第六章-酶的分離純化優(yōu)秀文檔

TheExtraction,SeparationandPurificationofEnzyme酶的分離純化1酶的提取、分離純化技術(shù)路線細(xì)胞破碎酶提取酶分離純化酶濃縮酶干燥、貯存動(dòng)物、植物或微生物細(xì)胞發(fā)酵液離心分離，過(guò)濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。2酶的組合分離純化策略Resolution（分辨率）Speed（速度）Capacity（容量）Recovery（回收率）設(shè)計(jì)分離純化工藝的基本要求3酶分離純化的基本原則酶液的儲(chǔ)存以及所有操作都必須在低溫條件下進(jìn)行酶蛋白作為兩性電解質(zhì)，其結(jié)構(gòu)受pH值的影響酶和其他蛋白質(zhì)一樣，易在溶液表面和界面處形成薄膜而變性，因此盡量減少泡沫的形成重金屬離子可能引起酶的實(shí)效，有必要加螯合劑微生物污染及蛋白酶的存在都能是酶被降解破壞酶蛋白溶液濃度低，酶經(jīng)常迅速失活，可能是玻璃容器的表面效應(yīng)使得蛋白質(zhì)變性4酶的純化過(guò)程，約可分為三個(gè)階段：(1)粗蛋白質(zhì)(crudeprotein):采樣→均質(zhì)打破細(xì)胞→抽出全蛋白，多使用鹽析沉淀法；可以粗略去除蛋白質(zhì)以外的物質(zhì)。(2)部分純化(partiallypurified):初步的純化，使用各鐘柱層析法。(3)均質(zhì)酶(homogeneous):目標(biāo)酶的進(jìn)一步精制純化，1、酶分離純化不同階段5根據(jù)酶分子電荷性質(zhì)的分離方法大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱為鹽溶現(xiàn)象。酶的提取、分離純化技術(shù)路線定義：利用蛋白質(zhì)分子對(duì)其配體分子特有的識(shí)別能力JY92-IID超聲波3、細(xì)胞破碎方法及其原理離心分離，過(guò)濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。酶蛋白作為兩性電解質(zhì)，其結(jié)構(gòu)受pH值的影響TheExtraction,SeparationandPurificationofEnzyme超濾原理的示意圖高濃度的中性鹽降低蛋白質(zhì)的溶解度。高鹽濃度下鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭(zhēng)奪水分子，除去蛋白質(zhì)的水合外殼，降低溶解度而沉淀。酶的純化過(guò)程，約可分為三個(gè)階段：2、細(xì)胞破碎許多酶存在于細(xì)胞內(nèi)。為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎處理。1）機(jī)械破碎2）物理破碎3）化學(xué)破碎4）酶解破碎JY92-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)細(xì)胞破碎珠高壓細(xì)胞破碎機(jī)DY89-I型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)6機(jī)械破碎搗碎法研磨法勻漿法物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法化學(xué)破碎有機(jī)溶劑：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性劑：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過(guò)機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。通過(guò)各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。通過(guò)各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎通過(guò)細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎3、細(xì)胞破碎方法及其原理7酶的提取是指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈希姑赋浞秩芙獾饺軇┗蛉芤褐械倪^(guò)程。也稱為酶的抽提。酶提取時(shí)首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇?。一般說(shuō)來(lái)，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中，非極性物質(zhì)易溶于非極性的有機(jī)溶劑中，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中。有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多的非極性基團(tuán)，則可用有機(jī)溶劑提取。

4、酶的提取8鹽提取（改變離子強(qiáng)度）基本原理（鹽溶和鹽析）

向蛋白質(zhì)或酶的水溶液中加入中性鹽，可產(chǎn)生兩種現(xiàn)象：

1)鹽溶（saltingin）：低濃度的中性鹽增加蛋白質(zhì)的溶解度。大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱為鹽溶現(xiàn)象。9在鹽濃度達(dá)到某一界限后，酶的溶解度隨鹽濃度升高而降低，這稱為鹽析現(xiàn)象。

