化妝品菌類檢測剖析

-.z.化裝品中菌類的檢測一、菌落總數(shù)的檢測1.檢測菌落總數(shù)的意義菌落總數(shù)(aerobicbacterialcount)是指化裝品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后(如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、pH值、需氧性質(zhì)等)，1g(1mL)檢樣中所含菌落的總數(shù)。所得結(jié)果只包括一群本方法規(guī)定的條件下生長的嗜中溫的需氧性菌落總數(shù)。測定菌落總數(shù)便于判明樣品被細(xì)菌污染的程度，是對樣品進展衛(wèi)生學(xué)總評價的綜合依據(jù)。2．操作步驟及檢驗結(jié)果〔1〕檢驗步驟①用滅菌吸管吸取1:10稀釋的檢液2mL，分別注入到兩個滅菌平皿內(nèi)，每皿1mL。另取1mL注入到9mL滅菌生理鹽水試管中(注意勿使吸管接觸液面)，更換一支吸管，并充分混勻，制成1:100檢液。吸取2mL，分別注入到兩個滅菌平皿內(nèi)，每皿1mL。如樣品含菌量高，還可再稀釋成1:1000，1:10000，……等，每種稀釋度應(yīng)換1支吸管。②將融化并冷至45℃～50℃的卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注到平皿內(nèi)，每皿約15mL，隨即轉(zhuǎn)動平皿，使樣品與培養(yǎng)基充分混合均勻，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h。另取一個不加樣品的滅菌空平皿，參加約15mL③為便于區(qū)別化裝品中的顆粒與菌落，可在每100mL卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂中參加1mL0.5%的TTC溶液，如有細(xì)菌存在，培養(yǎng)后菌落呈紅色，而化裝品的顆粒顏色無變化?！?〕菌落計數(shù)方法先用肉眼觀察，點數(shù)菌落數(shù)，然后再用放大5～10倍的放大鏡檢查，以防遺漏。記下各平皿的菌落數(shù)后，求出同一稀釋度各平皿生長的平均菌落數(shù)。假設(shè)平皿中有連成片狀的菌落或花點樣菌落蔓延生長時，該平皿不宜計數(shù)。假設(shè)片狀菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落數(shù)分布又很均勻，則可將此半個平皿菌落計數(shù)后乘以2，以代表全皿菌落數(shù)。〔3〕菌落計數(shù)及報告方法①首先選取平均菌落數(shù)在30～300個之間的平皿，作為菌落總數(shù)測定的范圍。當(dāng)只有一個稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時，即以該平皿菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)(見表1中例1)。②假設(shè)有兩個稀釋度，其平均菌落數(shù)均在30～300個之間，則應(yīng)求出兩菌落總數(shù)之比值來決定，假設(shè)其比值小于或等于2，應(yīng)報告其平均數(shù)，假設(shè)大于2則報告其中稀釋度較低的平皿的菌落數(shù)(見表1中例2及例3)。③假設(shè)所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300個，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之(見表1中例4)。④假設(shè)所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30個，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之(見表1例5)。⑤假設(shè)所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30～300個之間，其中一個稀釋度大于300個，而相鄰的另一稀釋度小于30個時，則以接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之(見表1中例6)。⑥假設(shè)所有的稀釋度均無菌生長，報告數(shù)為每g或每mL小于10CFU。⑦菌落計數(shù)的報告，菌落數(shù)在10以內(nèi)時，按實有數(shù)值報告之，大于100時，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，應(yīng)以四舍五入法計算。為了縮短數(shù)字后面零的個數(shù)，可用10的指數(shù)來表示(見表1報告方式欄)。在報告菌落數(shù)為"不可計〞時，應(yīng)注明樣品的稀釋度。表1菌落計數(shù)結(jié)果及報告方式例次不同稀釋度平均菌落數(shù)10-110-210-3兩稀釋度菌數(shù)之比菌落總數(shù)CFU\ml或CFU/g報告方式CFU/mL或CFU/g1136516420─1640016000或1.6×10422760295461.63800038000或3.8×10432890271602.22710027000或2.7×1044不可計4650513─513000510000或5.1×105527115─270270或2.7×1026不可計30512─3050031000或3.1×1047000─＜１×10＜10＊CFU：菌落形成單位。二、糞大腸桿菌的檢測1.檢測糞大腸桿菌的意義大腸菌群并非細(xì)菌學(xué)分類命名，而是衛(wèi)生細(xì)菌領(lǐng)域的用語，它不代表*一個或*一屬細(xì)菌，而指的是具有*些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致，其定義為：需氧及兼性厭氧、在37℃大腸菌群是作為糞便污染指標(biāo)菌提出來的，主要是以該菌群的檢出情況來表示化裝品中有否糞便污染。大腸菌群數(shù)的上下，說明了糞便污染的程度，也反映了對人體安康危害性的大小。是重要的衛(wèi)生指示菌。2.檢測糞大腸桿菌的生化特性糞大腸菌群為一群需氧及兼性厭氧的菌群，呈革蘭氏陰性反響，能在普通培養(yǎng)基上生長繁殖。其生化活動能力較強，能發(fā)酵多種糖類，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，其特點是能較快發(fā)酵乳糖。

