微生物檢驗在兒科臨床的應(yīng)用

1穿過細菌外膜、肽聚糖或細胞膜，到達作用部位，并與作用靶位接合2經(jīng)受住細菌產(chǎn)生的各種滅活酶的攻擊3與參與細菌基本功能的結(jié)構(gòu)相互作用，并充分地抑制該功能抗菌藥物抑制細菌生長，必須具備的條件：

當(dāng)前1頁，總共43頁。細菌耐藥性的概念致病微生物對于抗菌藥物作用的耐受性或?qū)剐愿拍钍强咕幬?、細菌本身及環(huán)境共同作用的結(jié)果當(dāng)前2頁，總共43頁。1：按遺傳物質(zhì)分類固有耐藥獲得性耐藥2：按耐藥現(xiàn)象分類交叉耐藥多重耐藥細菌耐藥性的分類：當(dāng)前3頁，總共43頁。細菌耐藥性的產(chǎn)生機制

分子遺傳機制生化機制

當(dāng)前4頁，總共43頁。

細菌耐藥的遺傳性變異是基因結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。結(jié)構(gòu)改變主要通過基因突變和基因的轉(zhuǎn)移與重組。分子遺傳機制：當(dāng)前5頁，總共43頁。一、細菌的抗菌藥物作用靶位的改變二、細菌產(chǎn)生滅活酶（水解酶或修飾酶）三、藥物累計不足生化機制：當(dāng)前6頁，總共43頁。細菌產(chǎn)生誘導(dǎo)酶對抗生素的作用靶位進行化學(xué)修飾基因突變造成靶位變異使抗菌藥物不易或不能與靶位結(jié)合一、抗菌藥物作用靶位的改變產(chǎn)生耐藥細菌的生理功能正常當(dāng)前7頁，總共43頁。青霉素結(jié)合蛋白的改變核糖體靶位酶親和力的下降:導(dǎo)致細菌對氨基糖苷類、磺胺類、紅霉素類、四環(huán)素類、氟喹諾酮類抗菌藥物耐藥。Ⅱ型拓撲異構(gòu)酶或DNA解旋酶的改變:導(dǎo)致金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腸桿菌科細菌和假單胞菌等對氟喹諾酮類抗生素耐藥。二氫葉酸代謝酶的改變：細菌改變二氫葉酸合成酶構(gòu)型，可使該酶與磺胺類抗菌藥物的親和力大為降低，導(dǎo)致細菌對磺胺藥耐藥。腸球菌對萬古霉素的耐藥機制：主要是其作用靶位，細胞壁五肽末端的D-丙氨酰-D-丙氨酸突變?yōu)镈-丙氨酰-D乳酸或D-丙氨酸而導(dǎo)致耐藥。當(dāng)前8頁，總共43頁。PBP：是β－內(nèi)酰胺類抗生素的作用靶位蛋白具有轉(zhuǎn)肽酶或羧肽酶活性位于細胞膜上，參與細胞壁合成

在正常情況下：β－內(nèi)酰胺類抗生素與PBP結(jié)合，可干擾細菌肽聚糖的正常合成。在異常情況下：當(dāng)某些細菌獲得外源性DNA時，編碼產(chǎn)生新的低親和力的PBP或PBP本身發(fā)生修飾改變，對抗菌藥物親和力降低，從而導(dǎo)致該細菌對β－內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥。

如：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌:（MRSA）

產(chǎn)生一種新的低分子量的PBP2a，當(dāng)有β－內(nèi)酰胺類抗生素存在時，細菌表面5種正常的PBP被抑制，不能發(fā)揮正常生理功能，而PBP2a不被抑制，可作為轉(zhuǎn)肽酶完成細胞壁的合成，使MRSA對所有β－內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥。

例如：青霉素結(jié)合蛋白（PBP)的改變當(dāng)前9頁，總共43頁。

β－內(nèi)酰胺酶

氨基糖苷類鈍化酶

氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶

紅霉素酯化酶二、細菌產(chǎn)生的滅活酶（水解酶或修飾酶）當(dāng)前10頁，總共43頁。β－內(nèi)酰胺酶:

細菌產(chǎn)生的以β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物為水解產(chǎn)物的多種不同類型的降解酶，可使β－內(nèi)酰胺鍵斷裂造成β－內(nèi)酰胺類藥物失去活性。目前已知的β－內(nèi)酰胺酶有200多種。β－內(nèi)酰胺酶類抗菌藥物:包括青霉素與頭孢菌素類等,為臨床最常用的抗菌藥物之一。這類藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)中均有β－內(nèi)酰胺環(huán),可抑制細菌細胞壁的合成,此環(huán)與他們的抗菌作用密切相關(guān),當(dāng)環(huán)被打開,則抗菌活性消失。當(dāng)前11頁，總共43頁。β－內(nèi)酰胺酶的分類功能分類(Bush)結(jié)構(gòu)分類(Ambler)作用底物酶抑制劑EDTA名稱（代表酶）1C頭孢菌素--頭孢菌素酶(G－桿菌的AmpC酶)2aA青霉素+-青霉素酶(G＋球菌的青霉素酶)2bA青霉素；一、二代頭孢菌素+-廣譜酶(TEM-1,TEM-2,SHV-1)2beA青霉素；一、二、三代頭孢菌素；單環(huán)類+-超廣譜酶(TEM-3至TEM-26;SHV-3至SHV-5)2brA青霉素+/--耐酶抑制劑酶(TEM-30至TEM-36)2cA青霉素；羧芐西林+-羧芐西林酶(PSE-1,PSE-3,PSE-4)2dD青霉素；苯唑西林+/--苯唑西林酶(OXA-1至OXA-27,PSE-4)2eA頭孢菌素+-普通變形桿菌的可誘導(dǎo)的頭孢菌素酶2fA青霉素；頭孢菌素；碳青霉烯類+-非金屬碳青霉烯酶(陰溝桿菌的NMC-A,粘質(zhì)沙雷菌的Sme-1)3A絕大多數(shù)β－內(nèi)酰胺類，包括碳青霉烯類-+金屬酶(銅綠假單胞菌的IMP-1,VIM-1)4B青霉素--洋蔥伯克霍爾德菌的青霉素酶當(dāng)前12頁，總共43頁。超廣譜β－內(nèi)酰胺酶（ESBLs）主要由大腸桿菌和肺炎克雷伯菌的廣譜酶TEM-1、TEM-2和SHV-1突變形成。使細菌的耐藥譜從青霉素和一、二代頭孢菌素擴大到青霉素和一、二、三代頭孢菌素及單環(huán)類，但對頭霉素、碳青酶烯類及酶抑制劑敏感。AmpC酶為染色體介導(dǎo)的頭孢菌素酶，幾乎所有腸桿菌科細菌和銅綠假單胞菌都產(chǎn)生此酶。當(dāng)此酶大量表達時，可導(dǎo)致細菌對除第四代頭孢菌素、碳青酶烯類之外的所有β－內(nèi)酰胺類抗生素耐藥。且對β－內(nèi)酰胺酶抑制劑及EDTA均不敏感。金屬β－內(nèi)酰胺酶是一群能水解碳青酶烯類抗生素的酶，能被金屬螯合劑螯合，不被酶抑制劑抑制。到目前為止至少發(fā)現(xiàn)了28種。當(dāng)前13頁，總共43頁。藥物吸收減少由于細胞壁的有效屏障或細胞膜通透性的改變，阻止藥物吸收，使抗生素?zé)o法進入體內(nèi)發(fā)揮作用主動外排泵作用在某些細菌外膜上存在特殊的能量依賴性的藥物泵系統(tǒng)，能將進入菌體內(nèi)的藥物不斷泵出，使菌體內(nèi)的藥物濃度不足以發(fā)揮抗菌作用而導(dǎo)致耐藥三、藥物累計不足當(dāng)前14頁，總共43頁。細菌名稱抗菌藥物主要耐藥機制葡萄球菌青霉素產(chǎn)生β－內(nèi)酰胺酶耐酶青霉素青霉素結(jié)合蛋白改變氟喹諾酮類DNA解旋酶、藥物外排泵紅霉素核糖體保護蛋白的產(chǎn)生肺炎鏈球菌β－內(nèi)酰胺類青霉素結(jié)合蛋白改變紅霉素核糖體保護蛋白的產(chǎn)生腸球菌β－內(nèi)酰胺類青霉素結(jié)合蛋白改變氨基糖苷類鈍化酶糖肽類結(jié)合蛋白改變流感嗜血桿菌淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌青霉素產(chǎn)生β－內(nèi)酰胺酶氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶腸桿菌科細菌β－內(nèi)酰胺類產(chǎn)生β－內(nèi)酰胺酶氨基糖苷類鈍化酶氟喹諾酮類DNA解旋酶、藥物外排泵銅綠假單胞菌β－內(nèi)酰胺類β－內(nèi)酰胺酶、外膜通透性改變氨基糖苷類鈍化酶氟喹諾酮類DNA解旋酶、藥物外排泵、外膜通透性改變磺胺類雙氫葉酸合成酶改變臨床常見細菌對常見抗菌藥物的主要耐藥機制當(dāng)前15頁，總共43頁。供臨床選擇治療藥物療效差，考慮更換抗菌藥了解病原菌耐藥性的變遷評價新藥抗菌譜及抗菌活性抗菌譜有助于某些菌種鑒定藥敏試驗的目的當(dāng)前16頁，總共43頁。細菌耐藥性監(jiān)測