2)鹽析（saltingout）：高濃度的中性鹽降低蛋白質(zhì)的溶解度。10

原因：高鹽濃度下鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭(zhēng)奪水分子，除去蛋白質(zhì)的水合外殼，降低溶解度而沉淀。不同蛋白質(zhì)分子量、表面電荷不同，在不同鹽濃度下沉淀，逐漸增大鹽濃度，不同蛋白質(zhì)先后析出，稱分段鹽析。11B、有機(jī)溶劑沉淀（降低介電常數(shù)）利用酶等蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同而使之分離的方法。1.沉淀機(jī)理降低溶液的介電常數(shù)部分地引起蛋白質(zhì)脫水2.常用有機(jī)溶劑丙酮乙醇甲醇，用量一般為酶液體積的2倍左右，終濃度為70%。

12有機(jī)溶劑之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有機(jī)溶劑的存在會(huì)使溶液的介電常數(shù)降低13鹽提?。ǜ淖冸x子強(qiáng)度）2)有機(jī)溶劑易燃、易爆，對(duì)安全要求較高。有機(jī)溶劑之所以能使酶沉淀析出。離心分離，過(guò)濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。離心分離，過(guò)濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。3、細(xì)胞破碎方法及其原理酶的純化過(guò)程，約可分為三個(gè)階段：定義：利用離子交換樹脂作為支持物，將帶有不同電荷的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的方法。酶的純化過(guò)程，約可分為三個(gè)階段：酶的提取、分離純化技術(shù)路線酶的純化過(guò)程，約可分為三個(gè)階段：高濃度的中性鹽降低蛋白質(zhì)的溶解度。1)鹽溶（saltingin）：Capacity（容量）高濃度的中性鹽降低蛋白質(zhì)的溶解度。4、利用生物分子專一性結(jié)合的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1）分辨率比鹽析法高2）沉淀不需脫鹽3）溶劑易蒸發(fā)，沉淀易離心缺點(diǎn)：1）容易引起蛋白質(zhì)變性失活2)有機(jī)溶劑易燃、易爆，對(duì)安全要求較高。

145.酶的純化與精制根據(jù)酶分子大小和形狀的分離方法1）離心分離152）凝膠過(guò)濾FLASH163）透析與超濾17

超濾原理的示意圖

18設(shè)計(jì)分離純化工藝的基本要求微生物污染及蛋白酶的存在都能是酶被降解破壞降低溶液的介電常數(shù)通過(guò)機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。鹽提?。ǜ淖冸x子強(qiáng)度）B、有機(jī)溶劑沉淀（降低介電常數(shù)）低濃度的中性鹽增加蛋白質(zhì)的溶解度。通過(guò)細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎根據(jù)酶分子大小和形狀的分離方法酶的純化過(guò)程，約可分為三個(gè)階段：酶蛋白作為兩性電解質(zhì)，其結(jié)構(gòu)受pH值的影響向蛋白質(zhì)或酶的水溶液中加入中性鹽，可產(chǎn)生兩種現(xiàn)象：可以粗略去除蛋白質(zhì)以外的物質(zhì)。JY92-IID超聲波微生物污染及蛋白酶的存在都能是酶被降解破壞(1)粗蛋白質(zhì)(crudeprotein):采樣→均質(zhì)打破細(xì)胞→抽出全蛋白，多使用鹽析沉淀法；酶的提取、分離純化技術(shù)路線根據(jù)酶分子電荷性質(zhì)的分離方法1）離子交換層析定義：利用離子交換樹脂作為支持物，將帶有不同電荷的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的方法。分類:陽(yáng)離子交換樹脂,活性基團(tuán)是酸性的,如羧甲基纖維素等，陰離子交換樹脂，活性基團(tuán)是堿性的,如二乙基氨基乙基纖維素19FLASH202）電泳帶電粒子在電場(chǎng)中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)的過(guò)程稱為電泳。213）等電聚焦電泳224、利用生物分子專一性結(jié)合的分離方法定義：利用蛋白質(zhì)分子對(duì)其配體分子特有的識(shí)別能力23

原理：把待純化