志賀氏菌檢驗演示文稿

志賀氏菌檢驗演示文稿當前1頁，總共43頁。志賀氏菌檢驗當前2頁，總共43頁。一、流行病學簡介一種古老的腸道傳染性腹瀉。19世紀曾出現(xiàn)全世界菌痢的大流行。1899年，日本人志賀氏首先發(fā)現(xiàn)菌痢是由痢疾桿菌引起。第一次世界大戰(zhàn)期間（1914-1918年），德國死于痢疾者約4萬余人，并進一步證實痢疾桿菌是菌痢流行的病原。當前3頁，總共43頁。細菌性痢疾歷年來一直是我國夏秋季發(fā)病率最高的腸道傳染病。近年來報道非洲及中美洲流行的痢疾志賀菌病死率達5%-15%。我國屬發(fā)展中國家，人民的生活條件雖然在不斷改善，但由于部分地區(qū)衛(wèi)生知識普及不夠，食品衛(wèi)生管理、監(jiān)督不力，使得志賀菌的感染在我國傳染病中多年來一直處于較高的地位。當前4頁，總共43頁。每年均有志賀菌感染暴發(fā)的報告，每次暴發(fā)的發(fā)病人數(shù)在數(shù)十人到上千人不等。多數(shù)由于食物和飲水污染引起。1994年5月11日，江蘇省無錫市發(fā)生一起26所小學的學生因課間餐食用豆奶導致1345人食物中毒的事故，后經(jīng)調(diào)查是一起志賀菌和致病性大腸桿菌混合感染引起的食物中毒，此次爆發(fā)波及范圍之大，發(fā)病人數(shù)之多，在我國歷史上頗為少見。當前5頁，總共43頁。志賀菌致病力強，少量細菌進入人體即可引起發(fā)病。是否發(fā)病，取決于細菌數(shù)量、致病力（粘附、侵襲力、毒素）和人體的抵抗力。各種志賀菌都可以產(chǎn)生強烈的內(nèi)毒素，是引起全身毒血癥的主要因素。志賀菌還可產(chǎn)生外毒素（志賀毒素），具有神經(jīng)毒、細胞毒和腸毒性作用，能引起更嚴重的臨床表現(xiàn)如溶血性尿毒綜合癥等。當前6頁，總共43頁。二、生物學特性（一）、形態(tài)與染色革蘭氏陰性短桿菌、無莢膜，無芽胞，無鞭毛

2~3um*0.5~0.7um

當前7頁，總共43頁。（二）、培養(yǎng)特性1、需氧或兼氧性厭氧，最適溫度37℃，PH7.2~7.42、在普通瓊脂和SS平板上，能形成圓形、微凸、光滑濕潤、無色半透明、邊緣整齊、在中等大小的菌落3、宋氏志賀氏菌菌落較大，較不透明，粗糙而扁平，在SS平板上可遲發(fā)酵乳糖，菌落呈玫瑰紅色。4、在肉湯中呈均勻混濁生長，無菌膜。

當前8頁，總共43頁。（三）、生化反應1、發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，除宋氏志賀氏菌外，均不發(fā)酵乳糖。2、不發(fā)酵側(cè)金盞花醇、肌醇、水楊苷。3、不產(chǎn)生H2S，不分解尿素，V-P試驗陰性，不能利用檸檬酸鹽。4、甲基紅陽性。當前9頁，總共43頁。（四）、抗原結(jié)構(gòu)1、抗原構(gòu)成：O抗原：群特異性抗原：A、B、C、DK抗原：除B群外，一般有K抗原當前10頁，總共43頁。2、志賀氏菌的分群與血清型志賀氏菌分為四群：A群（痢疾志賀氏菌）：1~10型B群（福氏志賀氏菌）：1~6型+X、Y兩個變種，C群（鮑氏志賀氏菌）：1~15型D群（宋內(nèi)氏志賀氏菌）

：1個型當前11頁，總共43頁。三、志賀氏菌檢驗

GB4789.5-20121.以原國標為基礎(chǔ)，保持與原標準的連續(xù)性

考慮基層單位方法的可操作性，對增菌步驟、培養(yǎng)條件盡可能簡化；生化反應方面亦盡量沿用原標準中的方法2.與國際接軌的原則

該標準的起草內(nèi)容主要參考了國際標準組織ISO標準，部分參考采用了美國FDA、NMKL等標準當前12頁，總共43頁。3.與現(xiàn)有已頒布的新版國家標準協(xié)調(diào)統(tǒng)一

