分子標(biāo)記的種類

分子標(biāo)記的種類第一頁，共四十四頁，2022年，8月28日第二頁，共四十四頁，2022年，8月28日第三頁，共四十四頁，2022年，8月28日第四頁，共四十四頁，2022年，8月28日第五頁，共四十四頁，2022年，8月28日第六頁，共四十四頁，2022年，8月28日第七頁，共四十四頁，2022年，8月28日第八頁，共四十四頁，2022年，8月28日第九頁，共四十四頁，2022年，8月28日第十頁，共四十四頁，2022年，8月28日第十一頁，共四十四頁，2022年，8月28日第十二頁，共四十四頁，2022年，8月28日第十三頁，共四十四頁，2022年，8月28日第十四頁，共四十四頁，2022年，8月28日第十五頁，共四十四頁，2022年，8月28日分子標(biāo)記的種類限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，縮寫RFLP)。原理是檢測(cè)DNA在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA，縮寫RAPD)：該技術(shù)用一個(gè)（有時(shí)用兩個(gè)）隨機(jī)引物（一般8－10個(gè)堿基）非定點(diǎn)地?cái)U(kuò)增DNA片段，然后用凝膠電泳分開擴(kuò)增片段。SSR(SimpleSequenceRepeatPolymorphisms)：引物根據(jù)與微衛(wèi)星重復(fù)序列兩翼的特定短序列設(shè)計(jì)，用來擴(kuò)增重復(fù)序列本身。由于重復(fù)的長(zhǎng)度變化極大，所以這是檢測(cè)多態(tài)性的一種有效方法。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，縮寫AFLP)。單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，縮寫SNP）技術(shù)。第十六頁，共四十四頁，2022年，8月28日第十七頁，共四十四頁，2022年，8月28日第十八頁，共四十四頁，2022年，8月28日第十九頁，共四十四頁，2022年，8月28日第二十頁，共四十四頁，2022年，8月28日第二十一頁，共四十四頁，2022年，8月28日第二十二頁，共四十四頁，2022年，8月28日第二十三頁，共四十四頁，2022年，8月28日第二十四頁，共四十四頁，2022年，8月28日第二十五頁，共四十四頁，2022年，8月28日第二十六頁，共四十四頁，2022年，8月28日第二十七頁，共四十四頁，2022年，8月28日第二十八頁，共四十四頁，2022年，8月28日第二十九頁，共四十四頁，2022年，8月28日第三十頁，共四十四頁，2022年，8月28日AFLP技術(shù)的基本原理AFLP技術(shù)是先將基因組DNA用兩種限制性內(nèi)切酶酶切成大小不等的酶切片斷,并與含有粘性末端的人工接頭相連,形成不同酶切位點(diǎn)的限制性酶切片段,然后用與接頭和位點(diǎn)相匹配的引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增,預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物作為進(jìn)一步PCR擴(kuò)增的模板,再選用特異引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增,擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳將特異的限制性片段分離。由于不同來源的DNA的酶切片段存在差異,因而便產(chǎn)生了擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性。第三十一頁，共四十四頁，2022年，8月28日第三十二頁，共四十四頁，2022年，8月28日第三十三頁，共四十四頁，2022年，8月28日技術(shù)流程AFLP技術(shù)的具體過程為①DNA提取和質(zhì)量檢測(cè);②雙酶切和酶切片段連接;③酶切連接片段的預(yù)擴(kuò)增;④選擇性擴(kuò)增;⑤PCR產(chǎn)物變性后在聚丙烯酰胺變性凝膠上電泳;⑥將電泳后的凝膠進(jìn)行銀染顯影并拍照保存。第三十四頁，共四十四頁，2022年，8月28日DNA酶切及人工接頭的連接(RestrictionoftheDNAandligationofoligonucieotidcadapters)。AFLP技術(shù)革新成功的關(guān)鍵在于DNA的充分酶切,所以對(duì)模板質(zhì)量要求較高,避免其他DNA污染和抑制物質(zhì)的存在。通過熱變性對(duì)內(nèi)切酶進(jìn)行滅活處理,然后在T4連接酶作用下進(jìn)行接頭連接反應(yīng)。AFLP接頭是一種人工合成的雙鏈DNA,一般長(zhǎng)度是14～18個(gè)核苷酸,目前試劑盒中的接頭是EcoRI接頭和MseI接頭,其中報(bào)道的6堿基內(nèi)切酶接頭還有PstI接頭和SacI接頭;4堿基內(nèi)切酶接頭還有TaqI接頭和SseI接頭。第三十五頁，共四十四頁，2022年，8月28日限制性片段的選擇性擴(kuò)增(Selectiveamplificationofsetsofrestrictionfragments)。選擇性擴(kuò)增前,首先用單選擇堿基的引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增反應(yīng),預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋后用于選擇性擴(kuò)增反應(yīng)。采用這種兩步法為以后的分析提供大量的模板,同時(shí)對(duì)模板起到選擇性純化的作用,從而使產(chǎn)生的指紋圖譜更清晰和具有更好的重復(fù)性。第三十六頁，共四十四頁，2022年，8月28日

擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析(Gelanalysisoftheamplifiedfragments)。擴(kuò)增產(chǎn)物通常在4%～6%的變性聚丙烯酞胺凝膠上分離,然后根據(jù)引物的標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行相應(yīng)的產(chǎn)物檢測(cè);也可以采用同位素(r233P)ATP,T42DNA連接酶進(jìn)行末端標(biāo)記;還可以采用生物素標(biāo)記。由于AFLP是擴(kuò)增反應(yīng),所以產(chǎn)生的DNA量用銀染法(silver2stainingAFLP)也足以得到較高的分辨率。第三十七頁，共四十四頁，2022年，8月28日第三十八頁，共四十四頁，2022年，8月28日第三十九頁，共四十四頁，2022年，8月28日操作程序基因組DNA的酶切人工接頭的連接AFLP反應(yīng)（1）AFLP反應(yīng)混合物的制備（2）預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)（3）選擇性擴(kuò)增反應(yīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析（1）5％變性膠的制備（2）膠板的準(zhǔn)備及灌膠（3）樣品的制備（4）上樣（5）電泳（6）銀染第四十頁，共四十四頁，2022年，8月28日AFLP技術(shù)的特點(diǎn)AFLP結(jié)合了RFLP和RAPD的優(yōu)點(diǎn),主要表現(xiàn)在:①AFLP標(biāo)記理論上可以無限多,可覆蓋整個(gè)基因組,不需要預(yù)知DNA序列信息,呈典型的孟德爾方式遺傳;②AFLP技術(shù)能高效地檢測(cè)出DNA的多態(tài)性,幾乎每對(duì)AFLP引物都可以擴(kuò)增出具有多態(tài)性的片段,一般一次檢測(cè)可獲得50-100個(gè)AFLP擴(kuò)增帶;③DNA用量少,且對(duì)模板濃度變化不敏感;④可靠性好,分辨率和重復(fù)性高;⑤引物通用性強(qiáng)。第四十一頁，共四十四頁，2022年，8月28日AFLP在植物分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用

1遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究2遺傳連鎖圖譜構(gòu)建研究3種質(zhì)資源鑒定研究4基因定位和克隆研究5基因表達(dá)與調(diào)控研究6AFLP標(biāo)記輔助育種研究及其它第四十二頁，共四十四頁，2022年，8月28日宋