基因工程第三章基因工程的載體

基因工程第三章基因工程的載體2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第一頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新發(fā)展概況

1.

第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322(1977,Bolivaretal)

2.

第二階段：增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如pUC系列載體。

3.第三階段：進(jìn)一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動(dòng)子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。

第二頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第三章基因工程的載體作為基因工程載體的基本功能1.運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞2.為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力3.為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供條件第三頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第三章基因工程的載體作為基因工程載體必須具備的基本條件1.具有對受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）2.具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)3.長度盡可能小，以提高其載裝能力4.具有多種單一的酶切位點(diǎn)5.具有合適的選擇性標(biāo)記第四頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新遺傳標(biāo)記基因1.標(biāo)記基因的作用

1）指示外源DNA分子（載體或重組分子）是否進(jìn)入宿主細(xì)胞

這種指示可以是選擇性的（Apr，Tcr，Kanr），也可以是非選擇性的（如lacZ）2）指示外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。

*這種指示也可以是選擇性的（如TcS），也可以是非選擇性的（如TcS，

lacZα,GUS），絕大多數(shù)為后者。

**有的遺傳標(biāo)記基因可以完成上述兩項(xiàng)作用。當(dāng)充任第一作用時(shí)，最好是選擇性標(biāo)記基因；當(dāng)完成第二作用時(shí)，目前多采用非選擇性的—檢測性標(biāo)記基因。有的基因是不能用作選擇性標(biāo)記基因（lacZ，GUS等）。第五頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新2.

標(biāo)記基因的種類

1）抗性標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）

a.

抗生素抗性基因:Apr，Tcr，Cmr，Kanr，G418r，Hygr，Neorb.重金屬抗性基因:Cur，Znr，Cdrc.代謝抗性基因:TK，抗除草劑基因

2）營養(yǎng)標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）

主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營養(yǎng)物合成酶類的基因，這類基因在酵母轉(zhuǎn)化中使用最頻繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。

3）生化標(biāo)記基因

其表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測的生化反應(yīng)，如lacZ,GUS,CAT

4）噬菌斑

第六頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新

3.

使用標(biāo)記基因注意要點(diǎn)

1）標(biāo)記基因與宿主細(xì)胞2）標(biāo)記基因產(chǎn)物的作用機(jī)制:Apr3）標(biāo)記基因的結(jié)構(gòu)與適用范圍:基因啟動(dòng)子,翻譯起始序列,密碼子偏愛性4）標(biāo)記基因的結(jié)構(gòu)變化對功能的影響:LacZ,GUS

4.

常用的遺傳標(biāo)記基因

1)四環(huán)素抗性基因（Tcr）

Tetracycline可結(jié)合在核糖體30s亞基中的一種蛋白質(zhì)分子上，抑制核糖體的轉(zhuǎn)位過程。四環(huán)素抗性基因編碼一種399AAs蛋白質(zhì)，與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合，阻止四環(huán)素分子進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞。第七頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新2)氨芐青霉素抗性基因（Apr）

Ampicillin可抑制細(xì)菌細(xì)胞膜上參與細(xì)胞壁合成酶類的活性。Apr抗性基因編碼一種分泌到細(xì)菌細(xì)胞周間質(zhì)的酶，催化β—內(nèi)酰胺環(huán)的水解，使氨芐青霉素失活。3)氯霉素抗性基因（Cmr）

Chlorophenicol可結(jié)合在核糖體50S亞基上，阻止蛋白質(zhì)合成。Cmr基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，使氯霉素乙酰化，導(dǎo)致乙?；穆让顾夭荒芙Y(jié)合在核糖體上。4)卡那霉素(Kanr),新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因

Kanamycin，Neomycin和G418均屬脫氧鏈霉胺氨基葡萄糖苷類抗生素，可結(jié)合在核糖體上阻止蛋白質(zhì)的合成。來自轉(zhuǎn)座子Tn5和Tn903的Kanr抗性基因均可使這類抗生素磷酸化，使之不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。第八頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新

5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ和lacZα）

β—半乳糖苷酶基因有1021AAs，基因產(chǎn)物不具酶活性，裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質(zhì)可分為兩部分：α鏈和β鏈。前者負(fù)責(zé)四聚體裝配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有當(dāng)兩者都存在時(shí)，才會(huì)表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為α-互補(bǔ)作用。這兩個(gè)部分可獨(dú)立存在，分別由兩個(gè)基因編碼。為α鏈編碼的基因稱之為lacZα(編碼145AAs)。這兩個(gè)基因（LacZ和LacZα）均可作為標(biāo)記基因。

β—半乳糖苷酶基因的優(yōu)點(diǎn):

a.

