二十超臨界色譜2課件

20-5超臨界流體色譜法簡(jiǎn)介

超臨界流體色譜法（SupercriticalFluidChromatography,SFC）是以超臨界流體作為流動(dòng)相的一種色譜方法。所謂超臨界流體，是指既不是氣體也不是液體的一些物質(zhì)，它們的物理性質(zhì)介于氣體和液體之間。超臨界流體色譜技術(shù)是2O世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一種嶄新的色譜技術(shù)。由于它具有氣相和液相所沒(méi)有的優(yōu)點(diǎn)，并能分離和分析氣相和液相色譜不能解決的一些對(duì)象，應(yīng)用廣泛，發(fā)展十分迅速。據(jù)Chester估計(jì)，至今約有全部分離的25％涉及難以對(duì)付的物質(zhì)，通過(guò)超臨界流體色譜能取得較為滿意的結(jié)果。1．超臨界流體的特性(1)物質(zhì)的臨界點(diǎn)我們知道，某些純物質(zhì)具有三相點(diǎn)和臨界點(diǎn)。純物質(zhì)的相圖見(jiàn)圖20-s1由三相圖看出：物質(zhì)在三相點(diǎn)下，氣、液、固三態(tài)處于平衡狀態(tài)。而在物質(zhì)的超臨界溫度下，其氣相和液相具有相同的密度。當(dāng)處于臨界溫度以上，則不管施加多大壓力，氣體也不會(huì)液化。在臨界溫度和臨界壓力以上，物質(zhì)是以超臨界流體狀態(tài)存在。即在超臨界狀態(tài)下，隨溫度、壓力的升降，流體的密度會(huì)變化。此時(shí)的物質(zhì)既不是氣體也不是液體，卻始終保持為流體。臨界溫度通常高于物質(zhì)的沸點(diǎn)和三相點(diǎn)。

2．超臨界流體色譜儀

1985年出現(xiàn)第一臺(tái)商品型的超臨界流體色譜儀。圖20-s6表示了超臨界流體色譜儀的一般流程。圖中很多部分類似于高效液相色譜儀，但有兩點(diǎn)重要差別：（l）具有一根恒溫的色譜柱。這點(diǎn)類似氣相色譜中的色譜柱，目的是為了提供對(duì)流動(dòng)相的精確溫度控制。（2）帶有一個(gè)限流器（或稱反壓裝置）。目的用以對(duì)柱維持一個(gè)合適的壓力，并且通過(guò)它使流體轉(zhuǎn)換為氣體后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)量。實(shí)際上，可把限流器看作柱末端延伸部分。4.固定相和流動(dòng)相

用于SFC中的色譜柱可以是填充柱也可以是毛細(xì)管柱，目前，毛細(xì)管超臨界流體色譜（CSFC）由于具有特別高的分離效率，倍受人們的青睞。在SFC中，最廣泛使用的流動(dòng)相要算是CO2流體，它無(wú)色、無(wú)味、無(wú)毒、易獲取并且價(jià)廉，對(duì)各類有機(jī)分子都是一種極好的溶劑。它在紫外區(qū)是透明的；臨界溫度31℃，臨界壓力7.29×106Pa；在色譜分離中，CO2流體允許對(duì)溫度、壓力有寬的選擇范圍。有時(shí)可在流體中引入1%～10%甲醇，以改進(jìn)分離的選擇因子α值。除CO2流體外，可作流動(dòng)相的還有乙烷、戊烷、氨、氧化亞氮、二氯二氟甲烷、二乙基醚和四氫呋喃等。5.檢測(cè)器在高效液相色譜儀中經(jīng)常采用的檢測(cè)器，如紫外、熒光、火焰光度等都能在SFC儀中很好應(yīng)用。但SFC比起HPLC還具有一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是可采用GC中火焰離子化檢測(cè)器（FID）。我們知道，F(xiàn)ID對(duì)一般有機(jī)物分析具有較高的靈敏度，這也就提高了SFC對(duì)有機(jī)物測(cè)定的靈敏.6．超臨界流體色譜法與其他色譜法比較