以臨床細菌標本的藥敏試驗為基礎(chǔ)，分析所在醫(yī)院或地區(qū)常見病原菌耐藥性的變遷。當(dāng)前17頁，總共43頁。

2008年我院細菌耐藥性監(jiān)測藥名頭孢唑啉頭孢他啶頭孢噻肟青霉素頭孢曲松名次11234藥名G－腸桿菌（24株）耐藥率％名次頭孢呋辛95.8（23）1頭孢曲松95.8（23）1頭孢他啶62.5（15）2氨芐西林/舒巴坦62.5（15）2哌拉西林/他唑巴坦25.0（6）3環(huán)丙沙星25.0（6）3頭孢吡肟16.7（4）4丁胺卡那12.5（3）5頭孢哌/舒巴坦4.2（1）6亞安培南4.2（1）6藥名G＋球菌（13株）耐藥率％名次青霉素G76.9（10）1紅霉素76.9（10）1苯唑西林61.5（8）2環(huán)丙沙星46.2（6）3慶大霉素38.5（5）4洛美沙星38.5（5）4萬古霉素15.4（2）52008年7-9月G-桿菌耐藥率2008年抗生素使用排名2008年1-6月G+球菌耐藥率藥名G－腸桿（22株）耐藥率％名次頭孢唑啉90.1（20）1哌拉西林86.4（19）2阿莫西林/棒酸77.3（17）3氨芐西林63.6（14）4慶大霉素54.5（12）5亞胺培南45.4（10）6環(huán)丙沙星36.4（8）72008年1-6月G-桿菌耐藥率當(dāng)前18頁，總共43頁。2008年10-12月細菌耐藥性監(jiān)測藥名G－腸桿菌（19株）耐藥率％名次頭孢呋辛78.9（15）1頭孢曲松73.7（14）1頭孢他啶57.9（11）2氨芐西林/舒巴坦36.8（7）2頭孢吡肟21.1（4）3哌拉西林/他唑巴坦15.8（3）3環(huán)丙沙星15.8（3）4頭孢哌酮/舒巴坦10.5（2）5丁胺卡那5.3（1）6亞安培南5.3（1）6培養(yǎng)出的細菌數(shù)量（株）來源科室肺炎克雷伯菌9新生兒科8株；產(chǎn)一科1株大腸埃希菌6新生兒科6株銅綠假單胞菌1新生兒科1株陰溝桿菌2新生兒科2株克呂沃爾菌1新生兒科1株金黃色葡萄球菌2產(chǎn)一科2株表皮葡萄球菌2新生兒1株；產(chǎn)一科1株注：

超廣譜β－內(nèi)酰胺酶（ESBLs）檢測19株G－腸桿菌，14株陽性，陽性率為73.7％。培養(yǎng)出的細菌種類當(dāng)前19頁，總共43頁。特殊細菌的耐藥菌株檢測試驗?zāi)图籽跷髁制咸亚蚓鷻z測1超廣譜β－內(nèi)酰胺酶檢測2AmpC酶的檢測3耐萬古霉素腸球菌檢測4當(dāng)前20頁，總共43頁。1.耐甲氧西林葡萄球菌檢測(MRSA)由染色體mecA基因介導(dǎo)產(chǎn)生對苯唑青霉素等β－內(nèi)酰胺類抗生素親和力很低的青霉素結(jié)合蛋白（PBP2a）。包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌（MRCNS）。苯唑西林紙片法：MRSA≤13mm，MRCNS≤18mmMRSA陽性結(jié)果應(yīng)注意：該菌對所有青霉素類、頭孢菌素類、碳青酶烯類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類和含酶抑制劑的復(fù)合劑為耐藥，不論檢驗報告的結(jié)果是否敏感。當(dāng)前21頁，總共43頁。2.超廣譜β－內(nèi)酰胺酶檢測（ESBLs）ESBLs可與β－內(nèi)酰胺環(huán)的羧基共價結(jié)合，使其酰胺鍵水解。主要由大腸桿菌和肺炎克雷伯菌的廣譜酶TEM-1、TEM-2和SHV-1突變形成。使細菌的耐藥譜從青霉素和一、二代頭孢菌素擴大到青霉素和一、二、三代頭孢菌素及單環(huán)類，但對頭霉素、碳青酶烯類及酶抑制劑敏感。采用雙紙片擴散法，即頭孢他啶與頭孢他啶/棒酸，頭孢噻肟與頭孢噻肟/棒酸組合，任何一組藥物的抑菌直徑之差≥5mm時判斷ESBLs陽性。