酶催化X-Gal水解為蘭色產(chǎn)物，檢測直觀b.lacZα編碼5'-端可容許很大的變化而不影響酶活性c.lacZα和β鏈基因的分別表達(dá)可使載體小而容量大第九頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新

6）葡萄糖苷酸酶基因（GUS）該基因編碼一種可分解各種β-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。該標(biāo)記基因除具有上述lacZ基因的優(yōu)點(diǎn)外，它的適用范圍十分廣泛，因?yàn)樵S多生物中沒有這種基因。7）熒光素酶基因

熒光素酶或由螢火蟲產(chǎn)生的可催化蜜蜂熒光素氧化的酶，并產(chǎn)生熒光，若在反應(yīng)中加入CoA，可使靈敏度提高10倍；或由發(fā)光細(xì)菌（Photobacteriumfischeri）產(chǎn)生的熒光素酶，它與FMN-氧化還原酶聯(lián)用，通過NAD(P)H的變化測定酶活。

8）發(fā)光蛋白質(zhì)基因

發(fā)光蛋白是由水母產(chǎn)生的一種可發(fā)光的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可使大腸桿菌菌落呈藍(lán)色。第十頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新分子克隆載體的復(fù)制起點(diǎn)與種類

1.復(fù)制起點(diǎn)的種類

1)核內(nèi)復(fù)制起點(diǎn)

a.染色體復(fù)制起點(diǎn)—原核生物(環(huán)狀)和真核生物(線狀)染色體

b.染色體外復(fù)制起點(diǎn)i.質(zhì)?！狣NA,RNA,線狀,環(huán)狀,單鏈,雙鏈ii.病毒—同上,細(xì)胞內(nèi)和病毒顆粒內(nèi)

2)核外復(fù)制起點(diǎn)a.線粒體—所有真核細(xì)胞b.葉綠體—所有綠色植物細(xì)胞

原核與真核生物兩種質(zhì)體中亦可能含有質(zhì)粒第十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新

3.按復(fù)制起點(diǎn)劃分克隆載體

1)質(zhì)粒復(fù)制型—復(fù)制起點(diǎn)來自質(zhì)?；蚓€粒體和葉綠體

2)ARS復(fù)制型—ARS（autonomusreplicativesequence)，或稱染色體復(fù)制型

3)病毒復(fù)制型—復(fù)制起點(diǎn)來自病毒，若為RNA病毒，必須反轉(zhuǎn)錄為cDNA。4)混合復(fù)制型a.

同種生物復(fù)制起點(diǎn)混合—質(zhì)粒形式存在；質(zhì)?；虿《拘问酱嬖诘谑摚参迨隧?，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新

例：大腸桿菌（E.coli）的噬粒（phagemid）載體既含有來自質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，又含有來自噬菌體（如M13）的復(fù)制起點(diǎn)。在不同條件下，它可以質(zhì)?；蚴删w的復(fù)制起點(diǎn)進(jìn)行復(fù)制，從而獲得質(zhì)粒ds-DNA或噬菌體ss–DNA又如：釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）的某些載體既含有質(zhì)粒（2μ）復(fù)制起點(diǎn)，又含有ARS片段b.

不同生物復(fù)制起點(diǎn)混合—穿梭載體（shuttlevector）兩種生物中均以質(zhì)粒形式存在；在一種生物中以質(zhì)粒形式存在，在另一種生物中以質(zhì)粒或病毒形式存在*穿梭載體范圍：細(xì)菌—細(xì)菌（放線菌），細(xì)菌—酵母菌，細(xì)菌—真菌，細(xì)菌—?jiǎng)游锏谑?，共五十八頁?022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新分子克隆載體的復(fù)制起點(diǎn)種類、標(biāo)記基因與拷貝數(shù)的關(guān)系

1.復(fù)制起點(diǎn)種類與拷貝數(shù)間的關(guān)系

1)質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)類型：低拷貝（嚴(yán)緊型，1-2copies，受宿主染色體基因控制）；高拷貝（松弛型，>20copies，受宿主染色體控制較弱）

2)ARS型載體：拷貝數(shù)較高（約20copies）

3)病毒型復(fù)制起點(diǎn)：高拷貝

2.

