病毒學(xué) 病毒感染與細(xì)胞凋亡

病毒感染與細(xì)胞凋亡

微生物教研組鄭方亮當(dāng)前1頁，總共35頁。當(dāng)前2頁，總共35頁。細(xì)胞凋亡的含義多細(xì)胞生物的一種生理性細(xì)胞死亡的過程；凋亡過程中，細(xì)胞的形態(tài)變化是特有的；凋亡過程中需要基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成，特別是酶的合成。概念：是由一系列基因控制并受復(fù)雜信號調(diào)節(jié)的細(xì)胞自然死亡的現(xiàn)象。當(dāng)前3頁，總共35頁。細(xì)胞凋亡和細(xì)胞程序性死亡從嚴(yán)格的詞學(xué)意義上來說，細(xì)胞程序性死亡與細(xì)胞凋亡是有很大區(qū)別的。細(xì)胞程序性死亡的概念是個功能性概念，描述在一個多細(xì)胞生物體中某些細(xì)胞死亡是個體發(fā)育中的一個預(yù)定的，并受到嚴(yán)格程序控制的正常組成部分。細(xì)胞凋亡則是一個形態(tài)學(xué)的概念，描述一件有著一整套形態(tài)學(xué)特征的與壞死完全不同的細(xì)胞死亡形式。一般認(rèn)為凋亡和程序性死亡兩個概念可以交互使用，具有同等意義。

當(dāng)前4頁，總共35頁。凋亡形態(tài)特征Apoptosis“葉子凋落”當(dāng)前5頁，總共35頁。當(dāng)前6頁，總共35頁。當(dāng)前7頁，總共35頁。左，正常胸腺細(xì)胞；右，凋亡胸腺細(xì)胞當(dāng)前8頁，總共35頁。凋亡形態(tài)特征當(dāng)前9頁，總共35頁。壞死細(xì)胞凋亡受累范圍多為連續(xù)的大片細(xì)胞多為單個細(xì)胞細(xì)胞膜完整性受到破壞仍保持完整性細(xì)胞體積增大、細(xì)胞腫脹減小、固縮→固縮性壞死核染色質(zhì)散在的小集聚，呈絮狀積聚在核膜下，呈半月狀細(xì)胞器腫脹，尤以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯崩解仍保持完整，未崩解溶酶體破壞，酶外溢保持完整，酶不外溢后期細(xì)胞破裂、溶解、殘屑被巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞分解成許多凋亡小體，被鄰近細(xì)胞或巨噬細(xì)胞吞噬炎癥反應(yīng)引起周圍組織炎癥反應(yīng)不引起周圍組織炎癥反應(yīng)當(dāng)前10頁，總共35頁。分子生物學(xué)機(jī)制細(xì)胞程序性死亡是細(xì)胞之間信號傳導(dǎo)的結(jié)果之一。環(huán)境和發(fā)育的刺激通過配體和受體之間的相互作用傳遞到胞內(nèi)，即配體攜帶的信號通過與穿膜細(xì)胞受體胞外區(qū)域的結(jié)合反應(yīng)到受體的胞內(nèi)區(qū)域，完成信號由胞外到胞質(zhì)的傳遞，然后開始胞內(nèi)一系列蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的復(fù)雜作用，最后導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。當(dāng)前11頁，總共35頁。凋亡的過程信號傳遞階段死亡信號的探測胞外信號（配體與受體的特異結(jié)合）胞內(nèi)信號（毒素、射線引起的損傷或病毒感染）下游死亡機(jī)制的傳遞效應(yīng)階段

Caspase的激活最終造成細(xì)胞死亡。當(dāng)前12頁，總共35頁。當(dāng)前13頁，總共35頁。凋亡的激活途徑Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡線粒體參與的細(xì)胞凋亡當(dāng)前14頁，總共35頁。Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡富含半胱氨酸死亡結(jié)構(gòu)域deatheffectordomain當(dāng)前15頁，總共35頁。Caspase家族Caspase屬于半胱氨酸蛋白酶，這些蛋白酶是引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，一旦被信號途徑激活，能將細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)降解，使細(xì)胞不可逆的走向死亡。它們均有以下特點(diǎn)：①活性中心富含半胱氨酸；②對底物天冬氨酸部位有特異水解作用，所以命名為caspase（cysteine-containingaspartate-spicificprotease；③都是由兩大、兩小亞基組成的異四聚體，大、小亞基由同一基因編碼，前體被切割后產(chǎn)生兩個活性亞基。當(dāng)前16頁，總共35頁。分為兩類：一類為執(zhí)行者（executioner或effector），如caspase-3、6、7，它們可直接降解胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，引起凋亡，但不能通過自催化（autocatalytic）或自剪接的方式激活；另一類為啟動者（initiator），如caspase-8、9，收到信號后，能通過自剪接而激活，然后引起caspase級聯(lián)反應(yīng)，如caspase-8可依次激活caspase-3、6、7當(dāng)前17頁，總共35頁。線粒體參與的細(xì)胞凋亡

