有機(jī)多糖蒙脫石脫出玉米赤霉烯酮的體外評測及動物實(shí)驗(yàn)效果

有機(jī)多糖蒙脫石脫除玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素的體外評測及動物實(shí)驗(yàn)效果

赤峰和正美技術(shù)部摘要：通過對多糖類酵母細(xì)胞壁改性，使之能夠在水環(huán)境下與蒙脫石進(jìn)行插層反應(yīng)，形成的有機(jī)多糖蒙脫石對玉米赤霉烯酮（ZEA）、嘔吐毒素（DON）有較強(qiáng)的脫除效果前言：玉米赤霉烯酮（ZEN），又稱F2毒素，化學(xué)名稱為6-（10-羥基-6-氧基碳烯基）-B-雷鎖酸-u-內(nèi)酯，是一種具強(qiáng)烈致畸作用的生殖系統(tǒng)毒素，會導(dǎo)致家畜生長速度下降、免疫抑制、繁殖障礙等后果，從而給畜牧業(yè)帶來嚴(yán)重威脅。嘔吐毒素（DON）是B型單端孢霉烯族化合物，主要由鐮刀菌屬等產(chǎn)生。DON化學(xué)結(jié)構(gòu)為3a，7a，15-三羥基-12，13-環(huán)氧單端孢霉-9烯-8酮，屬于B型TCH。DON分子式為C15H20O6，相對分子質(zhì)量為296.32。DON純品為白色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)151153°C，DON易溶于水、乙醇等溶劑，性質(zhì)穩(wěn)定，具有較強(qiáng)的熱抵抗力DON具有影響消化系統(tǒng)、細(xì)胞毒性、免疫毒性、神經(jīng)毒性以及致癌、致畸、致突變等作用。DON-BSA偶聯(lián)物紅外光譜圖[5]表1主要幾個霉菌毒素的分子大小（單位：nm）H：可能吸附位置上的分子近似大小;L:從H位置旋轉(zhuǎn)90度后的分子近似大小黃曲霉毒素赭曲霉毒素玉米赤霉烯酮毒素?zé)熐苟舅貒I吐毒素H0.80.72.02.01.5L2.03.01.56.02.5~4.0目前，無論是體外評價實(shí)驗(yàn)還是動物飼喂效果實(shí)驗(yàn)，蒙脫石對黃曲霉毒素尤其是黃曲霉毒素B1有很好的效果【1】【2】【3】但蒙脫石對玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素這些非極性大分子單端孢烯的吸收作用有限。且這種作用一定范圍內(nèi)是非特異性的，與許多毒素的結(jié)合都不完全，還會吸附營養(yǎng)成分，如礦物質(zhì)和維生素（Kramer等，1993：Chestnut等，1992）。蒙脫石能夠有效吸附黃曲霉毒素，在體內(nèi)和體外試驗(yàn)中均能夠吸附帶極性電荷的黃曲霉毒素和麥角堿。然而對極性較小的如具有疏水性質(zhì)的玉米赤霉烯酮霉菌毒素吸附效果不佳。（Phillips等，1995）Volko等（1998）研究表明：蒙脫石主要吸附黃曲霉毒素，而對玉米赤霉烯酮幾乎沒有吸附能力。feng等2008）蒙脫石在水溶液中對AFB1、FUMB的吸附率在95~99%、78.2~92.2%中，體外吸附對ZEN吸附率0.91mg/kg.由于黃曲霉毒素AFB1具有剛性平面分子結(jié)構(gòu)，能進(jìn)入蒙脫石晶層間，ZEN分子只是部分呈平面結(jié)構(gòu)，其他部分較松散，由于位阻作用，不能進(jìn)入到晶層，因而吸附率較低（齊德生等2002）由此，將蒙脫石進(jìn)行季銨鹽等有機(jī)改性處理，體外實(shí)驗(yàn)表明，很大程度上提高了對ZEA吸附率【4】單妹2006；吡啶鹽蒙脫石對ZEN的吸附可能與疏水力及電荷靜電力有關(guān)，疏水作用力主要發(fā)生在蒙脫石層間，電荷靜電力主要是由于ZEN的陰離子狀態(tài)與蒙脫石表面的陽離子電荷發(fā)生作用而產(chǎn)生的（lemke等，1998），有機(jī)蒙脫石對ZEN的吸附主要靠疏水作用力（pimpukdee等，2004；而生產(chǎn)實(shí)踐表明，飼料中添加酵母細(xì)胞壁能有效解除玉米赤霉烯酮對動物的損害?！?】酵母細(xì)胞壁的MOS的主鏈主要以高度分枝的吡喃甘露糖殘基鏈進(jìn)行排列，連接方式是a-l，6糖昔鍵連接。動物消化道內(nèi)病原菌細(xì)胞表面或絨毛上具有類丁質(zhì)結(jié)構(gòu)（外源凝集素），它能識別動物腸壁細(xì)胞上的“特異糖類”受體并與之結(jié)合，在腸壁上繁殖導(dǎo)致腸道疾病的發(fā)生。