（l）與高效液相色譜法比較實(shí)驗(yàn)證明SFC法的柱效一般比HPLC法要高：當(dāng)平均線速度為0.6cm·S-1時(shí)，SFC法的柱效可為HPLC法的3倍左右，在最小板高下載氣線速度是4倍左右；因此SFC法的分離時(shí)間也比HPLC法短。這是由于流體的低粘度使其流動(dòng)速度比HPLC法快，有利于縮短分離時(shí)間。（2）與氣相色譜法比較出于流體的擴(kuò)散系數(shù)與粘度介于氣體和液體之間，因此SFC的譜帶展寬比GC要??；另外，SFC中流動(dòng)相的作用類似LC中流動(dòng)相，流體作流動(dòng)相不僅載帶溶質(zhì)移動(dòng)，而且與溶質(zhì)會(huì)產(chǎn)生相互作用力，參與選擇競(jìng)爭(zhēng)。還有，如果我們把溶質(zhì)分子溶解在超臨界流體看作類似于揮發(fā)，這樣，大分子物質(zhì)的分壓很大，因此可應(yīng)用比GC低得多的溫度，實(shí)現(xiàn)對(duì)大分子物質(zhì)、熱不穩(wěn)定性化合物、高聚物等的有效分離。

20-6毛細(xì)管電泳

capillaryelectrophoresis20-1概述

早在一百多年以前，較原始的電泳實(shí)驗(yàn)，是在一個(gè)U形一管中進(jìn)行的，管中盛有溶液，兩端置有電極，加上幾百伏電壓后，首次實(shí)驗(yàn)了對(duì)毒素和抗毒素的分離。1909年，L.Michaelis提出“電泳”這一術(shù)語(yǔ)，他的實(shí)驗(yàn)是用于測(cè)定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。此后，許多的研究報(bào)告涉及氨基酸、肽類、蛋白質(zhì)的分離。為了防止電泳完成了的溶液中，再次發(fā)生對(duì)流混合，曾使用了各種穩(wěn)定介質(zhì)，如瓊脂、纖維粉、玻璃絲、硅膠及丙烯酸胺；為了防止熱擴(kuò)散而使用了一種內(nèi)徑小的管道，管道內(nèi)徑由3mm縮小至75μm。1981年，Jorgenson．和Lukacs使用75μm內(nèi)徑的熔融石英毛細(xì)管，電泳分離氨基酸和肽。至此，出現(xiàn)了毛細(xì)管電泳（capillaryelectrophoresis，CE）技術(shù)。

毛細(xì)管電泳，又稱高效毛細(xì)管電泳（HighPerformancecapillaryelectrophoresis，HPCE），它不同于經(jīng)典的區(qū)帶電泳，有如下特點(diǎn)：

（1）它是在內(nèi)徑（1O～200）μm的石英毛細(xì)管中進(jìn)行的，在毛細(xì)管中的散熱較好，沿著管截面的溫度梯度很小，因此，可以提高加在毛細(xì)管兩端的電壓，所加電壓可高達(dá)幾十千伏。（2）它不需要阻流介質(zhì)，、但可使用凝膠作分子篩介質(zhì)。（3）可使用在柱檢測(cè)法，縮短分析時(shí)間，結(jié)合計(jì)算機(jī)處理數(shù)據(jù)，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作。（4）靈敏度高，檢測(cè)眼可達(dá)（10-13～1O-15）mol，使用激光誘導(dǎo)的熒光檢測(cè)限可達(dá)（1O-19～1O-21）mol。（5）分辨率高，理論塔板數(shù)為幾十萬(wàn)至幾百萬(wàn)／米。（6）取樣量少，有時(shí)只需幾個(gè)納升（nL，10-9L），流動(dòng)相只需幾毫升。

