課件生化14-dna的復(fù)制和修復(fù)

第十四章DNA的復(fù)制、修復(fù)和重組

本章重點介紹遺傳中心法則和DNA的半保留復(fù)制的過程和機理，對DNA的修復(fù)和重組作一般介紹。

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DNA是絕大多數(shù)生物體遺傳信息的載體，繼1953年Watson&Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型后，1958年，Crick提出了“中心法則”(Centraldogma)揭示了遺傳信息的傳遞規(guī)律。遺傳信息傳遞的中心法則

蛋白質(zhì)翻譯轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制DNARNA生物的遺傳信息以密碼的形式儲存在DNA分子上，表現(xiàn)為特定的核苷酸排列順序。在細胞分裂的過程中，通過DNA復(fù)制把親代細胞所含的遺傳信息忠實地傳遞給兩個子代細胞。在子代細胞的生長發(fā)育過程中，這些遺傳信息通過轉(zhuǎn)錄傳遞給RNA，再由RNA通過翻譯轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的蛋白質(zhì)多肽鏈上的氨基酸排列順序，由蛋白質(zhì)執(zhí)行各種各樣的生物學(xué)功能，使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳特征。后來人們又發(fā)現(xiàn)，在宿主細胞中一些RNA病毒能以自己的RNA為模板復(fù)制出新的病毒RNA，還有一些RNA病毒能以其RNA為模板合成DNA，稱為反轉(zhuǎn)錄，這是中心法則的補充。

中心法則總結(jié)了生物體內(nèi)遺傳信息的流動規(guī)律，揭示遺傳的分子基礎(chǔ)，不僅使人們對細胞的生長、發(fā)育、遺傳、變異等生命現(xiàn)象有了更深刻的認識，而且以這方面的理論和技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展了基因工程，給人類的生產(chǎn)和生活帶來了深刻的革命。目錄第一節(jié)DNA代謝的概念第二節(jié)DNA的復(fù)制第三節(jié)DNA的修復(fù)第四節(jié)體內(nèi)DNA的重組DNA代謝的概念

DNA的結(jié)構(gòu)是遺傳信息穩(wěn)定儲存的絕妙裝置，但是，“穩(wěn)定儲存”一詞僅僅是對在細胞中作用的靜態(tài)的不完全描述。關(guān)于DNA功能的正確描述應(yīng)該包括遺傳信息如何從一代細胞傳遞給下一代細胞，因此用DNA代謝一詞來來概括這個過程更為合適。這個過程包括DNA的復(fù)制以及可能影響遺傳信息構(gòu)成的DNA的修復(fù)和重組。通過遺傳圖譜可了解催化DNA代謝酶的基因在基因組中的相對位置。大腸桿菌染色體遺傳圖(Geneticmap)第二節(jié)DNA的復(fù)制

一、DNA復(fù)制的概念和一般規(guī)律二、DNA復(fù)制有關(guān)的酶類三、原核細胞DNA的復(fù)制過程四、DNA復(fù)制的忠實性五、真核細胞DNA的復(fù)制特點

DNA復(fù)制(replication)

DNA復(fù)制的一般規(guī)律需要摸板半保留固定的起點和方向半不連續(xù)需要RNA作為引物親代DNA分子親本鏈親本鏈復(fù)制鏈DNA的半保留復(fù)制實驗依據(jù)

1958年Meselson&stahl用同位素示蹤標記加密度梯度離心技術(shù)實驗,證明了DNA是采取半保留的方式進行復(fù)制.[15N]DNA[14N-15N]DNA[14N]DNA[14N-15N]DNA原始分子第一子代第二子代Cairns為DNA半保留復(fù)制提供的證據(jù)(1963年)

Cairns將3H-胸苷標記大腸桿菌DNA，經(jīng)過近兩代的時間，3H-胸苷摻入大腸桿菌DNA。用溶菌酶把細胞壁消化掉，使完整的大腸桿菌染色體DNA釋放出來，放射自顯影，得到上圖。非復(fù)制部分（C）銀粒子密度較低，由一股放射性鏈和一股非放射性鏈構(gòu)成。已復(fù)制部分站整個染色體的三分之二，其中一條雙鏈（B

