大腸桿菌基因工程1

大腸桿菌基因工程1第1頁/共63頁基因工程課程內(nèi)容5

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基因工程概論分子克隆單元操作大腸桿菌基因工程酵母基因工程動物基因工程植物基因工程基因工程進(jìn)展第2頁/共63頁回顧：基因工程的基本目的是什么？1、獲取、整理遺傳信息資源：破解生命之謎、利用基因資源2、生產(chǎn)功能蛋白或化學(xué)原料研究用途：基因功能研究，工具酶、免疫分析用抗原/抗體醫(yī)藥用途：蛋白/多肽藥物、抗原（疫苗）、抗體（治療/診斷）、免疫毒素等。

工業(yè)用途：工業(yè)用酶、工業(yè)原料3、改良生物性狀：分子育種（改良/創(chuàng)造）、基因治療/免疫

第3頁/共63頁問題：如何利用基因資源？克隆目的基因轉(zhuǎn)入特定宿主表達(dá)目的基因生產(chǎn)蛋白/多肽：強(qiáng)調(diào)高效分子育種/基因治療/免疫：強(qiáng)調(diào)可控全基因：基因文庫/PCR編碼序列：cDNA文庫/RT-PCR/合成選擇宿主（特點、優(yōu)缺點？）構(gòu)建表達(dá)載體（關(guān)鍵元件、調(diào)控原理？）轉(zhuǎn)基因（轉(zhuǎn)化系統(tǒng)、導(dǎo)入方法？）第4頁/共63頁基因工程主要宿主系統(tǒng)

原核細(xì)胞(Prokaryotic)真菌（Fungus)

昆蟲(Baculovirus)

高等真核細(xì)胞（Eukaryotic)人（基因治療）動、植物（基因農(nóng)場）第5頁/共63頁主要的蛋白質(zhì)生產(chǎn)宿主系統(tǒng)I原核：大腸桿菌Escherichiacoli*****

枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis**

II低等真核：釀酒酵母Saccharomycescerevisiae

畢赤酵母Pichiapastoris***漢森酵母Hansenulapolymopha**

黑曲霉菌Aspergillusniger

**

III高等真核：

中國倉鼠細(xì)胞（CHO）***

昆蟲細(xì)胞——桿狀病毒**重點：各自優(yōu)缺點是什么？第6頁/共63頁表達(dá)載體的基本條件（關(guān)鍵元件）1、高效的、可調(diào)控的表達(dá)元件

1）轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后水平：DNAmRNA原核：啟動子、終止子真核：啟動子、終止子、增強(qiáng)子、PolyA位點、內(nèi)含子2）

翻譯水平原核：核糖體結(jié)合位點（如SD序列）真核：5’-端非翻譯區(qū)（5’-UTR）3)翻譯后水平:信號肽重點：各宿主系統(tǒng)表達(dá)載體的關(guān)鍵元件、調(diào)控原理與優(yōu)化策略？第7頁/共63頁表達(dá)載體的基本條件（關(guān)鍵元件）

3、便于篩選大腸桿菌中的篩選標(biāo)記（表達(dá)載體構(gòu)建）

最終宿主系統(tǒng)的篩選標(biāo)記（轉(zhuǎn)基因宿主篩選）4、便于目的基因亞克?。憾嗫寺∥稽c2、高拷貝數(shù)與遺傳穩(wěn)定

自主復(fù)制（高拷貝、不穩(wěn)定）

整合（低拷貝、穩(wěn)定）第8頁/共63頁典型的原核表達(dá)載體第9頁/共63頁典型的原核表達(dá)載體第10頁/共63頁典型的真核表達(dá)載體第11頁/共63頁第三章大腸桿菌基因工程Escherichiacoli

（SEM，×14000）

第12頁/共63頁四、工程菌構(gòu)建、分析、發(fā)酵與產(chǎn)物分離純化三、工程菌構(gòu)建策略二、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)原理一、大腸桿菌表達(dá)（生產(chǎn)）系統(tǒng)的優(yōu)缺點五、利用大腸桿菌系統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白案例第三章大腸桿菌基因工程第13頁/共63頁一、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點第14頁/共63頁原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的差別第15頁/共63頁生長速度驚人的大腸桿菌第16頁/共63頁遺傳背景清楚（4405個ORF），便于基因操作表達(dá)水平高，遺傳較穩(wěn)定