Fd=f×υ式中，f是質(zhì)點(diǎn)平移動(dòng)所受的摩擦阻力，對(duì)小的球狀物質(zhì)點(diǎn)，可用斯托克斯（Stokes）定律表示，即：

f=6πηr式中，η是溶液的粘度，r是離子半徑。即摩擦阻力正比于溶液的粘度、質(zhì)點(diǎn)大小和其電泳速度。由于存在摩擦阻力，一種帶電質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)，被加速到一有限速度，此速度取決于Fe和Fd，這一有限速度稱為電泳速度，υep

。當(dāng)促進(jìn)力與阻滯力達(dá)到平衡時(shí)，則

υep＝q·E／f將上述表達(dá)式合并，作為電泳遷移率（或電泳淌度）μep。表示式，則

μep＝υep／E＝q士／6πηr

電泳遷移率定義為：一種質(zhì)點(diǎn)在每單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的穩(wěn)態(tài)速度。μep值的大小，取決于分子的凈電荷數(shù)及其摩擦性質(zhì)，（分子大小和形狀）以及所用介質(zhì)的介電常數(shù)ε和粘度η。因而，對(duì)于每一種質(zhì)點(diǎn)，在電場(chǎng)作用下的遷移均具有特定的速度。對(duì)于大分子或膠體，其關(guān)系可表示為式中，ξ是帶電質(zhì)點(diǎn)的Zeta電位；ε為溶液的介電常數(shù)；K是德拜一修格爾常數(shù)；α為離子半徑；參數(shù)f·Kα是一個(gè)常數(shù)；其值在1～1．5之間，取決于遷移質(zhì)點(diǎn)的形狀。HPCE分離，幾乎都是在熔融石英毛細(xì)管中完成的，熔融石英是一種高度交聯(lián)的SiO2聚合物，具有很好的抗拉強(qiáng)度。石英毛細(xì)管表面含有許多硅酸基：）Si—OH，在一定的條件下可離解。使表面帶有負(fù)電荷。由于表面帶負(fù)電，因此，帶負(fù)電荷的離子被表面排斥，而帶正電均離子則被毛細(xì)管壁吸引，如圖20－1所示在毛細(xì)管壁的陰離子，與來(lái)自主體溶液中的陽(yáng)離子在石英一溶液界面上形成雙電層。由于靜電場(chǎng)的作用，靠近表面的那些抗衡離子是不遷移的，因此構(gòu)成所謂稠密層。由于熱運(yùn)動(dòng)關(guān)系，離表面遠(yuǎn)的離子構(gòu)成可遷移層或擴(kuò)散層，因?yàn)樵陔p電層內(nèi)離子的立體分布，就形成一種電勢(shì)梯度.當(dāng)在毛細(xì)管兩端加有電場(chǎng)時(shí)；擴(kuò)散層內(nèi)可遷移的陽(yáng)離子向陰極移動(dòng)。由于離子是被水化的，因此，在緩沖液中的液體也隨遷移著的陽(yáng)離子一道，向陰極移動(dòng)，形成一種液流，稱之為電滲流（electroosmoticflow，EOF），它是一種電泳驅(qū)動(dòng)力。在雙電層內(nèi)，EOF總是向雙電層內(nèi)抗衡離子方向遷移，穿過(guò)雙電層的電勢(shì)下降的程度受電滲流速度所控制。電滲流的線速度υeo，可以定義為：式中，υeo是電滲遷移率，即在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下，電滲流的線速度。Zeta電勢(shì)可表示為：ξ=4πδρ/ε式中，ρ是毛細(xì)管表面電荷密度；δ為雙電層厚度。按近代電解質(zhì)理論，δ等于1／K，因此式可寫(xiě)為：式中，K為德拜一修格爾參數(shù)20-2在CZE分離中的遷移時(shí)間、效率及分辨率

在電滲流存在下，離子的遷移速度可表示為：υ=（μ±μeo）U/Lt式中，Ld是毛細(xì)管總長(zhǎng)度；U是外加電壓。離子的遷移時(shí)間為t，則

t=Lt×Ld/（μ±μ