標(biāo)記基因與拷貝數(shù)的關(guān)系

若標(biāo)記基因表達(dá)效率高，宿主細(xì)胞可能不大量產(chǎn)生標(biāo)記基因以滿足選擇壓力要求，因而載體拷貝數(shù)會(huì)降低。對于不同標(biāo)記基因，可采取相應(yīng)方法提高其拷貝數(shù)。

如：對于藥物抗性標(biāo)記基因，可提高藥物濃度。對于營養(yǎng)標(biāo)記基因，可降低該基因的表達(dá)效率或更換其他低效率的標(biāo)記基因第十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新分子克隆載體的轉(zhuǎn)化頻率和穩(wěn)定性1.影響轉(zhuǎn)化頻率的因素

1)復(fù)制起點(diǎn)類型：盡可能選擇高拷貝復(fù)制起點(diǎn)

2)標(biāo)記基因：盡可能選擇高效表達(dá)的標(biāo)記基因

2.

影響穩(wěn)定性的因素1)

復(fù)制起點(diǎn)類型—低拷貝載體穩(wěn)定，高拷貝載體穩(wěn)定性差2)

選擇壓力3)

載體在宿主細(xì)胞中的狀態(tài)—自主復(fù)制型和整合型宿主細(xì)胞的遺傳特性和生理特性第十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒（plasmid）的一般性質(zhì)1、定義質(zhì)粒是存在于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中獨(dú)立于染色體而自主復(fù)制的共價(jià)、封閉、環(huán)狀雙鏈DNA分子（CovalentlyclosedCircularDNA,cccDNA）第十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒（plasmid）的一般性質(zhì)2、特征自主復(fù)制性質(zhì)粒DNA攜帶有自己的復(fù)制起始區(qū)（ori）以及一個(gè)控制質(zhì)?？截悢?shù)的基因，因此它能獨(dú)立于宿主細(xì)胞的染色體DNA而自主復(fù)制第十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒（plasmid）的一般性質(zhì)2、特征不相容性利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒（RNAIRNAIIRop因子）如果被導(dǎo)入同一細(xì)胞中，它們在復(fù)制及隨后分配到子細(xì)胞的過程中，就會(huì)彼此競爭，幾種質(zhì)粒中只能有一種長期穩(wěn)定地留在細(xì)胞中，這就是所謂的質(zhì)粒不相容性。第十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒（plasmid）的一般性質(zhì)2、特征可擴(kuò)增性pMB1或ColEI類質(zhì)粒在蛋白質(zhì)合成中斷時(shí)，質(zhì)粒復(fù)制能持續(xù)合成，這樣當(dāng)用氯霉素抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制時(shí)，帶有pMB1或ColEI復(fù)制子的質(zhì)粒將利用豐富的原料大量復(fù)制，最后每個(gè)細(xì)胞可以積聚2000-3000個(gè)拷貝，這叫做氯霉素?cái)U(kuò)增。第十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒（plasmid）的一般性質(zhì)2、特征攜帶遺傳標(biāo)記

在實(shí)驗(yàn)室中將質(zhì)粒通過物理方法導(dǎo)入受體細(xì)胞，但是即使在最佳條件下，受體細(xì)胞中也只有少數(shù)細(xì)胞能穩(wěn)定地接受質(zhì)粒，要想找到這些進(jìn)入了質(zhì)粒的受體細(xì)胞，就要利用載體質(zhì)粒上的遺傳標(biāo)記，天然質(zhì)粒上碰巧攜帶許多功能基因，它們便可被用作選擇標(biāo)記。第二十頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒（plasmid）的一般性質(zhì)3、分類