優(yōu)良的工業(yè)性能：繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、被美國FDA認(rèn)定為安全的重組藥物生產(chǎn)系統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點第17頁/共63頁胞內(nèi)缺乏高效的表達(dá)產(chǎn)物折疊機(jī)制（形成包涵體），分泌機(jī)制不完善缺乏翻譯后修飾加工系統(tǒng)（不能表達(dá)糖基化蛋白、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白等）細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的缺點第18頁/共63頁

初次嘗試掃盲亂棍打棗入門系統(tǒng)優(yōu)化中級自成一體高手成功的實驗都是一樣的，失敗的實驗各有各的不幸第19頁/共63頁二、大腸桿菌系統(tǒng)高效表達(dá)原理啟動子（轉(zhuǎn)錄）終止子（轉(zhuǎn)錄）核糖體結(jié)合位點（翻譯）密碼子（翻譯）質(zhì)?？截悢?shù)（轉(zhuǎn)錄）第20頁/共63頁大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)載體的基本元件A、目的基因：編碼外源蛋白的結(jié)構(gòu)基因B、轉(zhuǎn)錄元件：啟動子、終止子C、翻譯元件：核糖體結(jié)合位點、翻譯起始位點D、克隆元件：克隆位點、復(fù)制原點、標(biāo)記基因E、翻譯后元件（非必須）：信號肽、融合肽第21頁/共63頁大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)載體的物理圖譜第22頁/共63頁1、啟動子與外源基因表達(dá)

*是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始RNA合成的序列。*是基因表達(dá)最關(guān)鍵調(diào)控元件（沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄）。*啟動子有種屬特異性（如真核的在原核宿主中無效）*有組成型和誘導(dǎo)型二大類啟動子(Promoter)第23頁/共63頁組成型與誘導(dǎo)型啟動子*無需誘導(dǎo)*整個生長過程一直不停地表達(dá)目的蛋白*一般采用基礎(chǔ)代謝關(guān)鍵酶基因的啟動子*不適合表達(dá)一些對宿主細(xì)菌生長有害的蛋白產(chǎn)物*表達(dá)量通常不高：過量或者有害表達(dá)影響細(xì)菌生長組成型表達(dá)系統(tǒng)第24頁/共63頁組成型與誘導(dǎo)型啟動子*只有在誘導(dǎo)劑存在的條件下才能表達(dá)目的產(chǎn)物*使生長相與表達(dá)相分開，避免表達(dá)與生長爭營養(yǎng)和對菌體的毒害*可減少菌體蛋白酶對目標(biāo)產(chǎn)物的降解*特別適合解決有毒蛋白的表達(dá)*啟動子是組成型的，但是啟動子所依賴的轉(zhuǎn)錄酶是誘導(dǎo)表達(dá)的，也屬于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)第25頁/共63頁原核基因啟動子原核生物啟動子是由兩段彼此分開且又高度保守的核苷酸序列組成：

（1）Pribnow盒，位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游5—10bp，一般由6～8個堿基組成，富含A和T，故又稱為TATA盒或—10區(qū)。

（2）—35區(qū)，位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游35bp處，故稱—35區(qū)，一般由10個堿基組成。第26頁/共63頁啟動子保守序列-35區(qū)序列-10區(qū)序列PlLPrecAPtrpPlacPtraAPtac啟動子TTGACAGATACTTTGATATATAATTTGACATTAACTTAGACATAATGTTTTACATATAATTTGACATATAATPtac

