【課件】重組DNA技術(shù)的基本工具課件高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

基因工程

按照人們的愿望,通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計和施工的，因此又叫作重組DNA技術(shù)。操作環(huán)境：原理：操作對象：操作水平：結(jié)果：意義：體外環(huán)境基因重組基因分子水平賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品定向改造生物性狀；克服遠緣雜交不親和障礙基因工程誕生的理論基礎(chǔ)拼接的基礎(chǔ)：表達的基礎(chǔ)：1.DNA的基本組成單位相同（四種脫氧核苷酸）2.都遵循堿基互補配對原則3.DNA分子的空間結(jié)構(gòu)都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)1.基因是控制生物性狀的結(jié)構(gòu)與功能單位2.遺傳信息的傳遞都遵循中心法則3.生物界幾乎共用一套遺傳密碼回顧舊知1.基因是什么？2.基因的功能是什么？基因是有遺傳效應(yīng)的DNA片段基因通過控制蛋白質(zhì)的合成，直接或間接控制生物的性狀DNAmRNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄（RNA聚合酶）翻譯DNA：①組成元素:CHONP②DNA中文全稱:脫氧核糖核酸③基本單位:脫氧核糖核苷酸=磷酸

+

脫氧核糖

+

含氮堿基脫氧核糖含氮堿基磷酸1′4′3′2′5′ATGC脫氧核苷酸(4種)胞嘧啶脫氧核苷酸腺嘌呤脫氧核苷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸

胸腺嘧啶脫氧核苷酸脫氧核苷酸如何鏈接成脫氧核苷酸鏈的呢？脫氧核糖A磷酸脫氧核糖G磷酸脫氧核糖T磷酸T磷酸脫氧核糖C磷酸脫氧核糖A磷酸脫氧核糖氫鍵磷酸二酯鍵雙螺旋結(jié)構(gòu)5’3’3’5’DNA的結(jié)構(gòu)特點：②

和

交替連接，排列在外側(cè)，構(gòu)成

；

排列在內(nèi)側(cè)。③兩條鏈上的堿基通過

連接成堿基對，且遵循

。①DNA是由兩條單鏈組成的，這兩條鏈按

方式盤旋成雙螺旋結(jié)構(gòu)。反向平行脫氧核糖磷酸堿基基本骨架氫鍵堿基互補配對原則

DNA聚合酶：解旋酶：磷酸二酯鍵氫鍵……ATGCCGTGGAATTCC…………TACGGCACCTTAAGG……①②①磷酸二酯鍵②氫鍵重組DNA技術(shù)的基本工具第1節(jié)1.準(zhǔn)確切割DNA分子的“分子手術(shù)刀”2.將DNA片段再連接起來的“分子縫合針”3.將體外重組好的DNA分子導(dǎo)入受體細胞的“分子運輸車”1.“分子手術(shù)刀”—限制性內(nèi)切核酸酶1.來源：主要來自原核生物2.種類：數(shù)千種（限制酶不是一種酶，而是一類酶）3.特點：具有專一性①能識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列②使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開【無法識別切割RNA】【即一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并在特定的切點上切割DNA分子】4.作用部位：特定切點上的磷酸二酯鍵限制酶存在于原核生物中的作用是什么？主要起到切割外源DNA使之失效，從而達到保護自身的目的幾種常見的限制酶的識別序列及切割位點：特點：①大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成，少數(shù)限制酶的識別序列由4個、8個或其他數(shù)量的核苷酸組成。②呈現(xiàn)堿基互補對稱，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的，稱為回文序列。拓展：限制酶的名字的由來P72EcoRⅠ種加詞頭兩個字母菌株型號數(shù)字表示分離出來的第幾種限制酶屬名首字母EcoRⅠ：大腸桿菌（Escherichia

coli）R型菌株中分離出的第一個限制酶；SmaⅠ：粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia

marcescens）中分離出的第一個限制酶。11

黏性末端

黏性末端只能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。EcoRI限制酶的切割：平末端平末端SmaI限制酶的作用：只能識別CCCGGG序列，并在C和G之間切開。當(dāng)限制酶從識別序列的中心軸線處切開時，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。（1）該DNA片段上EcoRI的識別序列在哪兒？（2）請用剪刀模擬EcoRI的識別序列和切割位點將目的基因“切割”下來。探究?活動一、用剪刀模擬EcoRI剪切目的基因(Bt基因)操作5’...G3’...CTTAAAATTC...3’G...5’黏性末端黏性末端目的基因黏性末端黏性末端(3)要想獲得某個特定性狀的目的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產(chǎn)生幾個黏性(平)末端？要切2個切口，產(chǎn)生4個黏性(平)末端。思考與討論1.請結(jié)合限制酶的作用特點，回答以下問題：(1)限制酶能切開RNA分子的磷酸二酯鍵嗎？不能(2)請結(jié)合右圖，推斷限制酶切割一次可斷開幾個磷酸二酯鍵？產(chǎn)生多少游離的磷酸基團？產(chǎn)生幾個黏性末端？消耗幾分子水？消耗2分子水。斷開2個磷酸二酯鍵；產(chǎn)生2個游離的磷酸基團；產(chǎn)生2個黏性末端；2.請寫出下列限制酶切割形成的黏性末端，并思考同種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端是否一定不同？同種限制酶產(chǎn)生的黏性末端相同，不同的限制酶可能會形成相同的黏性末端3.請判斷：以下黏性末端是由

種限制酶作用產(chǎn)生的。三4.為什么限制酶不切割細菌本身的DNA分子？含某種限制酶的細菌的DNA分子不具備這種限制酶的識別序列，或者甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到了限制酶所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。2.“分子縫合針”—DNA連接酶1.作用：將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵

2.種類：E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源大腸桿菌T4噬菌體相同點恢復(fù)磷酸二酯鍵不同點只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)1802兩DNA片段要具有互補的黏性末端才能拼起來可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，注意：DNA連接酶可連接雙鏈DNA中的兩條單鏈缺口，但不能連接單鏈DNA！DNA連接酶的縫合作用1902“分子縫合針”----DNA連接酶（1）E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶連接粘性末端2002“分子縫合針”----DNA連接酶（2）T4DNA連接酶連接平末端，效率低3.DNA連接酶和DNA聚合酶是一回事嗎？相同點：都是催化磷酸二酯鍵形成的酶。不同點：DNA聚合酶連接的是游離的脫氧核苷酸，需要模板；DNA連接酶連接的是DNA片段。名稱作用部位作用結(jié)果限制酶

DNA連接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶解旋酶磷酸二酯鍵堿基對之間的氫鍵將DNA切成兩個片段磷酸二酯鍵將兩個DNA片段連接為一個DNA分子磷酸二酯鍵將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端磷酸二酯鍵將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈3.“分子運輸車”—基因進入受體細胞的載體1.作用：將外源基因送入受體細胞,

在受體細胞內(nèi)對目的基因進行大量復(fù)制.

2.種類：質(zhì)粒、噬菌體

動物病毒

植物病毒將外源基因?qū)氪竽c桿菌等受體細胞

將外源基因?qū)雱游锛毎?/p>

將外源基因?qū)胫参锛毎?/p>

3.質(zhì)粒：質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。4.運載體需具備的條件：②能進行自我復(fù)制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制①有一個至多個限制酶切割位點，供外源DNA片段（基因）插入其中③有特殊的標(biāo)記基因，比如：四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因，便于重組DNA分子的篩選④對受體細胞無害、易分離真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進行過人工改造的。5.思考：將含有目的基因的DNA與質(zhì)粒分別用同樣的限制酶切割，在DNA連接酶的作用下，由兩個DNA片段連結(jié)成的產(chǎn)物有幾種？目的基因限制酶DNA連接酶載體①對受體細胞無害；②有一個至多個限制酶切割位點；③有特殊的標(biāo)記基因；④能自我復(fù)制或能整合到宿主DNA上。質(zhì)粒、噬菌體、動植物病毒基因工程的基本工具作為載體的條件種類：磷酸二酯鍵來源：主要來源于原核生物特點：作用部位：具有專一性結(jié)果：形成黏性末端或平末端連接部位：磷酸二酯鍵種類：E.coliDNA連接酶、T4DNA連接酶作用：把兩條雙鏈DNA片段拼接起來