）僅有一股鏈是標記的，另外一股雙鏈（A

）的兩股鏈都是標記的，銀粒子密度為前二者的兩倍。染色體全長約為1100微米。ABC復(fù)制中的大腸桿菌染色體放射自顯影圖環(huán)狀DNA的復(fù)制ABC雙向和單向復(fù)制環(huán)狀

DNA復(fù)制時所形成的結(jié)構(gòu)起始點復(fù)制叉的推進復(fù)制叉起始點起始點起始點復(fù)制叉復(fù)制叉未復(fù)制DNA單向復(fù)制雙向復(fù)制DNA復(fù)制的起點和方向DNA復(fù)制叉上的半不連續(xù)

滯后鏈5′3′3′5′3′5′前導(dǎo)鏈復(fù)制叉移動方向?qū)槠?′3′5′5′原核生物DNA復(fù)制有關(guān)的酶類

（1）DNA聚合酶(DNApolymetases)（2）引物酶(peimase)和引發(fā)體(primosome)

：啟動RNA引物合成。

(3）DNA連接酶（DNAligase）（4）DNA解鏈酶(DNAhelicase)(5）單鏈結(jié)合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB)：結(jié)合在解開DNA單鏈上，防止重新形成雙螺旋。

(6）拓撲異構(gòu)酶(topoisomerase):兼具內(nèi)切酶和連接酶活力，能迅速將DNA超螺旋或雙螺旋緊張狀態(tài)變成松馳狀態(tài)，便于解鏈。解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物酶和引發(fā)體DNA聚合酶ISSB3′3′5′3′5′5′RNA引物DNA聚合酶催化的鏈延長反應(yīng)5′RNA引物子鏈3′3′5′模板鏈進來的脫氧核苷三磷酸生長中的DNA鏈摸板DNA鏈DNA聚合酶的特點1、需要模板，在模板的指導(dǎo)下按照堿基配對原則催化合成與模板互補的子代鏈；2、需要引物，這是一條帶有3-OH的RNA片段，聚合酶只能把一個核苷酸加在引物的3-末端，因此，新合成鏈的延伸方向是從５端到３端。大腸桿菌三種DNA聚合酶比較DNA聚合酶Ⅱ結(jié)構(gòu)基因亞基數(shù)每個細胞的分子統(tǒng)計數(shù)5′-3′聚合酶活性3′-5′核酸外切酶活性5′-3′核酸外切酶活性轉(zhuǎn)化率（核苷酸/秒）DNA聚合酶ⅠPolA1400+++1000-12000PolB(dnaA)4100++-2400PolB(dnaE)1010-20++-15000-60000比較項目DNA聚合酶III切除引物修復(fù)修復(fù)復(fù)制功能

1999年發(fā)現(xiàn)聚合酶和，它們涉及DNA的錯誤傾向修復(fù)（erroounerepair）DNA聚合酶的3′-5′外切酶水解位點3′3′5′5′錯配堿基3′-5′核酸外切酶水解位點DNA聚合酶5′-3′外切酶活力

5′-3′核酸外切酶水解位點單鏈缺口5′大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ異二聚體

核心酶促使核心酶二聚化5-3聚合酶活性23-5外切酶活性“鉗”安置復(fù)合物穩(wěn)定模板結(jié)合；核心酶二聚化增加復(fù)制連續(xù)性的DNA“鉗”核心酶大腸桿菌在原點起始復(fù)制所需的蛋白連接酶連接切口Mg2+連接酶ATP或NAD＋AMP+PPi或NMN+AMPTCPTTPPPGAPACPPPPOHGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'AGAACCTTG3'5'5'5'5'3'3'模板鏈模板鏈原核細胞DNA的半不連續(xù)復(fù)制復(fù)制過程

