分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用 二代測(cè)序技術(shù) 分子生物學(xué)

二代測(cè)序技術(shù)主講人:XXX二代測(cè)序技術(shù)——發(fā)展歷程第二代測(cè)序使用最為廣泛。以Roche公司的454技術(shù)，Illumina公司的Solexa，HiSeq技術(shù)為代表二代測(cè)序技術(shù)01基本介紹02二代測(cè)序技術(shù)的方法03二代測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用基本介紹01——捕捉新合成的末端標(biāo)記來確定DNA序列第二代測(cè)序技術(shù)邊合成邊測(cè)序或變鏈接邊測(cè)序。核心思想高通量、自動(dòng)化。特點(diǎn)第二代測(cè)序技術(shù)（大規(guī)模平行測(cè)序）一代與二代測(cè)序技術(shù)的區(qū)別對(duì)模板體外克隆→單獨(dú)反應(yīng)模板DNA打斷成小片段→文庫(kù)擴(kuò)增→測(cè)序。第一代測(cè)序技術(shù)第二代測(cè)序儀技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)01保證高準(zhǔn)確性02降低測(cè)序成本03提高測(cè)序速度二代測(cè)序技術(shù)的方法02焦磷酸測(cè)序：是一種由DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶催化的新型酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光測(cè)序技術(shù)，通過對(duì)DNA合成反應(yīng)中釋放的生物光信號(hào)完成實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，開創(chuàng)邊合成邊測(cè)序先河。焦磷酸測(cè)序原理每輪測(cè)序反應(yīng)體系——一種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)配對(duì)測(cè)序引物的3′末端焦磷酸(PPi)釋放ATP5'-磷酰硫酸（APS）ppi形成熒光素氧化熒光素DNA聚合酶摻入的dNTP＝釋放的PpiATP硫酸化酶催化熒光素酶催化可見光CCD感應(yīng)器——光信號(hào)→檢測(cè)峰每個(gè)峰的高度（光信號(hào)）與摻入的核苷酸數(shù)目呈正比Apyrase反應(yīng)體系光信號(hào)核苷酸ATP原理淬滅降解再生454/Roche測(cè)序系統(tǒng)原理基于焦磷酸測(cè)序法，依靠生物發(fā)光對(duì)DNA序列進(jìn)行檢測(cè)。正確熒光標(biāo)記的引物、核酸探針、電泳錯(cuò)誤快速、準(zhǔn)確、高靈敏度、高自動(dòng)化不匹配IonTorrent/LifeTechnologies測(cè)序系統(tǒng)DNA分子DNA分子核苷酸DNA分子PH值變化→結(jié)合→釋放HH→PH值改變→數(shù)字信號(hào)＝兩個(gè)相同的堿基芯片記錄兩個(gè)相同的堿基檢測(cè)雙倍電壓檢測(cè)不到電壓不會(huì)記錄堿基4.Solexa/Illumina測(cè)序系統(tǒng)測(cè)序系統(tǒng)同時(shí)完成傳統(tǒng)基因組學(xué)研究和功能基因組學(xué)研究。測(cè)序儀一次讀取1,000個(gè)左右堿基，DNA樣品制備和分析時(shí)間長(zhǎng)。測(cè)序系統(tǒng)高準(zhǔn)確性、高通量