糞大腸菌群在乳糖培養(yǎng)基中于37℃下進展培養(yǎng)，在24h內(nèi)能使乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸，還有甲酸氫酶進展甲酸分解，生成氫氣和二氧化碳，產(chǎn)生大量氣體，這時，假設(shè)參加伊紅美藍(lán)指示劑，分解乳糖所產(chǎn)生的酸(帶正電荷)與伊紅相染呈紫色且有金屬光澤，故常用此特征來鑒定識別糞大腸菌群。將糞大腸菌群接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，于373.檢驗操作及結(jié)果報告〔1〕操作步驟①取10mL1:10稀釋的檢液，加到10mL雙倍濃度的乳糖膽鹽培養(yǎng)基中，置44℃±0.5℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24②如產(chǎn)酸產(chǎn)氣，劃線接種到伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置37℃培養(yǎng)18h～24h。同時取該培養(yǎng)液1～2滴接種到蛋白胨水中，置44℃±經(jīng)培養(yǎng)后，在上述平板上觀察有無典型菌落生長。糞大腸菌群在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上的典型菌落呈深紫黑色，圓形，邊緣整齊，外表光滑濕潤，常具有金屬光澤。也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤，或粉紫色，中心較深的菌落，亦常為糞大腸菌群，應(yīng)注意挑選。③挑取上述可疑菌落，涂片作革蘭氏染色鏡檢。④在蛋白胨水培養(yǎng)液中，參加靛基質(zhì)試劑約0.5mL，觀察靛基質(zhì)反響。陽性者液面呈玫瑰紅色；陰性反響液面呈試劑本色?！?〕檢驗結(jié)果報告根據(jù)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，平板上有典型菌落，并經(jīng)證實為革蘭氏陰性短桿菌，靛基質(zhì)試驗陽性，則可報告被檢樣品中檢出糞大腸菌群。三、綠膿桿菌的檢測1．檢測綠膿桿菌的意義

綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)為革蘭氏陰性細(xì)菌，屬假單胞菌屬。它在自然界分布甚廣，空氣、水、土壤中均有存在，在潮濕處可長期生存，對外環(huán)境的抵抗力比其他細(xì)菌強，抗枯燥的能力也強。

含水分較多的原料、化裝品易受其污染，綠膿桿菌對人類有致病力，常引起人體的眼、皮膚等處感染，特別是燒傷、燙傷及外傷患者感染上綠膿桿菌常使病情惡化，嚴(yán)重時可引起敗血癥，眼睛受傷感染后可使角膜潰瘍并穿孑L，嚴(yán)重可致失明。目前，該菌已是防止醫(yī)院感染和藥品、化裝品及水等必須嚴(yán)加控制的重要病原菌之一。我國化裝品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：在化裝品中不得檢出綠膿桿菌，因此，在化裝品中檢測綠膿桿菌具有重要意義。

2．綠膿桿菌的生化特性

綠膿桿菌是革蘭氏陰性桿菌，有鞭毛，能在普通培養(yǎng)基上生長繁殖，為需氧及兼性厭氧類細(xì)菌。綠膿桿菌能代謝產(chǎn)生一種綠色的水溶性色素，使培養(yǎng)基變成綠色，受它而引起的化膿感染，膿液就常帶綠色，因此而定名為綠膿桿菌。