BID當(dāng)前18頁，總共35頁。當(dāng)前19頁，總共35頁。Caspase可激活名叫CAD（caspase-activatedDnase）的核酸酶，CAD能在核小體的連接區(qū)將其切斷，形成約為200bp整數(shù)倍的核酸片段。正常情況下CAD存在于胞質(zhì)中，并且與抑制因子ICAD/DFF-45蛋白結(jié)合，不能進(jìn)入細(xì)胞核。Caspase活化后可以降解ICAD/DFF-45，釋放出CAD，使它進(jìn)入細(xì)胞核降解DNA。Caspase可直接破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如裂解核纖層，核纖層（Lamina）是由核纖層蛋白通過聚合作用而連成頭尾相接的多聚體，由此形成核膜的骨架結(jié)構(gòu)，使染色質(zhì)（chromatin）得以形成并進(jìn)行正常的排列。在細(xì)胞發(fā)生凋亡時，核纖層蛋白作為底物被Caspase在一個近中部的固定部位所裂解，從而使核纖層蛋白崩解，導(dǎo)致細(xì)胞染色質(zhì)的固縮。

Caspase可作用于幾種與細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)有關(guān)的酶或蛋白，改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)。除此之外，Caspase還能滅活或下調(diào)與DNA修復(fù)有關(guān)的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交聯(lián)蛋白。效應(yīng)階段當(dāng)前20頁，總共35頁。DNA電泳鑒定–+壞死凋亡當(dāng)前21頁，總共35頁。細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞DNA電泳圖1．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)0h2．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)1h3．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)2h4．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)3h5．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)4h6．陰性對照7．Marker

當(dāng)前22頁，總共35頁。Caspase可激活名叫CAD（caspase-activatedDnase）的核酸酶，CAD能在核小體的連接區(qū)將其切斷，形成約為200bp整數(shù)倍的核酸片段。正常情況下CAD存在于胞質(zhì)中，并且與抑制因子ICAD/DFF-45蛋白結(jié)合，不能進(jìn)入細(xì)胞核。Caspase活化后可以降解ICAD/DFF-45，釋放出CAD，使它進(jìn)入細(xì)胞核降解DNA。Caspase可直接破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如裂解核纖層，核纖層（Lamina）是由核纖層蛋白通過聚合作用而連成頭尾相接的多聚體，由此形成核膜的骨架結(jié)構(gòu)，使染色質(zhì)（chromatin）得以形成并進(jìn)行正常的排列。在細(xì)胞發(fā)生凋亡時，核纖層蛋白作為底物被Caspase在一個近中部的固定部位所裂解，從而使核纖層蛋白崩解，導(dǎo)致細(xì)胞染色質(zhì)的固縮。

