定量聚合酶鏈反應QPCR測定技術

PCR?

PCR只是一個簡單的不起眼玩藝

——凱利·穆利斯（KaryMullis)

PCR只是一個概念，所發(fā)生的奇跡是：PCR概念變成了可操作的實驗系統(tǒng)，變成了一項成熟的技術，后者又上升成為新的概念。…

它最大的特點就是能不斷推出新形式。

——摘自[MakingPCR:AStoryofBiotechnologybyPaulRabinow]當前1頁，總共49頁。當前2頁，總共49頁。什么是PCR?

我不認為PCR能夠用兩種“革命”(政治革命和科學革命)加以說明?！陌l(fā)明并沒有改變基因操作的本質。有了PCR，我們能在更廣的范圍內更快、更容易地進行基因操作，學術界也完全不用等到某人死去或退休后才能接受PCR。它只不過是一種新工具。——凱利·穆利斯（KaryMullis)當前3頁，總共49頁。當前4頁，總共49頁。PCR及有關技術的發(fā)展歷史（1）1983Cetus公司的K.Mullis在這年底（12月16日第一次成功實驗）發(fā)明了PCR。當前5頁，總共49頁。PCR發(fā)明過程的簡單回顧當前6頁，總共49頁。當前7頁，總共49頁。當前8頁，總共49頁。當前9頁，總共49頁。當前10頁，總共49頁。PCR及有關技術的發(fā)展歷史（2）1985關于PCR的文章首次由Cetus公司Saiki等人在Science上發(fā)表(R.Saiki,S.Scharf,F.Faloona,K.Mullis,G.Horn,H.ErlichandN.Arnheim)當前11頁，總共49頁。PCR及有關技術的發(fā)展歷史（3）1987當年7月Cetus公司在美國獲得PCR基本技術專利批準。成立于1985年底的Perkin-ElmerCetus儀器公司（PECI）于這一年的11月推出了第一個PCR試劑產品及第一臺熱循環(huán)儀。1989Science報道了耐熱性DNA多聚酶Taq酶的發(fā)現(xiàn),預示著分子時代的到來。12月《Science》雜志將PCR和它所使用的聚合酶命名為第一個“年度分子”。Hoffmann-LaRoche公司和Cetus開始合作將PCR應用于臨床診斷。當前12頁，總共49頁。PCR及有關技術的發(fā)展歷史（4）1990Cetus科學家D.Gelfand和S.Stoffel發(fā)明了純化TaqDNA多聚酶的方法。第一個PCR試劑盒用于HLA定量檢測分析。Cetus科學家H.Erlich和K.Mullis在德國臨床化學領域獲得生化分析獎。1991TaqMan技術發(fā)表。當年11月Hoffmann-LaRoche公司從Cetus獲得全球的PCR專利權。RocheMolecularSystems創(chuàng)建了單一耐熱多聚酶rTth進行RT-PCR技術，并用于臨床RNA病毒檢測。耐熱逆轉錄酶首次由Cetus科學家發(fā)現(xiàn)并報道。

當前13頁，總共49頁。PCR及有關技術的發(fā)展歷史（5）1992當年3月Cetus公司獲得Taq酶、熱循環(huán)擴增儀等專利；1993AMPLICORHCV*首次用于臨床RNAPCR標準試劑盒。

KaryMullis

因PCR的發(fā)明獲得諾貝爾化學獎。當前14頁，總共49頁。PCR及有關技術的發(fā)展歷史（6）

九十年代中期PCR臨床應用在國內全面展開1998年實時熒光PCR技術開始在中國較廣泛的應用于臨床檢測1999年西方發(fā)達國家嘗試將PCR應用于血液篩查當前15頁，總共49頁。PCR循環(huán)–第一步–加熱變性靶序列靶序列當前16頁，總共49頁。PCR循環(huán)-第二步–引物與靶序列退火靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’當前17頁，總共49頁。PCR循環(huán)-第三步-引物延伸靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase當前18頁，總共49頁。第1個PCR循環(huán)完成后–