綠膿桿菌可分解葡萄糖；對明膠具有液化、溶解作用；能復(fù)原硝酸，鹽成為亞硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氫氣；綠膿桿菌具有氧化酶(靛基氧化酶)能將試劑(鹽酸二甲基對苯二胺或四甲基對苯二胺)氧化成紅色的醌類化合物；還可在42℃的溫度下生長繁殖。綠膿桿菌的這些生化特性常用來作為別離和鑒別它的方法。

3．檢驗操作及結(jié)果報告

(1)檢驗操作步驟

增菌培養(yǎng)：取1:10樣品稀釋液10mL加到90mLSCDLP液體培養(yǎng)基中，置37℃進展24h別離培養(yǎng)。該類培養(yǎng)基選擇性強，大腸桿菌不能生長，革蘭氏陽性菌生長完全受到抑制。觀察培養(yǎng)基上所形成的菌落，典型綠膿桿菌菌落特征是菌落扁平無定型，向周邊擴散或略有蔓延，外表濕潤，菌落呈灰白色，菌落周圍培養(yǎng)基常擴*有水溶性色素。

證實試驗：

①染色鏡檢：取上述可疑為綠膿桿菌的菌落，進展革蘭氏染色、鏡檢試驗。

②氧化酶試驗：挑取可疑菌落(同上)置于濾紙片上，滴加一滴新配制的5％二甲基對苯二胺試劑，15~30min內(nèi)，出現(xiàn)紅色至紫紅色，為氧化酶試驗呈陽性；假設(shè)不變色，為氧化酶試驗陰性。

③綠膿菌素試驗：取可疑菌落2"-3個，置于綠膿菌素測定用培養(yǎng)基上，于37C培養(yǎng)24h，參加氯仿，色素溶于其內(nèi)后，參加鹽酸，上層稀鹽酸液內(nèi)出現(xiàn)紅色時為陽性，表示菌落中含有綠膿菌素。

④明膠液化試驗：將可疑菌落的純培養(yǎng)物，接種于硝酸鹽胨水培養(yǎng)基中，置37C_,培養(yǎng)24h，取出放人冰箱10～30min，如有溶解，即明膠液化試驗呈陽性；如凝固不溶，則明膠液化試驗呈陰性。

⑤硝酸鹽復(fù)原試驗：挑出被檢純培養(yǎng)物，接種于硝酸鹽胨水培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)24h，在培養(yǎng)基中的小倒管內(nèi)有氣體者，試驗呈陽性，說明該菌能復(fù)原硝酸鹽并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氫氣。

⑥4213生長試驗：挑取純被檢物，接種于普通瓊脂斜面培養(yǎng)上，于42'C培養(yǎng)48h，綠膿桿菌能生長為陽性反響。

(2)結(jié)果報告

被檢試樣液經(jīng)增菌、別離培養(yǎng)后，觀察菌落，對疑似綠膿桿菌菌落，證實為革蘭氏陰性桿菌，且氧化酶、綠膿菌素試驗都呈陽性，則報告試樣檢出綠膿桿菌；假設(shè)其中綠膿菌素試驗為陰性，但明膠液化試驗、硝酸鹽復(fù)原試驗及42C生長試驗都為陽性，這時也報告測試物被檢出綠膿桿菌。

四、金黃色葡萄球菌的檢測1．檢測金黃色葡萄球菌的意義

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，因能產(chǎn)生金黃色色素而得名。它為革蘭氏陽性球菌，廣泛分布于自然界、空氣、土壤及水，可在人體皮膚、鼻腔、咽喉等處生存，耐熱性強，對于枯燥和紫外光的抵抗力亦較大，為一種致病菌，可通過多種途徑侵入機體，導(dǎo)致各種疾病和可引起皮膚或器官的多種化膿性感染(故它又名為化膿性葡萄球菌)，嚴(yán)重時可導(dǎo)致敗血癥。國內(nèi)外膏霜類化裝品中曾檢出此種細(xì)菌，因此，在化裝品中檢測葡萄球菌具有重要的衛(wèi)生意義，我國化裝品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定：在化裝品中不得檢出葡萄球菌。

