木犀草素對糞腸球菌毒力因子作用機(jī)制的研究

木犀草素對糞腸球菌毒力因子作用機(jī)制的研究牙髓病和根尖周病常由細(xì)菌感染引發(fā)，當(dāng)前臨床上常采取根管治療術(shù)對其進(jìn)行治療。我們國家根管治療的技術(shù)固然已經(jīng)很成熟了，但臨床上結(jié)合各種因素仍存在一定的失敗率。近年來許多學(xué)者以為根管內(nèi)微生物的感染是造成根管治療失敗的重要原因[1—2]。有報道表示清楚，在根管治療失敗的病例中，糞腸球菌的檢出率較高，說明糞腸球菌是較常見的細(xì)菌[3]。糞腸球菌經(jīng)常繼發(fā)于根管內(nèi)而感染，是重要致病菌，它的生存能力極強(qiáng)。糞腸球菌的生存力較頑固，其生物被膜的存活力和致病性愈加頑強(qiáng)，傳統(tǒng)的根管治療術(shù)對構(gòu)成生物被膜的根管的治愈率不高。因而對于微生物的感染造成治療失敗的研究受到廣闊研究者的關(guān)注。加之如今臨床上使用的消毒藥物對感染糞腸球菌的根管的消毒效果欠安，以至有些消毒藥物還具有一定的毒副作用，導(dǎo)致糞腸球菌產(chǎn)生耐藥性，所以越來越多的研究者轉(zhuǎn)向來研究毒副作用小而且不容易構(gòu)成抗藥性的中藥。本研究的意義在于更進(jìn)一步的了解木犀草素對生物被膜狀態(tài)下的糞腸球菌的抑制效果并討論其對糞腸球菌毒力因子gelE、esp、ebpA的影響的機(jī)制。1材料與方法1.1重要材料和儀器糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC(廣東環(huán)凱生物科技〕，木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品〔上海金穗生物科技，產(chǎn)品批號20150301，HPLC98%)，腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸液肉湯〔杭州天和微生物試劑〕，噻唑蘭、MTT(上海金穗生物科技〕，二甲基亞砜(天津致遠(yuǎn)化工〕，引物〔上海生工生物工程〕，BiometraPCR儀〔BIOME-TRA，德國〕，SMARTSPECTMPLUS超微量分光光度計(jì)(美國〕，瓊脂糖〔西班牙〕，PBS緩沖液〔博士德生物〕。1.2方法1.21菌懸液的制備首先取糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)株接種于裝有BHI液體培養(yǎng)基的試管中37°C搖床厭氧復(fù)蘇24h。將復(fù)蘇后的糞腸球菌劃線接種于BHI瓊脂培養(yǎng)基中，放置在37C恒溫培養(yǎng)箱里厭氧培養(yǎng)24h。挑取24h后固體培養(yǎng)基上的單個菌落放置于裝有BHI液體培養(yǎng)基的試管中，37C搖床里培養(yǎng)24h;最后利用麥?zhǔn)媳葷岱ㄅ渲凭鷳乙翰⑹蛊錆舛鹊竭_(dá)0.5McFarland(1X108個細(xì)胞/mL)。1.22藥液的制備取木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品用二甲基亞砜溶解使其濃度到達(dá)16mg/mL，過濾后，利用對倍稀釋法將木犀草素稀釋成8、4、2、1和0.5mg/mL的濃度，備用。1.23木犀草素對糞腸球菌生物被膜的抑菌性的研究用滅菌后96孔板，向每孔中放50pL的糞腸球菌菌懸液和150pL的BHI液體培養(yǎng)基，封口膜密封，37C條件下厭氧培養(yǎng)24h(激光共聚焦〕觀察，待成功建立糞腸球菌生物被膜模型，嚴(yán)格貼壁去除原液體，同時隨機(jī)分7組包含5個實(shí)驗(yàn)組、1個陰性對照組、1個空白對照組；分別向?qū)嶒?yàn)組中參加100PL的濃度為8、4、2、1和0.5mg/mL的木犀草素藥液，陰性對照組含有液體培養(yǎng)基和菌懸液，空白對照組只含有BHI液體培養(yǎng)基；將96孔板放于培養(yǎng)箱中37C條件下厭氧培養(yǎng)12h。12h后無菌PBS沖刷2?3次去除藥液。每孔中參加20PLMTT藥液〔濃度為5mg/mL)，37C避光培養(yǎng)4h。