得到兩個拷貝的靶序列靶序列靶序列BiotinBiotin當前19頁，總共49頁。30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon當前20頁，總共49頁。當前21頁，總共49頁。PCR擴增過程圖示當前22頁，總共49頁。PCR擴增的理論模式

PCR擴增為指數(shù)擴增，每一擴增周期后產物的量可以下式表達：Yn=Yn-1·(1+E)=Yn-2·(1+E)2=…=X·(1+E)n

0≤E≤1其中E表示擴增效率，Yn表示在n個周期后PCR產物的分子數(shù)量，Yn-1為n-1個周期后PCR產物的分子數(shù)量。等式僅在限定的擴增周期數(shù)（通常為20或30）內成立。超過此周期數(shù)，擴增過程即由指數(shù)擴增降低至穩(wěn)定的擴增速率，最終達到平臺，不再擴增.當前23頁，總共49頁。影響PCR擴增效率的因素:PCR定量的困難?引物/靶的雜交反應試劑的相對量樣本在擴增儀中的位置的不同臨床樣本中DNA聚合酶抑制物的存在PCR擴增模板的量靶核酸鏈的再退火及酶過量可致E降低當前24頁，總共49頁。PCR和定量問題

高濃度/高效率

高濃度/低效率

低濃度/高效率

N : 擴增分子的數(shù)目n : 擴增循環(huán)的次數(shù)log-phaseanalysisNnend-pointanalysis當前25頁，總共49頁。定量PCR與定性PCR測定的最根本的區(qū)別

定量PCR測定的測定點為PCR擴增的指數(shù)擴增期;而定性PCR測定的測定點則多為PCR擴增的平臺期。當前26頁，總共49頁。定量PCR的方法定量PCR方法可歸為三大類，即外標方法、動力學方法和內標共擴增方法定量還可分為絕對定量（即測定X的分子數(shù)量）和相對定量（即測定不同樣本中X的比率）

當前27頁，總共49頁。用外標準的定量PCR方法當前28頁，總共49頁。使用外標的定量PCR方法的優(yōu)缺點優(yōu)點：（1）方法簡便，容易建立；（2）使用雙孔重復測定，這種方法可得到非常準確的結果，甚至可排除管間的差異，但不能排除樣本間的差異；缺點：（1）PCR反應體系中小的區(qū)別也會對測定造成較大的影響。由于最后在擴增效率上的差異，從而使得定量測定精密度和重復性不佳。因此，如果建立一個使用外標準的PCR定量方法，則必須進行方法的精密度（批內變異）和重復性（批間變異）分析，以確定其應用的局限性。當前29頁，總共49頁。TaqMan實時熒光定量PCR當前30頁，總共49頁。當前31頁，總共49頁。分子信標實時熒光定量PCR當前32頁，總共49頁。動力學定量PCR方法

第一步：確定PCR擴增的效率；第二步：根據(jù)相應的公式計算原始模板數(shù)。當前33頁，總共49頁。擴增效率的計算(1)如果在PCR每一個擴增循環(huán)中擴增效率為常數(shù)，則可通過在PCR擴增的指數(shù)期的數(shù)個連續(xù)的或非連續(xù)的周期中取擴增樣本，然后測定每份樣本中的產物Yn的量來測定E值。有必要收集2份以上的樣本，最好是盡可能多的樣本以確證擴增效率保持恒定；換句話說，也就是PCR尚未達到擴增效率開始降低時的階段。如果取的是連續(xù)的樣本，則可從公式（1）測得E值；當前34頁，總共49頁。擴增效率的計算當前35頁，總共49頁。擴增效率的計算(2)如果取的樣本不連續(xù)，則可使用下述將公式（2）重排后得到的更為通用的公式，用參數(shù)j（取樣中間隔的周期數(shù)）替代n，Yj（在較高循環(huán)周期數(shù)取樣的產物量）替代Yn，Yi-j（在較低循環(huán)周期數(shù)取樣的產物量）替代X：E＝－1＋（Yi/Yi-j）1/j