當(dāng)前22頁，總共43頁。3.AmpC酶的檢測AmpC酶為染色體介導(dǎo)的頭孢菌素酶，優(yōu)先作用底物是頭孢菌素。幾乎所有腸桿菌科細菌和銅綠假單胞菌都產(chǎn)生此酶。當(dāng)此酶大量表達時，可導(dǎo)致細菌對除第四代頭孢菌素、碳青酶烯類之外的所有β－內(nèi)酰胺類抗生素耐藥。且對β－內(nèi)酰胺酶抑制劑及EDTA均不敏感。5種紙片初篩試驗：頭孢他啶、頭孢他啶/棒酸、頭孢西丁、亞胺培南和頭孢吡肟，前三種耐藥，后兩種敏感。當(dāng)前23頁，總共43頁。4.耐萬古霉素腸球菌檢測（VRE）：耐萬古霉素腸球菌（VRE）可分為VanA、VanB、VanC三種類型。由于MRSA增加，萬古霉素使用大幅上升，導(dǎo)致臨床VRE感染病人增加；VRE治療比較困難，沒有特定規(guī)律；可供選擇的有四環(huán)素、氯霉素、喹諾酮類，泌尿系可考慮呋喃妥因或磺胺類。當(dāng)前24頁，總共43頁。微生物檢驗在兒科臨床的應(yīng)用

溝通理解合作當(dāng)前25頁，總共43頁。血培養(yǎng)標本的采集和運送1.血培養(yǎng)的數(shù)量研究結(jié)果一套血培養(yǎng)的陽性率為65％二套血培養(yǎng)的陽性率為80％三套血培養(yǎng)的陽性率為96％CLSI建議方針對于每位需要血培養(yǎng)的患者需采取2至3套。對于成年患者的血培養(yǎng)，只采單一的血培養(yǎng)是不允許的。因為單一血培養(yǎng)的結(jié)果的臨床意義很難解釋。采血培養(yǎng)后的2至5天內(nèi)，不需要重復(fù)采血培養(yǎng)，因為治療后的2至5天內(nèi)血液中的感染細菌不會馬上消失。當(dāng)前26頁，總共43頁。2.血培養(yǎng)的采血量和時間對于成年患者，每套血培養(yǎng)瓶推薦的采血量為１0至２0ml對于嬰幼兒患者，采血量不超過患者總血量的1％（≤1kg采血2ml;1.1-2kg采血2ml；采血4ml;，采血10ml）采血盡量在寒戰(zhàn)或發(fā)熱后及未使用抗生素之前完成。在評估可疑新生兒敗血癥時，除發(fā)熱或低燒外，很少培養(yǎng)出細菌的，應(yīng)該補充尿液和腦脊液培養(yǎng)。當(dāng)前27頁，總共43頁。3.標本的運送血培養(yǎng)瓶在采血接種后必須馬上送檢血培養(yǎng)瓶在采血接種后在室溫中不得超過數(shù)小時血培養(yǎng)瓶不得在采血接種后放入冰箱或冷凍當(dāng)前28頁，總共43頁。4.培養(yǎng)時間與陽性率

BACTEC9240需氧瓶中5天的培養(yǎng)結(jié)果?孵育5天后共檢出1133株有臨床意義的菌株–907株(80.0%)在24小時內(nèi)檢出–162株(14.3%)在24-48小時檢出–18株在96小時以后檢出?在第5天檢出的細菌S.aureus4E.faecalis1Klebsiellaspp.5Serratiaspp.1Brucellaspp.2Candidaspp.3C.neoformans1當(dāng)前29頁，總共43頁。痰標本的采集和運送小兒取痰方法用壓舌板向后壓舌，用棉拭子伸入咽部，小兒經(jīng)壓舌刺激咳嗽時，可噴出肺部或氣管分泌物粘在拭子上，取后立即送檢。當(dāng)前30頁，總共43頁。痰標本的檢驗與臨床痰中可分離到的三大類呼吸道感染的病原菌結(jié)核桿菌、白喉棒狀桿菌、百日咳桿菌——公認的病原菌肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡它布拉漢菌——逐漸被認識的CAP病原菌腸桿菌科細菌、非發(fā)酵菌、葡萄球菌等——條件致病菌當(dāng)前31頁，總共43頁。痰中檢出結(jié)核桿菌,白喉棒狀桿菌,百日咳桿菌屬于確診報告痰中培養(yǎng)出肺炎鏈球菌,流感嗜血桿菌,卡他布拉漢氏菌基本上可以確診為社區(qū)獲得性肺炎的病原菌.除此以外的其他革蘭陰性桿菌,革蘭陽性球菌,真菌屬參考報告.參考的價值約30%.當(dāng)前32頁，總共43頁。

