基因結構與功能分析

關于基因結構與功能分析第一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日第二十二章

基因結構與功能分析技術

TheAnalysisTechnologyforGeneStructureandFunction第二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日人類的多種疾病都與基因的結構或功能異常有關，因此，要闡明疾病發(fā)生的分子機制和進行有效的診斷與防治，均需首先揭示基因的結構與功能。DNA序列測定基因轉錄起點及其啟動子的分析基因編碼序列的分析基因拷貝數(shù)及其表達產物的分析基因功能獲得和/或缺失策略隨機突變篩選策略第三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日第一節(jié)

基因結構分析技術第四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日一、基因一級結構解析技術基因的一級結構是指脫氧核苷酸的排列順序，解析一級結構最精確的技術就是DNA測序（DNAsequencing）。第五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日（一）雙脫氧法和化學降解法是兩種常規(guī)的DNA測序方法Sanger雙脫氧測序（dideoxysequencing）法第六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日Maxam-Gilbert化學降解測序法第七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日（二）全自動激光熒光DNA測序技術的原理基于Sanger雙脫氧法1.四色熒光法：采用四種不同的熒光染料標記同一引物或4種不同的終止底物ddNTP，最終結果均相當于賦予DNA片段4種不同的顏色。因此，一個樣品的4個反應產物可在同一個泳道內電泳。2.單色熒光法：采用單一熒光染料標記引物5′-端或dNTP，所有產物的5′-末端均帶上了同一種熒光標記，一個樣品的四個反應必須分別進行，相應產物也必須在四個不同的泳道內電泳第八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日（三）焦磷酸測序是一種基于發(fā)光法測定焦磷酸的測序技術焦磷酸測序技術操作簡單，結果準確可靠，可應用于單核苷酸多態(tài)性位點（SNP）分析、等位基因頻率測定、細菌和病毒等微生物的分型鑒定、CpG甲基化分析、掃描與疾病相關基因序列中的突變點等領域。該方法的測序長度一般短于Sanger法。第九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日（四）循環(huán)芯片測序被稱為第二代測序技術循環(huán)芯片測序（cyclic-arraysequencing）①可實現(xiàn)大規(guī)模并行化分析②不需電泳，設備易于微型化③樣本和試劑的消耗量降低，降低了測序成本優(yōu)勢：技術平臺：454測序、Solexa測序（Illumina測序）、SOLiD測序等。第十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日基本流程：①將基因組DNA隨機切割成為小片段DNA；②在所獲小片段DNA分子的末端連上接頭，然后變性得到單鏈模板文庫；③將帶接頭的單鏈小片段DNA文庫固定于固體表面；④對固定片段進行克隆擴增，從而制成polony芯片。⑤針對芯片上的DNA，利用聚合酶或連接酶進行一系列循環(huán)反應，通過讀取堿基連接到DNA鏈過程中釋放出的光學信號而間接確定堿基序列。第十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日（五）單分子測序技術被稱為第三代測序技術主要策略：①通過摻入并檢測熒光標記的核苷酸，來實現(xiàn)單分子測序，如單分子實時技術（singlemoleculerealtimetechnology，SMRT）；②利用DNA聚合酶在DNA合成時的天然化學方式來實現(xiàn)單分子測序；③直接讀取單分子DNA序列信息。第十二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日二、基因轉錄起點分析技術轉錄起點（transcriptionstartsite，TSS）（一）用cDNA克隆直接測序法鑒定TSS以mRNA為模板，經逆轉錄合成cDNA第一鏈，同時利用逆轉錄酶的末端轉移酶活性，在cDNA第一鏈的末端加上polyC尾，并以此引導合成cDNA第二鏈。將雙鏈cDNA克隆于適宜載體，通過對克隆cDNA的5-末端進行測序分析即可確定基因的TSS序列。該方法比較簡單，尤其適于對特定基因TSS的分析。但可導致5-末端部分缺失，從而影響對TSS的序列測定。