2．金黃色葡萄球菌和生化特性

金黃色葡萄球菌菌體呈圓球形，直徑0．8～1．0／lm，常成堆排列成葡萄狀，有時可單個、成雙或成短鏈；它為需氧或兼性厭氧類細(xì)菌，在普通營養(yǎng)培養(yǎng)基上即可生長繁殖；能在高濃度的食鹽(7％一9％)中生長繁殖，能耐高達(dá)15％的食鹽。利用此特性可與其他菌別離鑒別；它在生長繁殖過程中，在培養(yǎng)基上可代謝產(chǎn)生金黃色脂溶性色素，但也有變異菌

株產(chǎn)生淺黃或白色色素；它能分解多種糖類，能分解甘露醇，產(chǎn)酸；還可液化明膠；它的另一個特性是能產(chǎn)生溶血素，可使血液培養(yǎng)基的紅細(xì)胞溶解，在菌落周圍產(chǎn)生溶血圈；金黃色葡萄球菌還能產(chǎn)生血漿凝固酶，能使抗凝的兔或人的血漿發(fā)生凝固，其試驗方法有兩種：玻片法和試管法，葡萄球菌所產(chǎn)生的血漿凝固酶有兩種：一種為結(jié)合凝固酶，它是結(jié)合在細(xì)菌的細(xì)胞壁上，直接作用于血漿中的纖維蛋白，使細(xì)菌凝成塊狀，玻片法試驗的陽性結(jié)果是由此酶形成；另一種是在菌體內(nèi)產(chǎn)生釋放到菌體外，稱為游離血漿凝固酶，它能使血漿中的凝血酶原變?yōu)槟割惍a(chǎn)物，試管法的陽性結(jié)果是由此酶形成的。

3．檢驗操作及結(jié)果報告

(1)檢驗操作步驟

增菌培養(yǎng)：取1:10稀釋的樣品10mL接種到90mLSCDLP液體培養(yǎng)基中，置37'C培養(yǎng)24h，進展增菌培養(yǎng)。也可在含7．5％的氯化鈉肉湯培養(yǎng)基中進展增菌培養(yǎng)。

別離培養(yǎng)：從前增菌培養(yǎng)液中，取l～2接種環(huán)，劃線接種到Baird-Pairker氏培養(yǎng)基或血瓊脂平板上，置3712培養(yǎng)24～48h。BairdPairker瓊脂培養(yǎng)基中的氯化鋰可抑制革蘭氏陰性菌生長，丙酮酸鈉可刺激金黃色葡萄球菌生長；卵黃亞碲酸鉀增菌劑中氯化鈉用量大，可抑制*些細(xì)菌的生長，而卵黃中的卵磷脂有促進金黃色葡萄球菌生長和鑒別的作用。

觀察培養(yǎng)基所形成的菌落，血瓊脂培養(yǎng)基的葡萄球菌菌落顏色鮮明，茵落較大(1～2mm)，有溶血反響，菌落周圍產(chǎn)生溶血圈，容易檢出。

證實試驗：

①染色鏡檢：取可疑金黃色葡萄球菌菌落，進展革蘭氏染色、鏡檢試驗。

②甘露醇發(fā)酵試驗：取可疑菌落接種到甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)24h，金黃色葡萄球菌能分解甘露醇，使培養(yǎng)基產(chǎn)酸。

③血漿凝固酶試驗：分別進展玻片法和試管法試驗，將待檢菌落與滴加在玻片上的血漿和生理鹽水研磨，5min內(nèi)，血漿凝成塊狀或顆粒狀，而鹽水玻片上無凝固現(xiàn)象，這時玻片試驗為陽性；試管法試驗，需經(jīng)24h培養(yǎng)，血漿凝固時為陽性。；

(2)結(jié)果報告

被檢試樣液經(jīng)增菌、別離培養(yǎng)后，觀察菌落疑似金黃色葡萄球菌，證實與革蘭氏陽性葡萄球菌，并甘露醇發(fā)酵試驗及血漿凝固酶試驗均為陽性，即報告檢出金黃色葡萄球菌。