課堂小結(jié)4.DNA的粗提取與鑒定1.原理：DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精初步分離DNA和蛋白質(zhì)DNA能溶于物質(zhì)的量濃度為2mol/L的NaCl溶液溶解DNA在一定溫度下（沸水?。?，DNA被二苯胺試劑染成藍色鑒定DNA2.選材：DNA含量相對較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等。（注意：不能選擇哺乳動物成熟的紅細胞，因為哺乳動物成熟的紅細胞中沒有細胞核和線粒體，幾乎不含DNA。）視頻演示：DNA的粗提取與鑒定28稱取

，切碎，放入研缽，倒入

，充分研磨。在漏斗中墊上紗布過濾研磨液，4℃冰箱中靜置后取

；或?qū)⒀心ヒ旱谷胨芰想x心管中離心，取

。在上清液中加入體積相等的、

溶液,靜置2~3min，溶液中出現(xiàn)的

就是粗提取的DNA。2.去除雜質(zhì)—3.DNA的析出—1.破碎細胞——洋蔥研磨液上清液上清液預(yù)冷的酒精白色絲狀物用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物；或?qū)⑷芤旱谷胨芰想x心管中離心，取沉淀物晾干。析出DNA3.方法步驟：29將絲狀物或沉淀物溶于

溶液中，加入

試劑，混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min4.DNA的鑒定—二苯胺2mol/L的NaCl空白對照組：

在等體積的NaCl溶液中加入二苯胺試劑，將試管置于同等沸水浴中加熱5min。思考：如何評價結(jié)果？——看提取物顏色——看與二苯胺反應(yīng)顏色的深淺DNA純度

DNA的量(1)通過基因工程產(chǎn)生的變異是不定向的(

)(2)限制性內(nèi)切核酸酶均能特異性地識別6個核苷酸序列(

)(3)DNA連接酶能將兩堿基通過氫鍵連接起來(

)(4)限制酶和解旋酶的作用部位相同(

)判斷正誤××××(5)作為載體的質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為篩選標(biāo)記基因(

)(6)質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈DNA分子，是基因工程常用的載體(

)(7)載體(如質(zhì)粒)和細胞膜中的載體蛋白的成分相同(

)(8)作為載體，必須要有標(biāo)記基因(

)×√×√1.(2022·天津耀華中學(xué)高二期中)以下是幾種不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列敘述正確的是()典題應(yīng)用A.以上DNA片段是由4種限制酶切割后產(chǎn)生的B.②片段是在識別序列為