第十三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日（二）用5-cDNA末端快速擴增技術鑒定TSS常用的技術包括5-末端基因表達系列分析（5-endserialanalysisofgeneexpression，5-SAGE）和帽分析基因表達（capanalysisgeneexpression，CAGE）技術。第十四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日（三）用數(shù)據(jù)庫搜索TSS利用對寡核苷酸帽法構建的全長cDNA文庫5-末端測序所得的數(shù)據(jù)信息建立了一個TSS數(shù)據(jù)庫（databaseoftranscriptionstartsites，DBTSS），并在此基礎上，通過將寡核苷酸帽法和大量平行測序技術相結合開發(fā)了一種TSS測序法，從而實現(xiàn)了一次測試可產生1×107個TSS的數(shù)據(jù)。第十五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日三、基因啟動子結構分析技術（一）用PCR結合測序技術分析啟動子結構該方法最為簡單和直接，即根據(jù)基因的啟動子序列，設計一對引物，然后以PCR法擴增啟動子，經測序分析啟動子序列結構。第十六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日（二）用核酸-蛋白質相互作用技術分析啟動子結構1.用足跡法分析啟動子中潛在的調節(jié)蛋白結合位點足跡法（footprinting）是利用DNA電泳條帶連續(xù)性中斷的圖譜特點判斷與蛋白質結合的DNA區(qū)域，它是研究核酸-蛋白質相互作用的方法，而不是專門用于研究啟動子結構的方法。分類：酶足跡法化學足跡法第十七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日（1）用核酸酶進行足跡分析酶足跡法（enzymaticfootprinting）是利用DNA酶處理DNA-蛋白質復合物，然后通過電泳分析蛋白質結合序列。常用的酶有DNA酶I（DNaseI）和核酸外切酶III。第十八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日（2）用化學試劑進行足跡分析化學足跡法（chemicalfootprinting）是利用能切斷DNA骨架的化學試劑處理DNA-蛋白質復合物，由于化學試劑無法接近結合了蛋白質的DNA區(qū)域，因此在電泳上形成空白區(qū)域的位置就是DNA結合蛋白的結合位點。最常用的化學足跡法是羥自由基足跡法（hydroxylradicalfootprinting）。第十九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日2.用電泳遷移率變動分析和染色質免疫沉淀技術鑒定啟動子電泳遷移率變動分析（EMSA）和染色質免疫沉淀（ChIP）只能確定DNA序列中含有核蛋白結合位點，故尚需結合DNA足跡實驗和DNA測序等技術來確定具體結合序列。第二十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日（三）用生物信息學預測啟動子1.用啟動子數(shù)據(jù)庫和啟動子預測算法定義啟動子在定義啟動子或預測分析啟動子結構時應包括啟動子區(qū)域的3個部分①核心啟動子（corepromoter）；②近端啟動子（proximalpromoter）：含有幾個調控元件的區(qū)域，其范圍一般涉及TSS上游幾百個堿基；③遠端啟動子（distalpromoter）：范圍涉及TSS上游幾千個堿基，含有增強子和沉默子等元件。第二十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日2.預測啟動子的其他結構特征啟動子區(qū)域的其他結構特征包括GC含量、CpG比率、轉錄因子結合位點、堿基組成及核心啟動子元件等。用于啟動子預測的數(shù)據(jù)庫：EPD（eukaryoticpromoterdatabases）數(shù)據(jù)庫，主要預測真核RNA聚合酶Ⅱ型啟動子，數(shù)據(jù)庫中的所有啟動子數(shù)據(jù)信息都經過實驗證實；TRRD（transcriptionregulatoryregiondatabases）是一個轉錄調控區(qū)數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)來源于已發(fā)表的科學論文。第二十二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日四、基因編碼序列分析技術（一）用cDNA文庫法分析基因編碼序列cDNA克隆測序或構建cDNA文庫是最早分析基因編碼序列的方法。全長cDNA文庫可以通過mRNA的結構特征進行判斷，mRNA的序列基本都由3部分組成，即5-UTR、編碼序列和3-UTR。