在檢驗金黃色葡萄球菌時，血漿凝固酶試驗為主要指標(biāo)。故假設(shè)疑似菌落革蘭氏陽性，不發(fā)酵甘露醇(甘露醇發(fā)酵試驗陰性)，但血漿凝固酶試驗陽性，這時也可斷定檢出金黃色葡萄球菌。

對疑似菌落，其革蘭氏陽性，假設(shè)甘露醇試驗陰性，有血漿凝固酶試驗陰性，這時可斷定為未檢出金黃色葡萄球菌。

五、霉菌酵母菌的檢測1．化裝品中檢測霉菌酵母菌的意義

霉菌在自然界分布極廣，土壤，水域、空氣、動植物體內(nèi)外都可生長霉菌，霉菌同人類的生產(chǎn)、生活有著密切的關(guān)系，它在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等部門得到了廣泛應(yīng)用，但霉菌對人類的危害愈來愈引起人們的重視。

化裝品的基質(zhì)所富有的營養(yǎng)成分及酸堿度、溫度等都適宜霉菌在化裝品中生長繁殖，化裝品的生產(chǎn)環(huán)境、生產(chǎn)設(shè)備、生產(chǎn)過程及產(chǎn)品都易受到霉菌的污染，據(jù)對局部化裝品的質(zhì)量衛(wèi)生檢查說明，霉菌對化裝品的污染是相當(dāng)嚴(yán)重的，霉菌的污染所引起的化裝品霉變，是化裝品變質(zhì)的一個主要原因。因此，在化裝品中霉菌的檢測是很重要的，目前，對于化裝品中

霉菌的檢測，我國尚未制定統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)僅介紹在化裝品中檢測霉菌酵母菌總數(shù)的方法。酵母菌在自然界分布廣泛，主要生長在偏酸性的潮濕的含糖環(huán)境中，酵母菌在有氧和無氧的環(huán)境中都能生長，即酵母菌是兼性厭氧菌，在有氧的情況下，它把糖分解成二氧化碳和水，在有氧存在時，酵母菌生長較快。在缺氧的情況下，酵母菌把糖分解成酒精和二氧化碳。因酵母屬于簡單的單細(xì)胞真核生物，易于培養(yǎng)，且生長迅速，被廣泛用于現(xiàn)代生物學(xué)研究中。2．化裝品中的霉菌酵母菌與培養(yǎng)基

(1)與化裝品關(guān)系密切的霉菌

"霉菌〞不是微生物分類學(xué)上的名稱，而是"絲狀真菌〞的統(tǒng)稱，真菌屬真核微生物。霉菌菌體是內(nèi)分枝或不分枝的菌絲組成，霉菌的繁殖能力一般都很強，而且方式多樣，包含了有性繁殖和無性繁殖。霉菌的形態(tài)各異，即使同種霉菌在不同條件下培養(yǎng)其形態(tài)也有差異，因此，各種霉菌具有其標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基，如青霉和曲霉標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基是察氏培養(yǎng)基，酵母菌是麥芽汁，常以在這些培養(yǎng)基上形成的菌落來鑒定霉菌的種類。霉菌可產(chǎn)生多種毒素，如黃曲霉菌產(chǎn)生的黃曲霉素可引起實驗動物：致癌。與化裝品關(guān)系密切的霉菌有以下幾種：

毛霉：它是一種較低等的真菌，多為腐生、寄生，具有分解蛋白質(zhì)的能力，經(jīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)其菌落為白色到灰褐色，絮狀蔓延生長迅速，菌絲粗不別離，毛霉分布于土壤、淀粉性食品、化裝品上，引起腐霉變質(zhì)。

曲霉：它是具有發(fā)酵作用的重要菌種，它能產(chǎn)生對人體有害的曲霉素，引起曲霉病，可侵犯機體多種部位如皮膚、鼻、眼、耳、氣管、肺等，形成炎性肉芽腫。經(jīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)其菌落局限像小紐扣、絲絨狀、絮狀，黃色、橙色、黃綠色等。曲霉廣泛分布于土