的限制酶作用下形成的C.①和④兩個片段在DNA聚合酶的作用下可形成重組DNA分子D.限制酶和DNA連接酶作用的部位都是磷酸二酯鍵D2.DNA連接酶是重組DNA技術(shù)中常用的一種工具酶。下列相關(guān)敘述正確的是()A.能連接DNA分子雙鏈堿基對之間的氫鍵B.能將單個脫氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵C.能連接用同種限制酶切開的兩條DNA片段，重新形成磷酸二酯鍵D.DNA連接酶只能連接雙鏈DNA片段互補的黏性末端C3.下列關(guān)于基因運輸工具——載體，必須具備的條件之一及理由均正確的是()A.能夠復(fù)制，以便目的基因插入其中B.具有多個限制酶切割位點，便于目的基因的表達C.具有某些標(biāo)記基因，便于重組DNA的篩選D.對受體細胞無害，便于重組DNA的篩選典題應(yīng)用C4.某細菌質(zhì)粒上有標(biāo)記基因如圖所示，通過標(biāo)記基因可以推知外源基因(目的基因)是否轉(zhuǎn)入成功。外源基因插入的位置不同，細菌在培養(yǎng)基上的生長情況也不同，如圖所示是外源基因插入位置(插入點有a、b、c)示意圖，請根據(jù)表中提供的細菌生長情況，推測①②③三種重組后細菌的外源基因插入點，正確的一組是()插入點細菌在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上的生長狀況細菌在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上的生長狀況①能生長能生長②能生長不能生長③不能生長能生長A.①是c；②是b；③是aB.①是a和b；②是a；③是bC.①是a和b；②是b；③是aD.①是c；②是a；③是bA5.科學(xué)家們經(jīng)過多年的努力，創(chuàng)立了一種新興生物技術(shù)——基因工程。實施該工程的最終目的是()A.定向提取生物體的DNA分子B.定向地對DNA分子進行人工“剪切”C.在生物體外對DNA分子進行改造D.定向地改造生物的遺傳性狀D6.科學(xué)家把兔子血紅蛋白基因?qū)氪竽c桿菌細胞中，在大腸桿菌細胞中合成了兔子的血紅蛋白。下列關(guān)于這一先進技術(shù)的理論依據(jù)不正確的是()A.所有生物共用一套遺傳密碼B.基因能控制蛋白質(zhì)的合成C.兔子血紅蛋白基因與大腸桿菌的DNA都是由四種脫氧核苷酸構(gòu)成，都

遵循相同的堿基互補配對原則D.兔子與大腸桿菌有共同的原始祖先D7.據(jù)圖所示，有關(guān)工具酶功能的敘述不正確的是()A.限制性內(nèi)切核酸酶可以切斷a處B.DNA聚合酶可以連接a處C.解旋酶可以使b處解開D.DNA連接酶可以連接c處D8.限制酶和DNA連接酶是基因工程的工具酶，以下說法正確的是()A.DNA連接酶能將單個核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯鍵B.限制酶只能切割雙鏈DNA片段，不能切割煙草花葉病毒的核酸C.E.coliDNA連接酶既能連接黏性末端，也能連接平末端D.限制酶主要從原核生物中分離純化而來，所以也能剪切自身的DNAB9.限制酶是一種核酸切割酶，可辨識并切割DNA分子上特定的脫氧核苷酸序列。如圖所示為四種限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ以及BglⅡ的識別序列，箭頭表示每一種限制酶的特定切割位點，切割出來的DNA片段末端可以互補黏合的是

(限制酶)，其正確的末端互補序列應(yīng)該為()A.BamHⅠ和EcoRⅠ；末端互補序列為

—AATT—B.BamHⅠ和HindⅢ；末端互補序列為

—GATC—C.EcoRⅠ和HindⅢ；末端互補序列為—AATT—D.BamHⅠ和BglⅡ；末端互補序列為—GATC—D10.(2022·天津靜海高二階段練習(xí))有關(guān)下圖所示的黏性末端的說法，錯誤的是()A.甲、乙、丙黏性末端分別是由不同的限制酶切割產(chǎn)生的B.甲、乙具有相同的黏性末端，可形成重組DNA分子，但甲與丙的黏性

末端不互補C.DNA連接酶的作用位點是a處D.切割產(chǎn)生甲的限制酶識別的核苷酸序列是“CAATTG”D11.質(zhì)粒是基因工程中最常用的外源基因運載工具。下列有關(guān)敘述正確的是()A.質(zhì)粒只分布于原核細胞中B.在所有的質(zhì)粒上總能找到一個或多個限制酶切割位點C.攜帶外源基因的重組質(zhì)粒只有整合到宿主細胞的DNA上才會隨后者的