而MOS與病原菌在腸壁上的受體具有相似的結(jié)構(gòu)，它與病原菌表面的類丁質(zhì)也有很強(qiáng)的結(jié)合力，可競爭性地與病原菌結(jié)合，使其無法附植在腸壁上，結(jié)合后的甘露寡糖不能提供病原菌生長所需的營養(yǎng)素，致使病原菌死亡而失去致病能力。B-D-葡聚糖是啤酒酵母細(xì)胞壁的主要成分之一， 但由于酵母B-D-葡聚糖難溶于水，且對ZEA脫除也不能用體外的方法進(jìn)行定量評價，其應(yīng)用受到了限制。因此對其進(jìn)行化學(xué)改性， 改善溶解性能，能夠在水介質(zhì)中能與蒙脫石結(jié)合，形成有機(jī)多糖蒙脫石，即對黃曲霉毒素吸附有效，又對玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素也有很好的脫除效果。關(guān)鍵詞：有機(jī)多糖蒙脫石、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、評價一、評價實(shí)驗(yàn)：1、用ELISA法體外評價有機(jī)多糖蒙脫石對ZEA、DON的脫除效果1.1材料，自然霉變的玉米胚芽粕、有機(jī)多糖蒙脫石(赤峰和正美產(chǎn))1.2儀器酶標(biāo)儀、快速混勻器、分析天平、高速離心機(jī)、恒溫水浴振蕩器、1.3試劑DON、ZEN酶聯(lián)免疫定量測試盒(北京勤邦生物科技有限公司)；甲醇；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、鹽酸(均為分析純)。1.4試驗(yàn)方法1.4.1吸附試驗(yàn)參照的《飼料中玉米赤霉烯酮的測定》GB/T19540-2004《谷物及其制品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定》GB/T5009.111-2003及北京勤邦試劑盒方法，取玉米胚芽粕(ZEA含1102ug/kgDON含量565.3ug/kg)30克按照0.4%添加量添加有機(jī)多糖蒙脫石，放入高速粉碎機(jī)中混合、粉碎至約60目。取混合物5&，加入60%甲醇溶液，PH7.0的條件下，室溫、200r/min的恒溫振蕩水浴鍋上振蕩處理30min。反應(yīng)結(jié)束后于5000r/min下離心3min，并收集上清液，ELISA法測定上清液中剩余DON和ZEN的含量。按下列公式計算吸附量Q(mg/g)和吸附率Y(%):Q二VX(C-C)/m(1)0Y=100X(C0-C)/C0(2)其中：V為溶液的體積(ml)；m為吸附劑的用量(mg)；C。、C分別為反應(yīng)前后霉菌毒素的濃度(ng/ml)。1.4.2解吸附試驗(yàn)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，傾去離心、管中上清液，在剩余物中加入10ml甲醇提取液，在室溫、200r/min的恒溫振蕩水浴鍋上振蕩處理10min，反應(yīng)結(jié)束后于5000r/min下離心3min，并收集上清液，ELISA法測定上清液中ZEA和DON的含量，經(jīng)殘液校正后，計算解吸率。解吸過程重復(fù)3次，求累積解吸率R(%)。R=m/m0X100%(3)其中：m為3次解吸上清液中毒素的含量(ng)；m0為解吸附前復(fù)合物中毒素的含量(ng)。1.5數(shù)據(jù)計算與分析根據(jù)各樣品OD值，用EXCEL2003計算各樣品中ZEA和DON的含量；所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果采用平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示。1.6結(jié)果與分析1.6.1有機(jī)多糖蒙脫石對玉米胚芽粕對ZEA、DON的吸附率和解吸率序號脫霉劑添加量添加方式粕原有ZEA量(ug/kg)加入脫霉劑后ZEA量（ug/kg）脫除率％解吸率粕原有DON量(ug/kg)加入脫霉劑后DON量（ug/kg）脫除率％解吸率1有機(jī)多糖蒙脫石4%。強(qiáng)力混合1102482.656.22.23565.3330.741.54.54從表2吸附率看，有機(jī)多糖蒙脫石對ZEA、DON都呈現(xiàn)了較好的吸附，吸附率達(dá)到50%左右；這是由于有機(jī)多糖蒙脫石中糖昔鍵在水介質(zhì)中與ZEA結(jié)合，與DON中C4位點(diǎn)水解的脂鍵作用生成有機(jī)復(fù)合物。從解吸率看，解吸率也在2?4%，說明有機(jī)蒙脫石吸附ZEA、DON后所形成的復(fù)合物穩(wěn)定性非常好。