兩端的側翼序列。當前118頁，總共176頁。2.1.5TYPEOFλVECTOR119只具有一個限制酶位點，可便于外源DNA插入的稱為插入型載體，i.e.λgt10，λgt11插入型載體（insertionalvectors）置換型載體（replacementvector）含有二個限制酶切點，在兩個位點之間的DNA區(qū)段可以被外源DNA片段所取代，i.e.λEMBL3、λEMBL4）MostofthesevectorswereconstructedforusewithEcoRI,BamHIorHindIII,buttheirapplicationcouldbeextendedtootherendonucleasesbytheuseoflinkermolecules.*當前119頁，總共176頁。Inλgt10(43.3kb)thisgeneratesleftandright‘a(chǎn)rms’of32.7and10.6kb,respectively,whichcanintheoryacceptinsertDNAfragmentsuptoapproximately7.6kbinlength.插入型載體:

λgt10andCharon16A120當前120頁，總共176頁。EMBL4(41.9kb)hasacentral13.2kbstufferfragmentflankedbyinvertedpolylinkersequencescontainingsitesfortherestrictionenzymesEcoRI,BamHI,andSalI.TwoSalI

sitesarealsopresentinthestufferfragment.置換型載體:EMBL4andCharon40121當前121頁，總共176頁。2.2M13VECTOR（

M13噬菌體載體）122M13、f1和fd，是一類絲狀大腸桿菌噬菌體，它們都含有長度為6.4kb、彼此具有很高同源性的單鏈環(huán)狀DNA分子。由外殼包裝蛋白和正鏈DNA(+ssDNA)組成。感染宿主后不裂解宿主細胞，而是從感染的細胞中分泌出噬菌體顆粒，宿主細胞仍能繼續(xù)生長和分裂。當前122頁，總共176頁。LIFECYCLEOFM13LifecycleandDNAreplicationofphageM13.123M13吸附并通過大腸桿菌的雄性鞭毛內孔注入其+ssDNA，以+ssDNA為模板合成-DNA，形成dsDNA（RFDNA）；再以-DNA為模板滾環(huán)復制，拷貝數(shù)100-200時復制停止；編碼基因表達出蛋白質，包裝正鏈并分泌至體外；雖然不導致溶菌，但使菌斑混濁（細菌生長變慢，約為正常的1/2—3/4）當前123頁，總共176頁。ADVANTAGESOFM13VECTOR單鏈DNA的酶切和連接是比較困難的，因此M13噬菌體在用作載體時是利用其雙鏈狀態(tài)的RFDNA（replicativeformDNA）。RFDNA很容易從感染細胞中純化出來，可以象質粒一樣進行操作，并可通過轉化方法再次導入細胞。124當前124頁，總共176頁。ADVANTAGESOFM13VECTORRFcanbepuri?edandmanipulatedinvitrojustlikeaplasmid（在體外易于象質粒一樣進行純化和操作）bothRFandssDNAwilltransfectcompetentE.colicellstoyieldeitherplaquesorinfectedcolonies(篩選方便，可感染感受態(tài)大腸桿菌細胞。被M13噬菌體感染的受體細胞生長緩慢，形成混濁斑，易于辨認挑選。而且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大)itisveryeasytodeterminetheorientationofaninsert.（很容易測定外源DNA片段的插入方向（因此被用于測序））Insummary,asvectors,?lamentousphagespossessalltheadvantagesofplasmidswhileproducingparticlescontainingsingle-strandedDNAinaneasilyobtainableform.（總之，M13擁有所有質粒的好處，同時又能以一種很容易獲得的形式產(chǎn)生包含ssDNA的顆粒）125但M13--DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5kb當前125頁，總共176頁。APPLICATIONOFM13VECTOR可產(chǎn)生大量純化的含外源DNA片斷的單鏈DNA分子。Sequencingbytheoriginaldideoxymethodrequiredsingle-strandedDNA（測序）oligonucleotide-directedmutagenesis（寡核苷酸定點突變）probepreparation（制備探針）126從細菌中釋放出來的噬菌體顆粒只含單鏈DNA，因此可用來作為對DNA測序的模板；另外，可很方便地用來產(chǎn)生單鏈的DNA探針。*M13載體發(fā)展出來，用于測序。當前126頁，總共176頁。3.COSMID

CLONINGVECTOR（柯斯質粒載體）PlasmidshavebeenconstructedwhichcontainafragmentofλDNAincludingthecossite.Theseplasmidshavebeentermedcosmidsandcanbeusedasgene-cloningvectorsinconjunctionwiththeinvitropackagingsystem.127*“cosmid”一詞是由英文“cossite-carryingplasmid”縮寫而成的，其原意是指攜帶有λ噬菌體cos位點的質粒。CosmidQ：還記得什么是cos位點嗎？當前127頁，總共176頁。128*1978年，發(fā)展出的柯斯質粒載體滿足了人們對克隆大片段序列（超過30-40kb）的需要。由質粒和含有cos位點的λDNA片段組裝的一類新型克隆載體。實際上是質粒的衍生物，是帶有cos序列的質粒。Cosmid克隆載體當前128頁，總共176頁。129*如果將λ噬菌體的左臂、右臂和中段都去除，僅保留λDNA兩端不少于