復(fù)制而復(fù)制D.質(zhì)粒上的抗性基因常作為標(biāo)記基因供重組DNA分子的篩選D12.(2022·重慶市第一中學(xué)期末)下列關(guān)于質(zhì)粒的敘述，正確的是()A.細菌質(zhì)粒和真核細胞DNA的基本組成單位不同B.細菌質(zhì)粒的復(fù)制過程一定是在受體細胞外獨立進行的C.質(zhì)粒是存在于所有細胞中的蛋白質(zhì)合成的場所D.質(zhì)粒是細胞質(zhì)中能夠自我復(fù)制的環(huán)狀DNA分子D13.(2022·云南曲靖高二期中)如表列舉了幾種限制酶的識別序列及其切割位點(箭頭表示相關(guān)酶的切割位點)。如圖是酶切后產(chǎn)生的幾種末端。下列說法正確的是()A.BamHⅠ切割的是氫鍵，AluⅠ切割的是磷酸二酯鍵B.Sau3AⅠ和BamHⅠ切割的序列產(chǎn)生的片段能夠相連，連接后的片段還能被

Sau3AⅠ切割C.DNA連接酶能連接②⑤，不能連接②④D.E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶都能連接①③，且連接效率低B14.(2022·安徽蕪湖高二期中)某線性DNA分子含有5000個堿基對(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的產(chǎn)物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如下表。限制酶a和b的識別序列和切割位點如下圖所示。下列敘述錯誤的是()a酶切割產(chǎn)物(bp)b酶再次切割產(chǎn)物(bp)2100；1400；1000；5001900；200；800；600；1000；500A.a酶與b酶切斷的化學(xué)鍵相同B.a酶與b酶切出的黏性末端能相互連接C.a酶與b酶切割該DNA分子位點分別有3個和5個D.限制酶將一個DNA分子片段切成兩個片段需消耗兩個水分子C15.(2022·甘肅金昌高二期中)下列有關(guān)限制性內(nèi)切核酸酶的敘述，正確的是()A.用限制酶酶切獲得一個外源基因時得到兩個切口，有4個磷酸二酯鍵

被斷開B.限制酶識別序列越短，則該序列在DNA中出現(xiàn)的概率就越小C.—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端可用

DNA連接酶連接D.只有用相同的限制酶處理含目的基因的片段和質(zhì)粒，才能形成重組

質(zhì)粒A16.(2022·河南洛陽高二期中)已知限制性內(nèi)切核酸酶XmaⅠ和SmaⅠ的識別序列分別為C↓CCGGG和CCC↓GGG。下列有關(guān)這兩種限制酶及應(yīng)用的敘述，不正確的是()A.這兩種限制酶作用的底物都是雙鏈DNA，切開磷酸二酯鍵B.這兩種限制酶切割后形成的末端不同C.SmaⅠ切割DNA后形成的末端可用E.coliDNA連接酶連接D.使用這兩種酶時需注意控制反應(yīng)溫度、時間等C17.(2022·吉林長春高二質(zhì)檢)下圖所示的酶M和酶N是兩種限制酶，圖中DNA片段只注明了黏性末端處的堿基種類，其他堿基的種類未作注明。下列敘述中不正確的是()A.多個片段乙與丁混合在一起，可用DNA連接酶拼接得到環(huán)狀DNAB.多個片段乙與丁混合，只由兩個DNA片段連接成的環(huán)狀DNA分子共有4種C.一種限制酶只能識別雙鏈DNA中某種特定的脫氧核糖核苷酸序列D.若酶M特異性剪切的DNA片段是

，則酶N特異性剪切的DNA

片段是

B18.根據(jù)基因工程的有關(guān)知識，回答下列問題：(1)限制酶切割DNA分子后產(chǎn)生的DNA片段，其末端類型通常有___________和

。(2)質(zhì)粒載體用限制酶X(識別的序列由6個核苷酸組成)切割后產(chǎn)生的片段如下：該酶識別的序列為

，切割的部位是

。