=

3

Ptrp

=

11

PlacPtac

=

3

Ptrp

=

11

Plac第27頁/共63頁啟動子的篩選AprorigalKpKO1終止子采用鳥槍法策略，將合適大小的DNA片段克隆到啟動子探針質(zhì)粒pKO1上宿主細(xì)胞染色體DNA上的galE、galT與質(zhì)粒上報告基因galk的表達(dá)產(chǎn)物聯(lián)合作用，可將培養(yǎng)基中的半乳糖酵解成紅色素物質(zhì)轉(zhuǎn)化galE+、galT+、galK-的大腸桿菌受體菌株含有外源啟動子活性的重組克隆第28頁/共63頁常用原核基因啟動子

lac(乳糖啟動子)trp(色氨酸啟動子)tac（乳糖和色氨酸的雜合啟動子PL和PR(λ噬菌體的左向和右向啟動子)T7啟動子第29頁/共63頁啟動子P乳糖啟動子（Plac）負(fù)調(diào)控（lacI）：OPO高效轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白誘導(dǎo)乳糖異丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）野生型的Plac與其控制區(qū)Olac偶聯(lián)在一起，在沒有誘導(dǎo)物存在時，整個操縱子處于基基底水平轉(zhuǎn)錄底水平表達(dá)；誘導(dǎo)物可以使啟動子Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄大幅提高第30頁/共63頁P乳糖啟動子PlacOPO高效轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白誘導(dǎo)乳糖異丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）野生型的Plac與其控制區(qū)Olac偶聯(lián)在一起，在沒有誘導(dǎo)物存在時，整個操縱子處于基基底水平轉(zhuǎn)錄底水平表達(dá)；誘導(dǎo)物可以使啟動子Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄大幅提高lacI負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄受CAP正調(diào)控和lacI負(fù)調(diào)控第31頁/共63頁P乳糖啟動子PlacOPO高效轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白誘導(dǎo)乳糖異丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）野生型的Plac與其控制區(qū)Olac偶聯(lián)在一起，在沒有誘導(dǎo)物存在時，整個操縱子處于基基底水平轉(zhuǎn)錄底水平表達(dá)；誘導(dǎo)物可以使啟動子Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄大幅提高轉(zhuǎn)錄受CAP正調(diào)控和lacI負(fù)調(diào)控lacI負(fù)調(diào)控第32頁/共63頁P乳糖啟動子PlacOPO高效轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白誘導(dǎo)乳糖異丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）野生型的Plac與其控制區(qū)Olac偶聯(lián)在一起，在沒有誘導(dǎo)物存在時，整個操縱子處于基高水平轉(zhuǎn)錄底水平表達(dá)；誘導(dǎo)物可以使啟動子Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄大幅提高轉(zhuǎn)錄受CAP正調(diào)控和lacI負(fù)調(diào)控lacI負(fù)調(diào)控第33頁/共63頁P乳糖啟動子PlacO高效轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白誘導(dǎo)乳糖異丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）野生型的Plac與其控制區(qū)Olac偶聯(lián)在一起，在沒有誘導(dǎo)物存在時，整個操縱子處于基底水平表達(dá)；誘導(dǎo)物可以使啟動子Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄大幅提高轉(zhuǎn)錄受CAP正調(diào)控和lacI負(fù)調(diào)控lacI負(fù)調(diào)控第34頁/共63頁問題1：葡萄糖是宿主最適碳源，而啟動子受葡萄糖阻遏，不便于發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計

對策：采用突變型PlacUV5（不受葡萄糖阻遏）Plac

-lacI調(diào)控模式的問題與策略第35頁/共63頁PlacCAP正調(diào)控OPlacO高效轉(zhuǎn)錄葡萄糖代謝野生型的Plac上游附近擁有代謝激活蛋白（CAP）結(jié)合區(qū)，cAMP激活CAP，CAP基底水平轉(zhuǎn)錄結(jié)合啟動子控制區(qū)，進(jìn)而促進(jìn)Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。葡萄糖代謝使cAMP減少，也能阻遏Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。因此，可采用突變手段構(gòu)建抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即PlacUV5CAPcAMPcAMP濃度降低PlacUV5O高效轉(zhuǎn)錄突變型乳糖啟動子PlacUV5第36頁/共63頁問題2乳糖容易被宿主菌利用和降解，不宜作為誘導(dǎo)劑對策采用“安慰誘導(dǎo)劑”IPTG（不被降解和代謝）Plac