接合型和非接合型嚴(yán)緊性和松弛型在基因工程中使用的質(zhì)粒都是松弛型質(zhì)粒第二十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體二、質(zhì)粒（plasmid）載體的構(gòu)建1、理想質(zhì)粒載體所具備的條件質(zhì)粒較小質(zhì)粒帶有可供選擇的標(biāo)記帶有盡可能多的單一限制酶切位點(diǎn)應(yīng)有較高的基因表達(dá)能力第二十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli質(zhì)粒載體二、質(zhì)粒（plasmid）載體的構(gòu)建2、質(zhì)粒人工構(gòu)建的目的

天然質(zhì)粒往往存在著這樣或那樣的缺陷，因而不適合用作基因工程的載體必須對之進(jìn)行改造構(gòu)建：（1）加入合適的選擇標(biāo)記基因，如兩個(gè)以上，易于用作選擇

（2）增加或減少合適的酶切位點(diǎn)，便于重組

（3）縮短長度，切去不必要的片段，提高導(dǎo)入效率，增加裝載量

（4）改變復(fù)制子，變嚴(yán)緊為松弛，變少拷貝為多拷貝

（5）根據(jù)基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件方法就是重組，拼拼接接，挖肉補(bǔ)瘡。第二十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新多拷貝質(zhì)粒經(jīng)過人工突變，除去控制拷貝數(shù)負(fù)調(diào)節(jié)基因，使質(zhì)?？截悢?shù)達(dá)到每個(gè)細(xì)胞數(shù)千，用于擴(kuò)增外源基因。

測序質(zhì)?？截悢?shù)高，加裝測定順序所必需的序列，如多切口接頭，便于各種片段方便克隆

整合質(zhì)粒裝有整合促進(jìn)基因及整合特異序列，便于外源基因準(zhǔn)確重組整合入受體細(xì)胞的染色體上

穿梭質(zhì)粒

含有兩個(gè)不同的復(fù)制子，能在兩種不同的受體細(xì)胞中復(fù)制

表達(dá)質(zhì)粒裝有強(qiáng)的啟動(dòng)基因，合適的順序以及有效的終止子，以便任何外源基因在受體細(xì)胞內(nèi)的高效表達(dá)

探針質(zhì)粒篩選克隆或?qū)ふ一蛟?，他通常裝有一個(gè)可以定量測定其表達(dá)的標(biāo)記基因，如抗性基因。篩選啟動(dòng)基因、終止子等。

人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能及用途分為：第二十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli質(zhì)粒載體二、質(zhì)粒（plasmid）載體的構(gòu)建3、人工組建克隆載體-pBR322大?。?.3kb選擇標(biāo)記：AprTcr單一酶切位點(diǎn)：EcoRⅠHindⅢBamHⅠPstⅠISalⅠ等第二十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli質(zhì)粒載體二、質(zhì)粒（plasmid）載體的構(gòu)建3、人工組建克隆載體-pBR322用于組建pBR322的三個(gè)親本質(zhì)粒的特征：pSE2124：Apr基因pMB8:ColEI松弛型復(fù)制子pSC101:Tcr基因第二十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第二十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli質(zhì)粒載體二、質(zhì)粒（plasmid）載體的構(gòu)建4、人工組建克隆載體-pUC系列質(zhì)粒多拷貝大腸桿菌型質(zhì)粒，包括pUC8/9pUC18/19pUC的親本質(zhì)粒是pBR322,包括如下四個(gè)部分：來自pBR322的復(fù)制起點(diǎn)（ori）來自pBR322的Apr基因（核甘酸序列已發(fā)生改變）E.coli的lacZ基因及其啟動(dòng)子組成lacZ‘

基因lacZ‘內(nèi)部人工組裝了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS）它含有如下單一酶切口：EcoRI、SstI、KpnI、SmaI、BamHI、XbalI、PstI、SphI、HindIII，。第二十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli質(zhì)粒載體二、質(zhì)粒（plasmid）載體的構(gòu)建4、人工組建克隆載體-pUC系列質(zhì)粒pUC系列質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)更小的相對分子量和更高的拷貝數(shù)可用組織化學(xué)法檢測重組體具有多克隆位點(diǎn)（MCS）區(qū)段是基因工程中目前最常用的E.coli克隆載體第二十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli質(zhì)粒載體三、質(zhì)粒（plasmid）的制備堿裂解法