(3)當前36頁，總共49頁。X(原始模板數(shù))的計算

一旦效率確定后，根據(jù)公式（4）可從測定的產物量和循環(huán)周期數(shù)計算得到X。公式（4）來源于公式（2）的重新排列：X＝Yn/(1＋E)n（4）當前37頁，總共49頁。X的另一種計算方式(1)

另一種方式是，根據(jù)公式（2）的對數(shù)形式，以所測定的Yn值的對數(shù)對函數(shù)n繪圖得到X值：logYn=logX

+n×log(1+E)(5)當n＝0時，可在圖上讀出X值，或通過對公式（5）的線性回歸計算X值（圖2）。當前38頁，總共49頁。當前39頁，總共49頁。動力學方法的特點

這種方法的優(yōu)點:(1)不需要外標準；（2）如果能測定PCR產物分子的絕對數(shù)量，則可得到待測樣本的不同的擴增效率（Ee)。當前40頁，總共49頁。使用非競爭性內標準的定量PCR方法

非競爭性內標準：（1）一般為與靶核酸無關的基因組；（2）既可是內源的也可是外源的；（3）與靶核酸無相同的引物結合位點和擴增序列。對于DNA的擴增，非競爭性內標幾乎所有的基因都可應用，最常用的有丙酮酸脫氫酶、前腦啡肽或β肌動蛋白的基因。而對RNA的擴增，則非競爭性內標較難尋找。理想的mRNA內標應該在整個細胞周期中表達的水平變化不大，此外，其表達水平應接近于靶RNA，而且它們的擴增效率應相等，因此兩者擴增線性區(qū)域是重合的。已有許多的mRNA被嘗試用來作為此種內標，如HLA、β肌動蛋白、GPDH和組蛋白H3.3的mRNA或14SrRNA等。當前41頁，總共49頁。以非競爭性內標定量的主要優(yōu)點內標的制備簡單復管測定可排除管間差異，并且在一定程度上，可排除樣本間的差異。當前42頁，總共49頁。以非競爭性內標定量的缺點內標準和靶核酸的逆轉錄的效率有可能不同，并且有可能既使針對的是相同的靶核酸逆轉錄效率也會有很大差異。因此，使用這種方法進行RNA的定量PCR測定極為困難。在擴增過程中的指數(shù)期測定可對原始模板相對定量，但如果沒有驗證在一定的擴增周期內靶核酸和內標有相同的擴增效率，則不能進行絕對定量。當前43頁，總共49頁。使用競爭性內標準的定量PCR方法

“競爭性”內標：人為構建的可與原始靶核酸競爭酶、核苷酸和引物分子的核酸標準，其特點是，與靶核酸具有相同的引物結合位點、但引物之間的順序需加以修飾，使得擴增產物在檢測時能夠很容易地通過諸如凝膠電泳、探針雜交或高效液相層析等方法區(qū)分。對內標準的修飾方法包括對野生型基因組的點突變、部份缺失或插入外來順序等，目前尚無通用的規(guī)則或程序來構建這種內標準。當前44頁，總共49頁。使用競爭性內標準的定量PCR方法使用競爭性內標既可進行相對定量也可進行絕對定量。相對定量具有很好的精密度和重復性。而絕對定量，關鍵是要證明競爭性內標和野生型靶核酸的擴增效率相同。亦可將競爭性內標置于含已知量的野生型靶核酸的樣本中同時擴增來評價。當前45頁，總共49頁。使用競爭性內標準的定量PCR方法要定量單份的臨床樣本，必須進行數(shù)管競爭性PCR測定，每管中靶核酸的量不變，但改變競爭性內標的量，因為只有當待測靶核酸與競爭性內標等摩爾量時才能有可靠的定量。由于競爭性PCR可排除管間和樣本間的差異，因此，其可作為準確的PCR定量方法，適用于絕對定量及含低拷貝數(shù)樣本的定量。

當前46頁，總共49頁。定量PCR測定的臨床應用及

應注意的問題為什么要做定量測定？定性和定量測定結果報告上的混淆