目前，痰中分離出的細菌種類大致排位是：綠膿桿菌，不動桿菌，肺炎克雷伯菌，陰溝腸桿菌，變形桿菌，大腸桿菌，某些少見的腸桿菌科細菌及非發(fā)酵菌，葡萄球菌，念珠菌，糞腸球菌,肺炎鏈球菌,流感嗜血桿菌….

幾乎全部是條件致病菌當(dāng)前33頁，總共43頁。條件致病菌的幾種身份病原菌：患者由這類菌引起感染，用細菌報告提示的抗生素治療，療效明顯定植菌：①用細菌報告提示的抗生素治療，該菌消失，感染癥狀依然存在②或是由于該菌泛耐藥，臨床憑經(jīng)驗聯(lián)合用藥，感染癥狀好轉(zhuǎn)，但該菌依然存在上述兩種現(xiàn)象說明，細菌報告中的病原菌與感染毫無關(guān)系污染菌：留取標本過程中，污染了非感染部位的細菌當(dāng)前34頁，總共43頁。某種情況：患者的感染已基本治愈，做痰檢的目的是希望得到一張陰性報告做為停止治療,出院的憑證。培養(yǎng)：生長大量陰性桿菌，較常見的是綠膿桿菌和不動桿菌

患者已接受了較長時間的抗生素治療，在清除了病原菌的同時，上呼吸道的正常菌同時被殺傷，定植抗力削弱，醫(yī)院中常見的綠膿桿菌，不動桿菌由于耐藥性極強，有機會在上呼吸道大量生長。這類細菌致病力較弱，與宿主形成和平共處的狀態(tài)，這是典型的定植現(xiàn)象。清除這些不應(yīng)在呼吸道大量生長的定植菌最佳的手段是停用抗生素，讓呼吸道正常菌群重新生長，拮抗定植菌。當(dāng)前35頁，總共43頁。糞便標本的采集和運送自然排便法：自然排便后，挑取有膿血、黏液部位的糞便2－3克，液狀糞便取絮狀物盛于無菌的容器內(nèi)送檢。直腸拭子方法：如不易獲得糞便時或排便困難的患者及幼兒，可采取直腸拭子方法采集，取出后插入滅菌試管內(nèi)送檢。

以肥皂，水和70﹪的酒精，將肛門周圍洗凈，然后用一根浸過無菌生理鹽水的棉拭子，插入肛門約５mm處，輕輕旋轉(zhuǎn)，使之與直腸黏膜表面接觸，然后取出置于無菌試管中立刻送至微生物室．當(dāng)前36頁，總共43頁。糞便標本的檢驗和臨床糞便檢驗主要是患者出現(xiàn)腹瀉癥狀，而引起腹瀉的原因主要有：1.細菌感染2.食物中毒3.菌群失調(diào)患者吃了不清潔的食物，出現(xiàn)腹瀉、嘔吐、發(fā)熱等癥狀前來就醫(yī)醫(yī)生根據(jù)患者主述，大便常規(guī)檢驗,診斷為菌痢或腸炎治療：靜脈補液加抗生素這種有效的治療方法至今還在延用當(dāng)前37頁，總共43頁。但下述情況，此方法無效：住院長期使用抗生素的患者，出現(xiàn)腹瀉癥狀（每日次數(shù)增多，大便呈糊狀），腹部不適，食欲欠佳。其本質(zhì)原因是治療其他感染性疾病所使用的抗生素在發(fā)揮治療作用的同時傷及腸道正常菌群，數(shù)量上占優(yōu)的原籍菌被殺滅或抑制，而某些耐藥的少數(shù)菌乘機大量繁殖，引起腸道生態(tài)失調(diào)。當(dāng)前38頁，總共43頁。腸道生理菌群的主要種類及分布緊貼腸黏膜：以雙岐桿菌、乳酸桿菌為主中間層：類桿菌、真桿菌、消化球菌和