復(fù)制叉的移動方向解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物體SSB3′3′5′前導(dǎo)鏈滯后鏈3′5′復(fù)制的起始DNA鏈的延長DNA鏈終止5′RNA引物3′3′大腸桿菌復(fù)制原點oriC中的特殊順序排列

GATCTNTTNTTT成串排列的三個13bp序列交感順序交感順序TTATCCACA

DnaA蛋白結(jié)合位點四個9bp序列DnaADnaB(解螺旋酶)SSB大腸桿菌DNA復(fù)制起點在起始階段的結(jié)構(gòu)模型預(yù)引復(fù)合物(preprimingcomplex)聚合酶III核心酶大腸桿菌復(fù)制體結(jié)構(gòu)示意圖聚合酶I聚合酶III核心酶滯后鏈前導(dǎo)鏈解螺旋酶引物合成酶RNA引物引發(fā)體拓撲異構(gòu)酶II-夾子-聚體-夾子-復(fù)合物RNA引物單鏈結(jié)合蛋白（SSB）岡崎片段的合成

3′5′3′5′3′5′DNA拓撲異構(gòu)酶前導(dǎo)鏈合成（DNA聚合酶III

）滯后鏈前一個岡崎片段的RNA引物RNA引物引物酶SSB解螺旋酶滯后鏈合成（DNA聚合酶III

）復(fù)制叉移動方向(a)(b)(c)大腸桿菌染色體復(fù)制的終止oriC逆時針復(fù)制叉順時針復(fù)制叉逆時針復(fù)制叉陷阱順時針復(fù)制叉陷阱復(fù)制叉1復(fù)制叉2完成復(fù)制DNA拓撲異構(gòu)酶IV連鎖染色體連環(huán)體形成Tus-ter復(fù)合物四、復(fù)制的忠實性

DNA復(fù)制過程是一個高度精確的過程，據(jù)估計，大腸桿菌DNA復(fù)制109

~1010堿基對僅出現(xiàn)一個誤差，保證復(fù)制忠實性的原因主要有以下四點:DNA聚合酶的高度專一性（嚴格遵循堿基配對原則，但錯配率為10-4

~10-5

）

DNA聚合酶的校對功能（錯配堿基被3’-5’外切酶切除后校正，可提高精確度102

~103倍）

DNA復(fù)制起始時以RNA為引物DNA復(fù)制后的錯配修復(fù)系統(tǒng)（提高精確度102

~103倍）DNA聚合酶的校對功能聚合酶錯配鹼基復(fù)制方向正確核苷酸5′5′5′3′3′3′切除錯配核苷酸DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)與校對功能

5′-核酸外切酶3′-核酸外切酶裂縫聚合中心裂縫內(nèi)部起始時以RNA作為引物的作用

這是保證DNA聚合過程高度精確的又一措施。已知DNA聚合酶具有35外切酶功能校對復(fù)制過程中的核苷酸，也就是說聚合酶在開始形成一個新的磷酸二酯鍵前，總是檢查前一個堿基是否正確，這就決定了它不能從頭開始合成。因此先合成一條低忠實性的多核苷酸來開始DNA的合成，并以核糖核苷酸來表示是“暫時”的，當DNA開始聚合以后再以53外切酶的功能切除，以高忠實性的脫氧核苷酸取而代之，確保復(fù)制的忠實性。五、真核細胞DNA復(fù)制的特點復(fù)制原點形成一個復(fù)制子或稱自體復(fù)制順序(automonouslyreplcatingsequence,ARS)多個起點復(fù)制真核生物的DNA聚合酶

真核DNA和原核DNA復(fù)制的主要過程是相同的，二者之間的不同在于DNA復(fù)制過程的調(diào)節(jié)及與細胞周期的關(guān)系上。真核細胞DNA多個起點復(fù)制起點起點起點起點起點起點真核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶

分子量亞基數(shù)細胞內(nèi)分布酶活力百分比外切酶活力DNA聚合酶

110-23，000多個細胞核～80%無120，000一個細胞核和線粒體2～15%無-400，000一個細胞核10～25%5-3外切酶DNA聚合酶

DNA聚合酶

45，000一個細胞核10～15%無第三節(jié)