-lacI調(diào)控模式的問題與策略IPTG：異丙基D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside)第37頁/共63頁問題3：宿主lacI阻遏蛋白表達(dá)量不高，無法滿足多拷貝質(zhì)粒的需求，導(dǎo)致較高的本底表達(dá)（即無誘導(dǎo)表達(dá)）

對策

A、采用能過量表達(dá)lacI阻遏蛋白的lacIq

突變菌株

B、在

載體上引入lacIq

基因Plac

-lacI調(diào)控模式的問題與策略第38頁/共63頁啟動子Ptrp色氨酸啟動子（Ptrp）Otrp除去色氨酸色氨酸啟動子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白復(fù)合物的阻遏，轉(zhuǎn)錄呈基底狀態(tài)。在培養(yǎng)系統(tǒng)中去除色氨酸基底水平轉(zhuǎn)錄或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的細(xì)菌培養(yǎng)體系中，除去色氨酸是困難的，因此基因工程中往往添加IAA誘導(dǎo)Ptrp介導(dǎo)的目基因的表達(dá)色氨酸或加3-吲哚丙烯酸高效轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白（IAA）OtrpPtrp高效轉(zhuǎn)錄OtrpPtrp第39頁/共63頁受lacI阻遏蛋白調(diào)控雜合型啟動子PtacPtac

=

Ptrp

的-35區(qū)+

Plac的-10區(qū)Ptac

=

3

Ptrp

=

11

Plac（TTGACA）（TATAAT）受什么誘導(dǎo)？第40頁/共63頁l噬菌體啟動子PL/PR受CI阻遏蛋白阻遏CI為組成型表達(dá)常采用溫度敏感型突變cI857cI857阻遏蛋在42℃時失活脫落，PL便可介導(dǎo)目的基因的表達(dá)實踐中，28-37℃培養(yǎng)，42℃誘導(dǎo)。30℃/37℃？第41頁/共63頁發(fā)酵罐中大規(guī)模升溫困難如何解決？常使Ptrp控制的CI用一個雙質(zhì)粒控制系統(tǒng)，用色氨酸間接控制目的基因表達(dá)（不是加3-吲哚丙烯酸，IAA）。PtrpABcI857PL目的基因阻遏作用PtrpABPL表達(dá)色氨酸第42頁/共63頁T7啟動子——來自T7噬菌體的異源啟動子第43頁/共63頁T7啟動子——最成功的啟動子

*只有T7RNA聚合酶才能識別T7啟動子*T7RNA聚合酶合成mRNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶的快5倍*由于大腸桿菌本身不含T7RNA聚合酶，需要將外源的T7RNA聚合酶引入宿主菌。*通過調(diào)控T7RNA聚合酶的表達(dá)間接調(diào)控外源基因的表達(dá)*以Novagen公司的pET系統(tǒng)為杰出代表。第44頁/共63頁T7啟動子調(diào)控模式

IPTG誘導(dǎo)T7RNA聚合酶表達(dá)噬菌體DE3（lambda噬菌體的衍生株）含有l(wèi)acI抑制基因和位于lacUV5啟動子下的T7RNA聚合酶基因。DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)就是最常用的表達(dá)菌株，構(gòu)建好的表達(dá)載體可以直接轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株中，誘導(dǎo)調(diào)控方式和lac一樣都是IPTG誘導(dǎo)。第45頁/共63頁T7啟動子調(diào)控模式

2.熱誘導(dǎo)T7RNA聚合酶用不含T7RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，用λCE6噬菌體侵染宿主細(xì)胞——CE6是lambda噬菌體含溫度敏感突變(cI857ts)和pL/pR啟動子控制T7RNA聚合酶的衍生株，在熱誘導(dǎo)條件下可以激活T7RNA聚合酶的合成。第46頁/共63頁T7啟動子調(diào)控模式

3.溶氧誘導(dǎo)T7RNA聚合酶通過共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒提供T7RNA聚合酶。用受溶氧濃度控制的啟動子調(diào)控T7RNA聚合酶合成，以適合工業(yè)化發(fā)酵的條件控制。第47頁/共63頁T7啟動子調(diào)控模式