cDNA末端快速擴增（RACE）技術是高效釣取未知基因編碼序列的一種方法。核酸雜交法可從cDNA文庫中獲得特定基因編碼序列的cDNA克隆。第二十三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日（二）用RNA剪接分析法確定基因編碼序列高通量分析RNA剪接的方法：①基于DNA芯片的分析法②交聯(lián)免疫沉淀法③體外報告基因測定法選擇性剪接的轉錄產物可以通過基因表達序列標簽（expressionsequencetag,EST）的比較進行鑒定，但這種方法需進行大量的EST序列測定；同時由于大多數(shù)EST文庫來源于非常有限的組織，故組織特異性剪接變異體也很可能丟失。第二十四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日（三）用數(shù)據(jù)庫分析基因編碼序列在基因數(shù)據(jù)庫中，對各種方法所獲得的cDNA片段的序列進行同源性比對，通過染色體定位分析、內含子∕外顯子分析、ORF分析及表達譜分析等，可以初步明確基因的編碼序列，并可對其編碼產物的基本性質進行分析。利用有限的序列信息即可通過同源性搜索獲得全長基因序列，然后，利用NCBI的ORFFinder軟件或EMBOSS中的getorf軟件進行ORF分析，并根據(jù)編碼序列和非編碼序列的結構特點，便可確定基因的編碼序列。第二十五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日五、基因拷貝數(shù)分析技術分析某種基因的種類及拷貝數(shù)，實質上就是對基因進行定性和定量分析，常用的技術包括DNA印跡（Southern印跡）、實時定量PCR技術等。