Caspase可作用于幾種與細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)有關(guān)的酶或蛋白，改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)。除此之外，Caspase還能滅活或下調(diào)與DNA修復(fù)有關(guān)的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交聯(lián)蛋白。效應(yīng)階段當(dāng)前23頁，總共35頁。吞噬當(dāng)前24頁，總共35頁。凋亡相關(guān)的基因和蛋白細(xì)胞凋亡的調(diào)控涉及許多基因，包括一些與細(xì)胞增殖有關(guān)的原癌基因和抑癌基因。其中研究較多的有ICE、Apaf-1、Bcl-2、Fas/APO-1、c-myc、p53、ATM等。當(dāng)前25頁，總共35頁。Apaf-1Apaf-1被稱為凋亡酶激活因子-1（apoptoticproteaseactivatingfactor-1），在線粒體參與的凋亡途徑中具有重要作用，該基因敲除后，小鼠神經(jīng)細(xì)胞過多，腦畸形發(fā)育。Apaf-1含有3個不同的結(jié)構(gòu)域：①CARD（caspaserecruitmentdomain）結(jié)構(gòu)域，能召集caspase-9；②ced-4同源結(jié)構(gòu)域，能結(jié)合ATP/dATP；③C端結(jié)構(gòu)域，含有色氨酸/天冬氨酸重復(fù)序列，當(dāng)細(xì)胞色素c結(jié)合到這一區(qū)域后，能引起Apaf-1多聚化而激活。Apaf-1具有激活Caspase-3的作用，而這一過程又需要細(xì)胞色素c和caspase-9參與。Apaf-1/細(xì)胞色素c復(fù)合體與ATP/dATP結(jié)合后，Apaf-1就可以通過其CARD結(jié)構(gòu)域召集caspase-9，形成凋亡體（apoptosome），激活caspase-3，啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)。當(dāng)前26頁，總共35頁。Bcl-2家族Bcl-2為凋亡抑制基因，是膜的整合蛋白。它們在線粒體參與的凋亡途徑中起調(diào)控作用，能控制線粒體中細(xì)胞色素c等凋亡因子的釋放。Bcl-2家族成員都含有1-4個Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域（BH1-4），并且通常有一個羧端跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembraneregion,TM)。其中BH4是抗凋亡蛋白所特有的結(jié)構(gòu)域，BH3是與促進(jìn)凋亡有關(guān)的結(jié)構(gòu)域。根據(jù)功能和結(jié)構(gòu)可將Bcl-2基因家族分為兩類，一類是抗凋亡的（anti-apoptotic），如：Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1；一類是促進(jìn)凋亡的（pro-apoptotic），如：Bax、Bak、Bad、Bid、Bim，在促凋亡蛋白中還有一類僅含BH3結(jié)構(gòu)，如Bid、Bad。雖然Bcl-2蛋白存在于線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜以及外核膜上，但主要定位于線粒體外膜，它拮抗促凋亡蛋白的功能。當(dāng)前27頁，總共35頁。當(dāng)前28頁，總共35頁。FasFas又稱作APO-1/CD95，屬TNF受體家族。Fas基因編碼產(chǎn)物為分子量45KD的跨膜蛋白，分布于胸腺細(xì)胞，激活的T和B淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，肝、脾、肺、心、腦、腸、睪丸和卵巢細(xì)胞等。Fas蛋白與Fas配體結(jié)合后，會激活caspase，導(dǎo)致靶細(xì)胞走向凋亡。當(dāng)前29頁，總共35頁。p53一種抑癌基因，其生物學(xué)功能是在G期監(jiān)視DNA的完整性。如有損傷，則抑制細(xì)胞增殖，直到DNA修復(fù)完成。如果DNA不能被修復(fù)，則誘導(dǎo)其調(diào)亡，研究發(fā)現(xiàn)喪失p53功能的小鼠胸腺細(xì)胞對糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的調(diào)亡反應(yīng)和正常細(xì)胞相同，而對輻射誘導(dǎo)的調(diào)亡不敏感。當(dāng)前30頁，總共35頁。C-myc

在許多人類惡性腫瘤細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)有c-myc的過度表達(dá)，它能促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制分化。在凋亡細(xì)胞中c-myc也是高表達(dá)，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，一方面它能激活那些控制細(xì)胞增殖的基因，另一方面也激活促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因，給細(xì)胞兩種選擇：增殖或凋亡。當(dāng)生長因子存在，Bcl-2基因表達(dá)時，促進(jìn)細(xì)胞增殖，反之細(xì)胞凋亡。當(dāng)前31頁，總共35頁。ATM

ATM（ataxiatelangiectasia-mutatedgene）是與DNA損傷檢驗有關(guān)的一個重要基因。正常細(xì)胞經(jīng)放射處理后，DNA損傷會激活修復(fù)機(jī)制，如DNA不能修復(fù)則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。ATM是DNA損傷檢驗點(diǎn)的一個重要的蛋白激酶當(dāng)前32頁，總共35頁。細(xì)胞凋亡的檢測方法◆形態(tài)學(xué)觀測：染色法、透射和掃描電鏡觀察◆DNA電泳：DNA片段就呈現(xiàn)出梯狀條帶◆TUNEL測定法，即