4.抑制本底表達(dá)方法

1）培養(yǎng)基外加葡萄糖，有助于控制本底表達(dá)水平。2)向宿主細(xì)胞引入T7融菌酶質(zhì)粒（pLysS），結(jié)合并抑制T7RNA聚合酶的基因。第48頁/共63頁2、終止子外源基因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降；干擾質(zhì)粒的復(fù)制及抗性，導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性；產(chǎn)生大量無用的蛋白質(zhì)，增加工程菌無謂的能量消耗；不能形成理想的二級結(jié)構(gòu)，從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率。轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象：RNA聚合酶滑過終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的DNA序列，形成長短不一的mRNA混合物。第49頁/共63頁防止轉(zhuǎn)錄過頭策略

大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2T7噬菌體DNA上的TfA、采用強(qiáng)終止子B、二聚體終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)第50頁/共63頁終止子強(qiáng)終止子的選擇與使用

目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子是來自大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2以及T7噬菌體DNA上的Tf。對于一些終止作用較弱的終止子，通常可以采用二聚體終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄終止作用終止子也可以象啟動子那樣，通過特殊的探針質(zhì)粒從細(xì)菌或噬菌體基因組DNA中克隆篩選pCP1AproriTcr篩選Apr、Tcs的轉(zhuǎn)化子第51頁/共63頁3、核糖體結(jié)合位點核糖體結(jié)合位點（RBS）:

mRNA5’

端非翻譯序列,包括SD、起始密碼子、SD與起始密碼子間的序列、起始密碼子下游序列。

商品化大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒均含有與啟動子來源相同的RBS，序列和間隔是最佳的

第52頁/共63頁核糖體結(jié)合位點SD序列（Shine-Dalgarno）：

位于翻譯起始密碼子上游的6-8個核苷酸序列（5’UAAGGAGG3’），它通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的16SrRNA3’端區(qū)域3’AUUCCUCC5’并與之專一性結(jié)合，將mRNA定位于核糖體上，從而啟動翻譯。第53頁/共63頁核糖體結(jié)合位點SD序列與起始密碼子之間的距離的影響：

SD序列與起始密碼子之間的精確距離保證了mRNA在核糖體上定位后，翻譯起始密碼子AUG正好處于核糖體復(fù)合物結(jié)構(gòu)中的P位，這是翻譯啟動的前提條件。

在很多情況下，SD序列位于AUG之前大約七個堿基處，在此間隔中少一個堿基或多一個堿基，均會導(dǎo)致翻譯起始效率不同程度的降低第54頁/共63頁核糖體結(jié)合位點SD序列與起始密碼子之間的序列的影響：

SD序列下游的堿基若為AAAA或UUUU，翻譯效率最高；而CCCC或GGGG的翻譯效率則分別是最高值的50%和25%。緊鄰AUG的前三個堿基成份對翻譯起始也有影響，對于大腸桿菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在這個位置上最佳的堿基組合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，則酶的表達(dá)水平低20倍第55頁/共63頁核糖體結(jié)合位點翻譯起始密碼子及其下游序列大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架的起始位點，但有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子。

起始效率差異：GUG為AUG的50%而UUG只及AUG的25%。從AUG開始的前幾個密碼子堿基序列也至關(guān)重要，至少這一序列不能與mRNA的5’端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，否則便會嚴(yán)重干擾mRNA在核糖體上的準(zhǔn)確定位。

第56頁/共63頁4、質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)粒拷貝數(shù)對細(xì)菌生長代謝的影響目前實驗室里廣泛使用的克隆用質(zhì)粒在每個大腸桿菌細(xì)胞中可達(dá)數(shù)百甚至上千個拷貝，質(zhì)粒的擴(kuò)增過程通常發(fā)生在受體細(xì)胞的對數(shù)生長期內(nèi)，而此時正是細(xì)菌生理代謝最旺盛的階段。質(zhì)粒分子的過度增殖以及其后目的基因的高效表達(dá)勢必會影響受體細(xì)胞的生長代謝，進(jìn)而導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達(dá)水平的下降

策略：較低拷貝質(zhì)粒（幾個至數(shù)十個）

調(diào)控重組質(zhì)粒的擴(kuò)增第57頁/共63