DNA的修復(fù)

一個細胞一般只有一套或兩套基因組DNA，DNA分子本身是不可替代的。由于天然的或環(huán)境因素，DNA會受到一系列過程的損傷，細胞中存在著一套精細的DNA修復(fù)系統(tǒng)，以保持儲存于DNA中的信息的完整性。一、DNA的突變二、DNA修復(fù)及主要類型一、DNA的突變

DNA序列永久性改變，從而導(dǎo)致DNA的復(fù)制以及后來的轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物隨之發(fā)生變化，表現(xiàn)出異常的遺傳特性，稱為DNA的突變。它包括由于DNA損傷和錯配得不到修復(fù)而引起的突變，以及由于不同DNA分子之間的交換而引起的遺傳重組。二、主要誘變劑堿基類似物(baseanalog)

堿基修飾劑(basemodifier)嵌入染料(intercalationdye)

紫外線(ultraviolet)和電離輻射(ionizingradiation)一、突變的類型

堿基對的置換(substitution)—引起點突變

移碼突變(framesshiftmutation)—引起多點突變沉默突變(silentmutation)—即同義突變，突變雖然替換了堿基，但氨基酸順序未變，保持野生型的功能。

回復(fù)突變(backmutation)—克服第一次突變影響

DNA突變的類型

野生型基因

-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C--T-C-G-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-C-G-A-C-A-T-G-C-轉(zhuǎn)換

-T-C-G-T-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-A-G-A-C-A-T-G-C-顛換堿基對的置換(substitution)移碼突變(framesshiftmutation)

-T-C-G-C-A-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-G-T-G-A-C-A-T-G-C-插入

-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失AT二、

DNA修復(fù)的主要類型1、錯配修復(fù)(mismacthrepair)2、切除修復(fù)(excisionrepair)3、直接修復(fù)(directrepair)4、重組修復(fù)(binationrepair)5、差錯傾向修復(fù)（error-pronerepair)—SOS(SaveOurSouls)修復(fù)

細胞中存在著一套精細的DNA修復(fù)系統(tǒng)，DNA的修復(fù)之所以可能，是因為DNA由兩條互補的雙鏈組成，當一條鏈損傷時，損傷部分可以被切除，并在互補鏈的指導(dǎo)下準確地修復(fù)。DNA的甲基化能夠作為區(qū)分模板鏈和新合成鏈的標志3'5'AGTCTCAGCH3CH35'3'CH3AGTCCH3TCAGTCAGAGTC3'5'3'5'5'3'3'5'AGTCTCAGCH35'3'3'5'AGTCTCAGCH35'3'半甲基化的DNA3'5'AGTCTCAGCH3CH35'3'3'5'AGTCTCAGCH3CH35'3'復(fù)制復(fù)制后的短時間內(nèi)，摸板鏈是甲基化的，但新鏈未甲基化幾分鐘內(nèi)，新鏈被甲基化，兩鏈變得不可區(qū)分在此時間范圍內(nèi)進行錯配檢查并修復(fù)DNA紫外線損傷的光裂合酶修復(fù)1、紫外光照射形成胸腺嘧啶二聚體2、光復(fù)合酶結(jié)合于損傷部位3、酶被可見光激活4、修復(fù)后酶被釋放堿基缺陷或錯配結(jié)構(gòu)缺陷切開核酸內(nèi)切酶核酸外切酶切除DNA聚合酶DNA連接酶修復(fù)連接堿基丟失AP核酸內(nèi)切酶核酸外切酶切開切除糖苷酶插入酶堿基取代DNA的堿基切除修復(fù)系統(tǒng)損傷堿基AP內(nèi)切核酸酶DNA聚合酶IDNA連結(jié)酶新DNADNA的核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)

