免疫血清制備

免疫血清制備第一頁，共二十七頁，2022年，8月28日實驗?zāi)康暮鸵罅私庥绊憴C體免疫應(yīng)答強度的因素;明確初次應(yīng)答和再次應(yīng)答抗體產(chǎn)生的規(guī)律；制備牛血清白蛋白（BSA）的抗血清；熟悉佐劑的制備和動物免疫的常用方法；了解抗體檢測的常用方法。第二頁，共二十七頁，2022年，8月28日

在免疫學(xué)實驗中,為制備抗體通常以抗原性物質(zhì)給動物注射,經(jīng)一定時間后,動物血清中可產(chǎn)生大量特異性抗體，這種含有特異性抗體的血清稱免疫血清。

實驗原理第三頁，共二十七頁，2022年，8月28日免疫應(yīng)答的影響因素

抗體的產(chǎn)生通常與抗原的質(zhì)和量、動物種類以及接種的途徑有密切關(guān)系。一、抗原分子的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)

1.分子量：分子量越大，免疫原性越強。2.化學(xué)組成及結(jié)構(gòu)（1）蛋白質(zhì)（2）多糖：具有免疫原性,較蛋白質(zhì)弱。（3）核酸：多無免疫原性。3.結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性4.分子構(gòu)象

5.易接近性

6.物理狀態(tài)第四頁，共二十七頁，2022年，8月28日二、宿主方面的因素

1.遺傳因素同種動物不同品系及不同個體對同種抗原產(chǎn)生不同強度的免疫應(yīng)答。

2.其他因素年齡、性別與健康狀態(tài)。三、免疫原的劑量及進(jìn)入途徑（1）劑量

1）劑量不足或過多均不引起免疫應(yīng)答。

2）重復(fù)進(jìn)入引起強免疫應(yīng)答。（2）途徑：皮內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈、腹腔、呼吸道和口服免疫應(yīng)答水平依次降低。第五頁，共二十七頁，2022年，8月28日抗體產(chǎn)生的一般規(guī)律初次應(yīng)答和再次應(yīng)答規(guī)律。

抗體產(chǎn)生的順序規(guī)律：IgM-IgG-IgA-IgD-IgE第六頁，共二十七頁，2022年，8月28日第七頁，共二十七頁，2022年，8月28日初次應(yīng)答和再次應(yīng)答抗體產(chǎn)生比較第八頁，共二十七頁，2022年，8月28日實驗方案免疫佐劑制備及動物初次免疫（第一周）再次免疫及血清采集（第二周）血清采集及抗體檢測（第三周）W1W2W3未免疫血清采集再次免疫血清采集初次免疫血清采集初次免疫再次免疫第九頁，共二十七頁，2022年，8月28日實驗材料動物：昆明鼠（每組一只），約20g／只?？乖?mg／ml牛血清白蛋白（BSA)佐劑：完全福氏佐劑。其它：

PBS、1ml塑料管（保存血清用），無菌小試管，棉簽，1ml注射器、12＃針頭等。第十頁，共二十七頁，2022年，8月28日實驗流程12只小鼠小鼠眼眶取血制備血清2只2只8只W1W3W2初次免疫（1只/組）再次免疫第十一頁，共二十七頁，2022年，8月28日1.5mlBSA1.5ml完全福氏佐劑攪拌完全乳化第一周實驗步驟

1.抗原制備滴于水中經(jīng)久不散第十二頁，共二十七頁，2022年，8月28日

2.動物免疫用1ml注射器12＃針頭吸出完全乳化的抗原1ml；換4＃針頭雙后足墊和背部皮下接種，每處約10-20ul。(接種處先用碘酒、酒精消毒)將免疫后的小鼠放回鼠籠。1ml注射器（內(nèi)有乳化好的抗原）貼好標(biāo)簽，4℃保存下次用。第一周實驗步驟第十三頁，共二十七頁，2022年，8月28日第十四頁，共二十七頁，2022年，8月28日3.采集陰性血清（每班2只）用無菌小試管收集未免疫小鼠血（眼眶放血法），標(biāo)記后送準(zhǔn)備室；2,000rpm離心

10分鐘;吸取血清置1ml塑料管，做好標(biāo)記;注意:老鼠斷頸椎處死后放到樓梯口的紅桶第一周實驗步驟第十五頁，共二十七頁，2022年，8月28日第十六頁，共二十七頁，2022年，8月28日第十七頁，共二十七頁，2022年，8月28日第二次課內(nèi)容第十八頁，共二十七頁，2022年，8月28日抗原抗體反應(yīng)抗原與抗體特異性結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物。物質(zhì)基礎(chǔ):1）抗原表位與抗體高變區(qū)間的互補結(jié)合

2）抗原表位與抗體高變區(qū)的溝槽分子表面的結(jié)合

3）抗原抗體之間的結(jié)合力

4）親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體第十九頁，共二十七頁，2022年，8月28日抗原抗體結(jié)合力靜電引力（electrostaticforces）范德華引力:作用最?。╲anderWaalsinteractions）氫鍵:最具特異性（hydrogenbond）疏水作用力:作用最大（hydrophobicinteractions）抗原抗體結(jié)合力示意圖第二十頁，共二十七頁，2022年，8月28日抗原抗體的親和力和親合力親和力：抗體分子上一個抗原結(jié)合點與對應(yīng)的抗原決定簇之間相適應(yīng)而存在著的引力，是抗原抗體間固有的結(jié)合力親合力：抗體結(jié)合部位與抗原表位之間結(jié)合的強度第二十一頁，共二十七頁，2022年，8月28日親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體抗原抗體的結(jié)合后，使水化層表面電荷減少或消失，水化層變薄，電子云也消失，蛋白質(zhì)由親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體。如再加入電解質(zhì)，如NaCl，則進(jìn)一步使疏水膠體物相互靠攏，形成可見的抗原抗體復(fù)合物?？乖?親水膠體)

抗體(親水膠體)抗原抗體復(fù)合物

(疏水膠體)電解質(zhì)可見反應(yīng)

+第二十二頁，共二十七頁，2022年，8月28日抗原抗體反應(yīng)的一般規(guī)律特異性與交叉反應(yīng)性；可逆性：表面的結(jié)合，有可逆性；抗原抗體交叉反應(yīng)示意圖第二十三頁，共二十七頁，2022年，8月28日適比性：適合的比例，反應(yīng)才可見；階段性：不可見可見反應(yīng)；條件依賴性：PH，溫度，電解質(zhì)?？乖贵w反應(yīng)比例性示意圖第二十四頁，共二十七頁，2022年，8月28日血清制備：取首次免疫后的小鼠2只，采集血清(方法同上),標(biāo)記后凍存?zhèn)溆?。再次免疫：其余小鼠于腹腔和背部皮下注射上次制備的乳化抗原，每鼠注?.5ml。第二周實驗步驟第二十五頁，共二十七頁，2022年，8月28日第三周實驗步驟

血清制備：采集剩余小鼠血,將血置室溫