（1）將菌體懸浮在含有EDTA的緩沖液體中

（2）加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁

（3）加NaOH與SDS的混合溶液，去膜釋放內(nèi)含物

（4）加高濃度的醋酸鉀溶液沉淀染色體，去除染色體DNA及大部分蛋白質(zhì)

（5）離心取上清液，用苯酚－氯仿溶液處理，滅活去除痕量蛋白質(zhì)及核酸酶

（6）乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒

（7）無DNase的RNase處理殘余RNA第三十頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli質(zhì)粒載體三、質(zhì)粒（plasmid）的制備沸水浴法

（1）將菌體懸浮在含有EDTA和TritonX-100的緩沖液中

（2）加溶菌酶破細(xì)胞壁

（3）放入沸水浴中煮40秒

（4）離心，用無菌牙簽挑去沉淀物

（5）乙醇異丙醇沉淀第三十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新一、Ti質(zhì)粒載體

1.

根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)與Ti質(zhì)粒

G-菌，可侵入90科雙子葉植物受傷組織，形成冠癭瘤(crowngalltumor)。冠癭瘤細(xì)胞具有以下特征：i.不需要補(bǔ)充植物激素便可進(jìn)行離體培養(yǎng)ii.合成腫瘤特有的化合物—冠癭堿(opine)，能專一的為根癌農(nóng)桿菌所利用.這兩個(gè)特征由Ti質(zhì)粒決定，但該質(zhì)粒中僅有一部分進(jìn)入植物細(xì)胞。

三、其他質(zhì)粒載體第三十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新二、釀酒酵母(Saccharomyceacerevisiae)的分子克隆載體

1.克隆載體的種類

1)

按復(fù)制方式劃分

i.

自主復(fù)制型；ii.整合型（非自主復(fù)制型）YeastIntegrationplasmid(YIp)

2)按復(fù)制子來源劃分

i.附加體型-yeastepisomalplasmid(YEp)，其復(fù)制起點(diǎn)來自于釀酒酵母的天然質(zhì)粒-2μ質(zhì)粒

ii.染色體復(fù)制型-YeastReplicatingplasmid(YRp)，其復(fù)制起點(diǎn)來自染色體上的自主復(fù)制序列(ARS-autonomousreplicatingsequence)三、其他質(zhì)粒載體第三十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新4.pYAC載體

酵母菌人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)廣泛用于構(gòu)建高等動(dòng)植物基因組文庫的構(gòu)建,由YLp經(jīng)適當(dāng)改造后構(gòu)建成pYAC載體。pYAC載體具有以下特點(diǎn)：

1）

雙TEL位點(diǎn)；2）

三個(gè)酵母菌遺傳標(biāo)記基因；

3）

一個(gè)SUP4基因用于檢測重組子，其原理是：SUP4是tRNAtyr的赭色抑制突變基因，但把該基因轉(zhuǎn)入酵母菌的ade2赭色突變體時(shí)，宿主菌為白色菌落，要是在SUP4基因中插入外源DNA片段后在轉(zhuǎn)化ade2宿主菌，轉(zhuǎn)化子成紅色菌落。第三十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新YAC:酵母人工染色體（yeastartificialchromosome）目前能容納最大外源DNA片斷的載體.YAC載體有兩個(gè)臂，每個(gè)臂的末端有一個(gè)端粒（TEL），臂上有著絲粒（CEN）、自主復(fù)制序列（ARS）、選擇標(biāo)記（TRP1和URA3）裝載容量：50Kb---2000KbYAC載體是以質(zhì)粒的形式出現(xiàn)，如：pYAC2第三十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第三十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第二節(jié)λ噬菌體載體一、l噬菌體的分子生物學(xué)l噬菌體是大腸桿菌的噬菌體，它由外殼蛋白和lDNA組成1.l-DNA的物理圖譜

l-DNA為線狀雙鏈DNA分子，兩端各有一個(gè)12核苷酸的互補(bǔ)單鏈（粘性末端），稱為cos區(qū)，全長48.5kb。

左邊是外殼蛋白的基因，右邊是負(fù)責(zé)裂解宿主細(xì)胞，DNA自主復(fù)制以及調(diào)控基因，中間是負(fù)責(zé)與宿主染色體DNA遺傳重組整合的基因第三十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第二節(jié)λ噬菌體載體二、l噬菌體載體的構(gòu)建天然的l－DNA由于包裝上下限的存在以及同種酶切口太多不適合作為重組實(shí)驗(yàn)的載體1.縮短長度