參考了已頒布的2008版國標，在樣品的前處理步驟，培養(yǎng)條件的選擇，文字描述等方面盡量保持一致。

當前13頁，總共43頁。GB/T4789.5-2003

標準不足處1.采用GN增菌肉湯,37℃需氧培養(yǎng),4小時后大腸菌的生長速度大大超過志賀氏菌,檢測效果較差2.使用的分離平板SS對志賀1型有抑制3.檢驗方法與現(xiàn)行的其它國家的標準存在差異當前14頁，總共43頁。增菌：用GN增菌液使處于瀕死狀態(tài)的細菌恢復活力選擇性平板分離培養(yǎng)：XLD+MAC/顯色培養(yǎng)基生化試驗：可采用API20E或VITEK2血清學鑒定：特異性診斷血清鑒定到種。

志賀氏菌操作流程當前15頁，總共43頁。修改的內(nèi)容

增菌部分志賀氏菌增菌液（新生霉素0.5μg/mL）原國標：GNISO：志賀氏菌增菌液（新生霉素0.5μg/mL）FDA：志賀氏菌增菌液（新生霉素0.5μg/mL和3μg/mL）NMKL：志賀氏菌增菌液（新生霉素0.5μg/mL）當前16頁，總共43頁。培養(yǎng)條件：41.5℃±1℃厭氧培養(yǎng)原國標：37℃需氧培養(yǎng)ISO：41.5℃厭氧培養(yǎng)FDA：42℃（除宋內(nèi)其他志賀菌)和44℃（宋內(nèi)）厭氧培養(yǎng)NMKL：42℃厭氧培養(yǎng)當前17頁，總共43頁。

分離用平板原國標：HE或SS;MAC或EMBISO：MAC、XLD、HEFDA：MACNMKL：MAC、XLD、HE當前18頁，總共43頁。（一）增菌培養(yǎng)用志賀氏菌增菌液增菌,41.5℃±１℃，16h～20h厭氧培養(yǎng)。當前19頁，總共43頁。智能厭氧微需氧培養(yǎng)系統(tǒng)當前20頁，總共43頁。（二）分離培養(yǎng)取增菌后的GN增菌液或志賀氏增菌肉湯分別劃線接種于XLD瓊脂平板和MAC瓊脂平板或R&F志賀氏菌顯色培養(yǎng)基平板上于36℃1℃培養(yǎng)20h～24h，觀察各個平板上生長的菌落形態(tài)若出現(xiàn)的菌落不典型或菌落較小不易觀察，則繼續(xù)培養(yǎng)至48h再進行觀察。當前21頁，總共43頁。菌落特征

MAC瓊脂：無色至淺粉紅色，半透明、光滑、濕潤、圓形、邊緣整齊或不齊，直徑2～3mmXLD瓊脂：粉紅色至無色，半透明、光滑、濕潤、圓形、邊緣整齊或不齊，直徑1～2mm當前22頁，總共43頁。R&F志賀氏菌顯色瓊脂：白色，不透明、圓形、邊緣不整齊，直徑1mm～3mm，菌落周圍瓊脂顏色變?yōu)樽霞t色當前23頁，總共43頁。志顯1宋內(nèi)氏典型菌落XLD當前24頁，總共43頁。2福氏典型菌落志顯XLD當前25頁，總共43頁。XLD3