每孔放100PL的二甲基亞砜溶液，搖床震動15min；待結(jié)晶體消失后，全自動酶標(biāo)儀分別檢測490nm的吸光度〔A值〕。如下公式計(jì)算：抑菌率=(陰性對照組A值一實(shí)驗(yàn)組A值〕/(陰性對照組A值一空白對照組A值〕X100%。1.24CLSM觀察不同濃度木犀草素對糞腸球菌生物被膜的影響將經(jīng)高壓滅菌后的20mmX20mm的蓋玻片放在6孔板中，分別在蓋玻片外表滴加300PL的糞腸球菌菌懸液，再沿6孔板的側(cè)壁向其中小心參加3mL的BHI液體培養(yǎng)基，封口膜封口，37C恒溫培養(yǎng)箱厭氧條件下培養(yǎng)24h。經(jīng)共聚焦檢測確定生物被膜模型建立成功后，去除原培養(yǎng)液同時將其隨機(jī)分為6組〔5個實(shí)驗(yàn)組和1個陰性對照組〕，分別向5個實(shí)驗(yàn)組中參加濃度為8、4、5、1、0.5mg/mL的木犀草素藥液，陰性對照組中不加藥液，封口膜封口，繼續(xù)厭氧培養(yǎng)12h。12h后去除液體。PBS小心沖刷2?3次去除外表浮游的細(xì)菌；然后滴加2.5%的戊二醛固定10min，再次用PBS緩沖液小心沖刷2?3次后，分別在生物被膜外表滴加150pL染色劑〔AO、EB等份混合后0=20稀釋成工作液〕，暗室室溫孵育15min后，用CLSM觀察生物被膜中死菌與活菌的密度及其比例(鏡下活菌呈綠色，死菌呈紅色〕。1.25木犀草素對糞腸球菌的毒力因子影響的研究0.25.1分組處理和PCR擴(kuò)增選取適應(yīng)濃度的木犀草素〔8、4、2和0mg/mL)，分別參加到配制好的糞腸球菌菌懸液中。置于37C厭氧條件下培養(yǎng)24h后，分別取1mL樣本按TotalRNA提取試劑盒(RNAISOTMPlus)要求提取其總RNA；并用RNAPCRKIT(AMV)VER30試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。同時用由上海生工生物合成設(shè)計(jì)的3對引物〔見表1)，按PCR反應(yīng)試劑盒說明，通過PCR儀，對糞腸球菌毒力因子gelE、ebpA、esp進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)品，置一20C冷凍冰箱，備用。0.25.2瓊脂糖凝膠電泳及其分析取0.6g的瓊脂糖粉末與40mL1XTAE電泳緩沖液混合,加熱至全部溶解后,再向其中參加0.4PL的EB,混合后，沿側(cè)壁緩慢使液體流入膠板中，冷卻制成凝膠。將樣本〔8pLPCR擴(kuò)增產(chǎn)品+2pL的6XLoadingbuffer混合液)滴參加凝膠小孔中，于120V,30min條件下進(jìn)行電泳。電泳30min后，取下凝膠置于UVI成像儀上。觀察結(jié)果并進(jìn)行拍照，最后利用軟件進(jìn)行分析。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均采取SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料采取均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(王±0表示。兩組間計(jì)量資料的比較采取z檢驗(yàn)。P0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果21不同濃度木犀草素對糞腸球菌生物被膜的抑制率不同濃度的木犀草素作用于糞腸球菌生物被膜24h后，運(yùn)用MTT法測各組的A值并計(jì)算木犀草素的抑囷率；最后的結(jié)果顯示：在0.5?8mg/mL的濃度區(qū)間隨著藥物濃度的增長其抑菌能力也加強(qiáng)。木犀草素的濃度為0.5mg/mL時其抑菌率為40.02%。當(dāng)?shù)竭_(dá)8mg/mL時抑菌率為90.55%。而且各組的抑菌率分別與陰性對照組相比差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P〈0.05)(見表2)。表2不同濃度木犀草素對糞腸球菌生物被膜的抑制率隨著藥物濃度依次增長各條帶的亮度逐步變暗?！?)當(dāng)藥物濃度到達(dá)8mg/mL時各毒力因子的條帶基本消失?！?)