野生型l－DNA包裝的上限為50.9kb，本身長度為48.5kb，那么外源DNA片段允許插入的大小至多為2.4kb，這樣才能被包裝成有感染能力的噬菌體顆粒，如果將縮短便提高裝載量。其實(shí)l－DNA上約有40-50%的DNA片段（J-N區(qū)間）是復(fù)制，裂解所不必需的，將之切除便可提高載量。第三十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第二節(jié)λ噬菌體載體二、l噬菌體載體的構(gòu)建縮短長度

插入型載體

該類載體經(jīng)改造后的長度為37kb，有單一酶切位點(diǎn)，便于外源DNA的插入。其允許插入片段最大為13.9kb。根據(jù)插入失活效應(yīng)的特異性分為兩種亞型：免疫功能失活插入型載體β－半乳糖苷酶失活插入型載體第三十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第二節(jié)λ噬菌體載體二、l噬菌體載體的構(gòu)建縮短長度

替換型載體（取代型載體）

該類載體經(jīng)改造后的長度約為40kb，但在非必需區(qū)域內(nèi)含有兩個(gè)相同的酶切口（如EcoRI、HindIII、或salI），兩者間的距離為14kb長，使用時(shí)用酶切開，分離去除這個(gè)14kb長的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之。第四十頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第二節(jié)λ噬菌體載體二、l噬菌體載體的構(gòu)建刪除重復(fù)的酶切口插入型載體在插入位點(diǎn)有一酶切口，但這必須是唯一的；取代型載體在取代位點(diǎn)有兩個(gè)酶切口，多了也不行天然的l-DNA上有許多重復(fù)的酶切口，如：EcoRI5個(gè)，HindIII7個(gè)，這些多余的酶切口必須被刪除。第四十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第二節(jié)λ噬菌體載體二、l噬菌體載體的構(gòu)建構(gòu)建琥珀型密碼子突變體

終止密碼子有三種：UAA（赭石）；UGA（乳白）；UAG（琥珀）

琥珀型突變：CAG-UAG（stop）

將野生型λ-DNA上A和B兩個(gè)頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG，當(dāng)這種l-DNA進(jìn)入一般大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的A和B頭部蛋白，也就不能被包裝，不能裂解細(xì)菌。阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散，而基因工程實(shí)驗(yàn)中用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株。第四十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第二節(jié)λ噬菌體載體三、l-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)l-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效感染大腸桿菌l-DNA作為載體，其裝載外源DNA的能力為25kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量重組l-DNA的篩選較為方便4.重組l-DNA分子的提取比質(zhì)粒容易第四十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第三節(jié)Cosmid載體一、Cosmid的定義

Cosmid（cossite—carryingplasmid）：是一類由人工構(gòu)建的含有l(wèi)-DNA兩端cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體。質(zhì)粒復(fù)制子包括：一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)和兩個(gè)抗性基因Apr

、Tcr。第四十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新Cosmid載體的特點(diǎn)具有λ噬菌體的特性；具有質(zhì)粒載體的特性；具有較高容量的克隆能力；具有與同源性序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力第四十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第三節(jié)Cosmid載體二、Cosmid的構(gòu)建