2、通過給母豬飼喂含有ZEA飼料，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證有機(jī)多糖蒙脫石脫除飼料中ZEA的效果；2.1材料與方法將40頭平均體重是9.8kg斷奶仔母豬，分為四種方法飼喂：1） 飼料；2） 飼料+0.4%有機(jī)多糖蒙脫石；3） 含有ZEA玉米胚芽粕的飼料；4） 含有ZEA玉米胚芽粕的飼料+0.4%有機(jī)多糖蒙脫石。每只豬分別在0.70平方米的豬舍單獨(dú)飼養(yǎng)，隨時記錄豬的飲食飲水情況。每周對飼料攝取量，體重增加和飼料轉(zhuǎn)化率進(jìn)行了測量和計算。外陰大小的計算按照：長度X寬度X高度，每隔三天測量一次，飼養(yǎng)21天。在最后對試驗(yàn)組的母豬進(jìn)行安樂處死，摘除豬的生殖道進(jìn)行重量和長度的測定。所有的測量結(jié)果通過方差分析表明，通過Tukey方法對兩個試驗(yàn)組的平均值進(jìn)行比較，P<0.05差異顯著。2.2小結(jié)飼料中添加了0.4%的有機(jī)多糖蒙脫石沒有降低性能。單獨(dú)飼喂含有毒素的玉米胚芽粕而沒有添加有機(jī)多糖蒙脫石的試驗(yàn)組，豬的外陰尺寸增加，但是在加入有機(jī)多糖蒙脫石的試驗(yàn)組中，卻減小了對外陰的這種效果。相比那些飼喂對照日糧的母豬，飼喂不添加有機(jī)多糖蒙脫石的玉米胚芽粕的母豬生殖道的重量和長度均有所增加。因此，在豬日糧中加入0.4%的有機(jī)多糖蒙脫石對生長性能沒有影響，但是降低了玉米赤霉烯酮的毒副作用。由于玉米胚芽粕中嘔吐毒素含量太低，國家飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中允許量為1000ug/kg，所以飼喂含有DON的玉米胚芽粕對豬沒有明顯癥狀。用氚標(biāo)記ZEA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在豬及兔體內(nèi)，肝臟為主要分解代謝器官，主要由肝臟中分子量約為230，000道爾頓的3a-OH脫氫酶使之分解轉(zhuǎn)化為a-zearalenol和B-zearalenol然后通過小腸進(jìn)行吸收；空腸占小腸吸收的70%-85%，回腸占小腸吸收的30%-15%;嘔吐毒素干擾營養(yǎng)物質(zhì)在腸道中的吸收，如葡萄糖和氨基酸。鈉-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SGLT-1）負(fù)責(zé)葡萄糖的攝取，低濃度的嘔吐毒素就足以抑制SGLT-1，從而減少葡萄糖的攝取。SGLT-1是對嘔吐毒素最敏感的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其次是果糖被動轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT-5。SGLT-1還負(fù)責(zé)水的重吸收，嘔吐毒素對SGLT-1的抑制作用，可能是嘔吐毒素常常誘發(fā)腹瀉的原因之一。同時，DON能通過調(diào)節(jié)小腸5-羥色胺、兒茶酚胺等受體抑制小腸的正常蠕動，是豬嘔吐的因素。二、結(jié)論：有機(jī)多糖與蒙脫石通過特殊工藝生產(chǎn)的有機(jī)多糖蒙脫石，使得多糖上的糖昔鍵在水介質(zhì)中與ZEA、DON強(qiáng)力鍵合，對自然霉變產(chǎn)生的復(fù)合霉菌毒素玉米赤霉烯酮(ZEA)、嘔吐毒素(DON)不論是體外評估還是飼喂效果實(shí)驗(yàn)，均呈現(xiàn)較好的吸附脫除作用。不僅吸附量大、作用強(qiáng)而且吸附速度快、解吸率低，有機(jī)多糖蒙脫石對于多種菌屬產(chǎn)生的毒素有著一箭雙雕的功效。為解決飼料中ZEA、DON的吸附問題提供了新的途徑。產(chǎn)生的有機(jī)復(fù)合物不會降解游離出毒素對環(huán)境不會造成二次污染。三、參考文獻(xiàn)：【1】齊德生；蒙脫石改性前后對AFI和營養(yǎng)成分的吸附及對AF,的脫毒效果【2】雷春龍等日糧中添加蒙脫石和酵母細(xì)胞壁對肉牛體內(nèi)內(nèi)毒素吸附、養(yǎng)分消化率及生產(chǎn)性能的影響【3】高領(lǐng)1,王蕾2,許小友2,李艷濤3飼料中的黃曲霉毒素對牛奶品質(zhì)的影響鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校學(xué)報2011年2月第31卷第1期【4