鮑氏典型菌落志顯當前26頁，總共43頁。XLD4痢疾典型菌落志顯當前27頁，總共43頁。5熟肉制品中宋內(nèi)的分離效果R&F志顯XLD當前28頁，總共43頁。志顯6蔬菜制品中宋內(nèi)分離效果XLD當前29頁，總共43頁。志顯7鮑氏在生肉中的分離效果XLD當前30頁，總共43頁。8熟肉制品中福氏的分離效果志顯當前31頁，總共43頁。（四）初步生化選取平板上5個或5個以上可疑菌落接種TSI、葡萄糖半固體、營養(yǎng)瓊脂斜面，36℃1℃培養(yǎng)20h～24h，觀察結(jié)果。培養(yǎng)物中出現(xiàn)以下情況可以棄去a.在三糖鐵瓊脂斜面上蔓延生長b.發(fā)酵乳糖或蔗糖c.不分解葡萄糖和只生長在半固體表面的d.產(chǎn)氣的e.產(chǎn)生硫化氫f.有動力的培養(yǎng)物當前32頁，總共43頁。初步生化:三糖鐵（TSI）現(xiàn)象說明底層黃色葡萄糖陽性紅色或不變色葡萄糖陰性黑色產(chǎn)H2S氣泡產(chǎn)氣斜面黃色乳糖和（或）蔗糖陽性紅色或不變色乳糖和（或）蔗糖陰性志賀氏菌都能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，大多不發(fā)酵乳糖，不產(chǎn)生H2S。如圖中2號管的反應.當前33頁，總共43頁。生化反應A群：痢疾志賀氏菌B群：福氏志賀氏菌C群：鮑氏志賀氏菌D群：宋內(nèi)氏志賀氏菌?-半乳糖苷酶－c－－c＋尿素－－－－賴氨酸脫羧酶－－－－鳥氨酸脫羧酶－－－a＋水楊苷－－－－七葉苷－－－－靛基質(zhì)－/＋(＋)－/＋－甘露醇－＋b＋＋棉子糖－＋－＋甘油(＋)－(＋)d注：+陽性；-陰性；-/+多數(shù)陰性；+/-多數(shù)陽性；（+）遲緩陽性；d有不同生化型。a鮑氏13型為鳥氨酸陽性。b福氏4型和6型常見甘露醇陰性變種。c痢疾志賀1型和鮑氏13型為陽性。志賀氏菌屬四個群的生化特征當前34頁，總共43頁。附加生化實驗

由于某些不活潑的大腸埃希氏菌（anaerogenicE.coli）、A-D（Alkalescens-Disparbiotypes堿性-異型）菌的部分生化特征與志賀氏菌相似，并能與某種志賀氏菌分型血清發(fā)生凝集；因此前面生化實驗符合志賀氏菌屬生化特性的培養(yǎng)物還需另加葡萄糖胺、西蒙氏檸檬酸鹽、粘液酸鹽試驗(36℃培養(yǎng)24h～48h)。志賀氏菌屬和不活潑大腸埃希氏菌、A-D菌的生化特性區(qū)別見表3當前35頁，總共43頁。（五）生化鑒定增加了API20E診斷試劑條和全自動細菌生化鑒定儀VITEK；當前36頁，總共43頁。當前37頁，總共43頁。當前38頁，總共43頁。（六）血清學鑒定1.抗原的準備

志賀氏菌屬沒有動力，所以沒有鞭毛抗原。抗原構(gòu)造與分型：志賀氏菌屬細菌的抗原結(jié)構(gòu)由菌體抗原（O）及表面抗原（K）組成。O抗原為糖脂蛋白復合物，可分為型特異性抗原和群特異性抗原。志賀氏菌分為4個群，48個血清型（包括亞型及變種）。K抗原在志賀菌屬分類上無意義。當前39頁，總共43頁。菌體（0）抗原1.型特異性抗原：化學組成為多糖，是光滑型菌株所含有的重要抗原。當菌株變?yōu)榇植谛蜁r，此抗原也常隨之消失，根據(jù)所含的型抗原不同，可將志賀菌屬分為A、B、C、D四個群及39個抗原型。2.群特異性抗原：為光滑型菌株的次要抗原，也是菌體抗原的一種。特異性較低，主要存在于B群。根據(jù)所含的群抗原不同，可將一些菌型分為多種亞型。當前40頁，總共43頁。表面抗原（K抗原）在新分離的某些菌株菌體表面含有此種抗原。不耐熱，加熱100℃1小時即被破壞。具有此種抗原的菌株，可阻止菌體抗原與相應免疫血清發(fā)生凝集。2.凝集反應當前41頁，總共43頁。3.血清學分型（選做項目）

先用四種志賀氏菌多價血清檢查，如果呈現(xiàn)凝集，則再用相應各群多價血清分別試驗。先用B群福氏志賀氏菌多價血清進行實驗，如呈現(xiàn)凝集，再用其群和型因子血清分別檢查，福氏志賀氏菌各型和亞型的型抗原和群抗原鑒別見表4。如果B群多價血清不凝集，則用D群宋內(nèi)氏志賀氏菌血清進行實驗，如呈現(xiàn)凝集，則用其Ⅰ相和Ⅱ相血清檢查；如果B