Cosmid含有l(wèi)-DNA兩端cos區(qū)的質(zhì)粒。由于l-DNA包裝時(shí)，其包裝蛋白只識(shí)別粘性末端附近的一小段順序，均1.5kb長。如果將這一小段DNA與質(zhì)粒連在一起，則這個(gè)重組質(zhì)粒就可裝載更大的外源DNA片段，同時(shí)它仍可象l-DNA一樣，在體外被包裝成有感染活性的噬菌體顆粒，并高效感染大腸桿菌，與λ噬菌體DNA所不同的是，Cosmid不能在體內(nèi)被包裝，更不能裂解細(xì)胞，它的制備與質(zhì)粒相同。進(jìn)入細(xì)胞后，通過質(zhì)粒上的復(fù)制子進(jìn)行復(fù)制。第四十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第三節(jié)Cosmid載體三、Cosmid的優(yōu)越性1.能象l-DNA一樣體外包裝，并高效導(dǎo)入受體細(xì)胞2.可以裝載比質(zhì)?；騦-DNA大得多的外源DNA片段，如cos區(qū)及附近順序長為1.7kb，質(zhì)粒長為3.3kb，則該Cosmid最大可裝載45.9kb的外源DNA3.由于攜帶質(zhì)粒的選擇標(biāo)記，便于篩選4.由于質(zhì)粒上的多種單一酶切位點(diǎn)，便于克隆。第四十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新采用Cosmid作載體的困難①載體自身只相當(dāng)于可以插入片段的1/10左右，因此往往會(huì)出現(xiàn)載體同載體自身連接，結(jié)果在一個(gè)重組分子內(nèi)可有幾個(gè)柯斯質(zhì)粒載體連在一起。但用堿性磷酸酶處理，可阻止載體分子自身連接；②大小不等的外源片段相互連接后插入同一個(gè)載體分子，結(jié)果使在基因組內(nèi)本來不是相鄰的片段錯(cuò)亂地連接成一個(gè)片段，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，后來專門選出30～45kb的外源DNA插入載體DNA，此時(shí)，每個(gè)載體只可能插入一個(gè)外源片段，因?yàn)槿绻€(gè)片段，則將超過包裝成噬菌體顆粒的限度；③細(xì)菌的菌落體積遠(yuǎn)大于噬菌斑，因此如用柯斯質(zhì)粒制備基因文庫，則篩選所需的含某一DNA片段的菌落很費(fèi)時(shí)間。第四十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第四節(jié)單鏈DNA噬菌體M13一、M13單鏈?zhǔn)删w的分子生物學(xué)M13是一種單鏈DNA噬菌體，總長6407bp，閉合環(huán)狀正鏈ssDNA。噬菌體首先吸附大腸桿菌的雄性鞭毛上，然后穿過鞭毛內(nèi)孔將DNA注入細(xì)菌體內(nèi)。

單鏈DNA利用宿主細(xì)胞的復(fù)制另一條鏈（負(fù)鏈），形成dsDNA（RFDNA），故M13能以dsDNA的形式從細(xì)胞中分離作為克隆載體宿主細(xì)胞不會(huì)發(fā)生裂解。第四十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新M13載體

具有多克隆位點(diǎn)(MCS)，方便克隆。許多M13載體的多克隆位點(diǎn)與質(zhì)粒載體pUC序列的多克隆位點(diǎn)是相同的，在克隆位點(diǎn)選擇上更為方便?？梢远ㄏ虻乜寺NA片段，克隆在M13RFDNA分子上的雙鏈DNA片段，到了子代噬菌體便成了單鏈的形式。所以如果要同時(shí)分離ＤＮＡ分子中的雙鏈，則需要兩種獨(dú)立的克隆。根據(jù)M13的生物學(xué)特性知道，M13子代噬菌體中總是只含有（＋）鏈，所以M13載體克隆的外源DNA片段在子代噬菌體中究竟是含有DNA分子中的哪條鏈，則完全取決于外源ＤＮＡ克隆時(shí)的取向。這樣一來，為分別分離外源ＤＮＡ分子的兩條鏈帶來一定的麻煩，解決這一問題的一個(gè)行之有效的方法就是定向克隆技術(shù)。

第五十頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第四節(jié)單鏈DNA噬菌體M13二、M13-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)及用途1、最為顯著的優(yōu)點(diǎn)是它能使插入的外源DNA片段變成單鏈，單鏈DNA的用途：

用于雙脫氧末端終止測定DNA順序用于單鏈DNA的定點(diǎn)誘變

用于合成探針第五十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第四節(jié)單鏈DNA噬菌體M13二、M13-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)及用途2.篩選方便

感染的受體細(xì)胞生長緩慢，形成渾濁圈，易于挑選辨認(rèn)而且重組分子越大，渾濁圈的渾濁度亦越大，這樣可以直接辨認(rèn)哪些菌落含有外源DNA片段。第五十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第五節(jié)其他載體一、BAC：細(xì)菌人工染色體（bacterialart