各組別與陰性對照組兩兩比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P〈0.05)，見表3。說明木犀草素不同水平的抑制了糞腸球菌毒力因子gelE、esp、ebpA的表達(dá)；而且隨著藥物濃度的增長其抑制效果逐步增長。22木犀草素對糞腸球菌生物被膜的影響不同濃度的木犀草素作用于糞腸球菌生物被膜，通過AO和EB染色后，CLSM鏡下觀察活菌和死菌的密度及其比例。在0.5?8mg/mL濃度區(qū)間內(nèi)CLSM觀察到死菌的數(shù)量逐步增長。說明木犀草素對糞腸球菌生物被膜的生長活性有抑制造用〔見圖1)。23不同濃度的木犀草素對糞腸球菌的毒力因子gelE、esp、ebpA基因表達(dá)水平的影響最后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)品進(jìn)行電泳后的結(jié)果顯示：〔1)陰性對照組時毒力因子gelE、esp、ebpA的電泳條帶最亮，藥物濃度為2mg/mL時其條帶的亮度次之，但3討論木犀草素是中藥夏枯草(LuteoUn)的重要有效成分之一。木犀草素屬于黃酮類化合物，具有抗菌、抗炎、保衛(wèi)心血管、解痙、祛痰、抑制酶活性、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗輻射、利尿、利膽、抗腫瘤等等多種特性[4]。有研究報道夏枯草對腸道致病菌和條件致病菌具有較強(qiáng)的抑制造用，但對于木犀草素對糞腸球菌的作用尚沒有研究，故本實(shí)驗(yàn)選取夏枯草中的木犀草素成分作為研究對象，討論其對糞腸球菌的作用。實(shí)驗(yàn)最后的結(jié)果顯示：在05?8mg/mL，木犀草素對糞腸球菌生物被膜能起到抑制效果，而且隨著藥物濃度的逐步增長其抑菌效果也逐步明顯，當(dāng)濃度達(dá)8mg/mL時，其抑菌效果最明顯。3.討論糞腸球菌在根管再治療患者的根管中檢出率高且數(shù)量多，極易構(gòu)成生物被膜，產(chǎn)生抗藥性，使治療難度加大[6]。有研究報道：糞腸球菌極易在根管內(nèi)構(gòu)成生物被膜可能與其毒力因子明膠酶〔gelE)、外表蛋白〔Esp)和菌毛把持子〔ebpA)等有關(guān)系。gelE：是細(xì)胞外鋅金屬蛋白酶的一種，能夠酶解宿主細(xì)胞壁和細(xì)胞間質(zhì)的膠原蛋白[7]，它的長度大略為1530個堿基，位于糞腸球菌染色體上。糞腸球菌調(diào)節(jié)因子基因fe?和3個啟動子位于其上游，能夠影響明膠酶的表達(dá)水平。下游重要與其一起參與宿主的組織損傷，是絲氨酸蛋白基因SprE。明膠酶對組織的構(gòu)成和重塑是通過胞外的降解作用來調(diào)節(jié)的。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)去除giE基因后，糞腸球菌構(gòu)成生物被膜的能力下降[8]。ebpA:ebp基因座重要影響菌毛構(gòu)成，而生物被膜構(gòu)成的需要條件就是菌毛的構(gòu)成。bpA是糞腸球菌菌毛把持子，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于糞腸球菌分離株中，影響著生物被膜和菌毛的構(gòu)成[]。有研究發(fā)現(xiàn)：與野生株比較，bpA表達(dá)水安然平靜菌毛蛋白生成量減少，生物被膜構(gòu)成量也會跟著下降[1°]。Esp：由1873個氨基酸構(gòu)成的與細(xì)胞壁相關(guān)的蛋白，在糞腸球菌中它的外表分子質(zhì)量最大，由5622個堿基對構(gòu)成e#基因。e#基因的菌株可誘發(fā)多重感染，esp基因普遍具有構(gòu)成生物被膜的能力，可使細(xì)菌的感染愈加持久，呈慢性長期的趨勢，因而提升了感染能力[11]為了說明木犀草素對糞腸球菌的抑菌作用能否通過其相關(guān)毒力因子而完成。本實(shí)驗(yàn)選擇與糞腸球菌生物被膜相關(guān)聯(lián)的3種毒力因子gelE、esp、ebpA為研究對象，觀察不同濃度作用后的變化。結(jié)果顯示:〔1)木犀草素的濃度在0.5?8mg/mL時，對糞腸球菌的3種毒力因子gelE、esp、ebpA的mRNA的表達(dá)均有不同水平的干擾或抑制造用。即隨著濃度的增長，其對3