DNA的重組修復(fù)胸腺嘧啶二聚體復(fù)制核酸酶及重組蛋白修復(fù)復(fù)制DNA聚合酶DNA連接酶重組差錯傾向修復(fù)（SOS修復(fù)））DNA嚴重損傷3'5'3'5'誘導(dǎo)SOS蛋白基因表達，進行差錯傾向修復(fù)3'5'5'3'5'5'3'5'3'5'DNASOS反應(yīng)的機制未誘導(dǎo)的細胞靶基因lexA基因被LexA

蛋白質(zhì)部分阻遏recA基因被LexA

蛋白質(zhì)部分阻遏（40個不同的位點被阻遏）LexA(阻遏物)

RecA(輔蛋白酶)單鏈DNAATP靶基因表達lexA靶基因表達但產(chǎn)物被分解recA大量表達RecA促使分解LexA誘導(dǎo)的細胞DNA損傷小結(jié)

DNA修復(fù)之所以成為可能，是因為ＤＮＡ由兩條互補的雙鏈組成，當一條鏈損傷時，可以在互補鏈的指導(dǎo)下精確地修復(fù)，這正是以ＤＮＡ作為遺傳信息的載體又一優(yōu)越之處。

第四節(jié)體內(nèi)DNA的重組

DNA分子內(nèi)或分子間發(fā)生遺傳信息的重新組合，稱為遺傳重組(geneticbination)，或者基因重排(generearrangement)。重組產(chǎn)物稱為重組體DNA(-binantDNA)。重組的意義在于：能迅速地增加群體的遺傳多樣性；使有利的突變與不利突變分開通過優(yōu)化組合積累有意義的遺傳信息；為DNA損傷或復(fù)制障礙提供修復(fù)機制；參與許多重要的生物學(xué)過程，如參與某些生物的基因表達的調(diào)解以及生物發(fā)育過程基因加工（進行程序性重組）。

體內(nèi)DNA的重組的主要類型

一、同源重組（homologousbination）二、位點特異重組（site-specificbination）三、轉(zhuǎn)座重組（transpositionalbination）四、免疫球蛋白基因的重組同源重組的Holliday模型帶有鏈切口的DNA鏈和第二同源DNA鏈并排ABabABabABabABabABabABabABab鏈互換產(chǎn)生Holliday中間體分叉遷移導(dǎo)致交叉點移動，切割被修復(fù)Holliday中間體可以兩種方式分解，產(chǎn)生兩套不同產(chǎn)物。水平切割產(chǎn)生部分重組產(chǎn)物，垂直切割產(chǎn)生完全重組產(chǎn)物

同源遺傳重組及其功能

同源重組是緊密地和細胞分裂相聯(lián)系的，在減數(shù)分裂中以高頻率發(fā)生。同源遺傳重組需要兩分子之間或同一分子的不同部分同源順序之間的遺傳互換，它和細胞分裂緊密地相聯(lián)系。這種重組過程的功能有三種：

1、提供了群體的遺傳多樣性；

2、給真核細胞染色單體之間提供一種臨時的物理聯(lián)系，這種聯(lián)系是第一次減數(shù)分裂中把染色體正確分配到兩個子細胞所必須的；

3、為DNA的損傷修復(fù)提供了機會。由重組酶催化的位點特異重組反應(yīng)重組酶重組酶通過磷酸酪氨酸共價連接于DNA的切開位置切割鏈和新結(jié)合鏈連接形成Holliday中間體完成類似前兩步驟的過程重組位點的連接順序被重新組合Hollidy中間體轉(zhuǎn)座(transposons)發(fā)生示意圖轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座時靶順序被交換切割靶DNA轉(zhuǎn)座子被插入切割位點復(fù)制填充缺口，轉(zhuǎn)座子的側(cè)鏈順序被加倍末端重復(fù)免疫球蛋白IgG的一級結(jié)構(gòu)

variableregionsvariableregionsheavychainconstantregionsLightchainLightchain抗原結(jié)合區(qū)補體結(jié)合區(qū)人免疫球蛋白的分類

Ig