DNA印跡是根據(jù)探針信號出現(xiàn)的位置和次數(shù)判斷基因的拷貝數(shù)實時定量PCR是通過被擴增基因在數(shù)量上的差異推測模板基因拷貝數(shù)的異同DNA測序是最精確的鑒定基因拷貝數(shù)的方法第二十六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)基因表達產物分析技術第二十七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日一、通過檢測RNA而在轉錄水平分析基因表達根據(jù)分析方法的原理和功能特性，可將基因轉錄水平分析分為封閉和開放性系統(tǒng)研究方法。封閉性系統(tǒng)研究方法（如DNA芯片、RNA印跡、實時RT-PCR等）的應用范圍僅限于已知基因。開放性系統(tǒng)研究方法（如差異顯示PCR、雙向基因表達指紋圖譜、分子索引法、隨機引物PCR指紋分析等）可用于發(fā)現(xiàn)和分析未知基因。第二十八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日（一）用核酸雜交法檢測RNA表達水平1.用RNA印跡分析RNA表達RNA印跡被廣泛應用于RNA表達分析，并作為鑒定RNA轉錄本、分析其大小的標準方法。2.用核糖核酸酶保護實驗分析RNA水平及其剪接情況RNA酶保護實驗（ribonucleaseprotectionassay，RPA）是一種基于雜交原理分析RNA的方法，既可進行定量分析，又可研究其結構特征。第二十九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日第三十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日3.用原位雜交進行RNA區(qū)域定位原位雜交（ISH）是通過設計與目標RNA堿基序列互補的寡核苷酸探針，利用雜交原理在組織原位檢測RNA的技術，其可對細胞或組織中原位表達的RNA進行區(qū)域定位，同時也可作為定量分析的補充。第三十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日（二）用PCR技術檢測RNA表達水平1.用逆轉錄PCR進行RNA的半定量分析逆轉錄PCR（RT-PCR）一般用于RNA的定性分析；如果設置陽性參照，則可對待測RNA樣品進行半定量分析。2.用實時定量PCR進行RNA的定量分析實時定量PCR是定量分析RNA的最通用、最快速、最簡便的方法，該方法是對PCR反應進行實時監(jiān)測，具有很高的靈敏度和特異性。第三十二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日（三）用基因芯片和高通量測序技術分析RNA表達水平1.基因芯片已成為基因表達譜分析的常用方法基因芯片主要采用cDNA芯片，其便于對不同狀態(tài)下的基因表達譜進行比較，揭示轉錄組差異表達的規(guī)律，對探索發(fā)病機制、評價治療效果、篩選藥物靶標具有重要意義。2.用循環(huán)芯片測序技術分析基因表達譜運用循環(huán)芯片測序技術，可對基因表達譜進行高通量分析，一次可完成幾十萬到幾百萬個DNA分子片段的序列測定，從而快速獲得轉錄組或基因組的全貌。第三十三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日二、通過檢測蛋白質/多肽而在翻譯水平分析基因表達（一）用蛋白質印跡技術檢測蛋白質/多肽（二）用酶聯(lián)免疫吸附實驗分析蛋白質/多肽酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）也是一種建立在抗原-抗體反應基礎上的蛋白質/多肽分析方法，其主要用于測定可溶性抗原或抗體，第三十四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日（三）用免疫組化實驗原位檢測組織/細胞表達的蛋白質/多肽免疫組化實驗包括免疫組織化學和免疫細胞化學實驗，二者原理相同，都是用標記的抗體在組織/細胞原位對目標抗原（目標蛋白質/多肽）進行定性、定量、定位檢測。（四）用流式細胞術分析表達特異蛋白質的陽性細胞流式細胞術（flowcytometry）通常利用熒光標記抗體與抗原的特異性結合，經流式細胞儀分析熒光信號，根據(jù)細胞表達特定蛋白質的水平對某種蛋白質陽性細胞做出判斷。第三十五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日（五）用蛋白質芯片和雙向電泳高通量分析蛋白質/多肽表達水平1.用蛋白質芯片分析蛋白質/多肽的表達譜根據(jù)制作方法和用途不同，可將其分為蛋白質檢測和功能芯片兩大類。蛋白質檢測芯片包括抗體芯片、抗原芯片、配體芯片等，它是將具有高親和力的特異性探針分子固定在基片上，用以識別生物樣品溶液中的目標多肽；蛋白質功能芯片可用來研究蛋白質修飾、蛋白質-蛋白質∕蛋白質-DNA∕蛋白質-RNA，以及蛋白質與脂質、蛋白質與藥物、酶與底物、蛋白質-小分子等的相互作用。第三十六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日蛋白質芯片可用于檢測組織∕細胞來源的樣品中蛋白質的表達譜；其精確程度、信息范疇取決于芯片上已知多肽的信息多寡。2.用雙向電泳分析蛋白質/多肽表達譜雙向電泳可同時分離成百上千的蛋白質，對差異表達的蛋白質進行鑒定。第三十七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日第三節(jié)基因的生物學功能鑒定技術第三十八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日一、用功能獲得策略鑒定基因功能基因功能獲得策略的本質是將目的基因直接導入某一細胞或個體中，使其獲得新的或更高水平的表達，通過細胞或個體生物性狀的變化來研究基因功能。方法：轉基因技術基因敲入技術第三十九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日（一）用轉基因技術獲得基因功能轉基因技術（transgenictechnology）是指將外源基因導入受精卵或胚胎干細胞（embryonicstemcell），即ES細胞，通過隨機重組使外源基因插入細胞染色體DNA，隨后將受精卵或ES細胞植入假孕受體動物的子宮，使得外源基因能夠隨細胞分裂遺傳給后代。轉基因動物（transgenicanimal）是指應用轉基因技術培育出的攜帶外源基因，并能穩(wěn)定遺傳的動物，其制備步驟主要包括轉基因表達載體的構建、外源基因的導入和鑒定、轉基因動物的獲得和鑒定、轉基因動物品系的繁育等。轉基因小鼠最為常見。

第四十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日第四十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日（二）用基因敲入技術獲得基因的功能基因敲入（geneknock-in）是通過同源重組的方法，用某一基因替換另一基因，或將一個設計好的基因片段插入到基因組的特定位點，使之表達并發(fā)揮作用。通過基因敲入可以研究特定基因在體內的功能；也可以與之前的基因的功能進行比較；或將正?；蛞牖蚪M中置換突變基因以達到靶向基因治療的目的。第四十二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日基因敲入是基因打靶（genetargeting）技術的一種?；虼虬惺且环N按預期方式準確改造生物遺傳信息的實驗手段。除基因敲入外，基因打靶還包括基因敲除、點突變、缺失突變、染色體大片段刪除等?；虼虬信c轉基因技術均可用于基因功能研究，但二者的最大區(qū)別就是基因打靶能去除和/或替換