樣本前期處理及染色趙恒

取材注意事項(xiàng)

1、植物材料選擇時(shí)須盡可能不損傷植物體或所需要的部分動(dòng)物材料取用時(shí)常對(duì)動(dòng)物施以麻醉，常用的麻醉劑有氯仿和乙醚，或?qū)?dòng)物殺死后迅速取出所需要的組織

2、取材必須新鮮，這一點(diǎn)對(duì)于從事細(xì)胞生物學(xué)研究尤為重要，應(yīng)該盡可能割取生活著的組織塊，并投入固定液

3、切取材料時(shí)刀要銳利，避免因擠壓細(xì)胞使其受到損傷

4、切取的材料應(yīng)該小而薄，便于固定劑迅速滲入內(nèi)部。一般厚度不超過(guò)2mm，大小不超過(guò)5×5mm2

1當(dāng)前1頁(yè)，總共26頁(yè)。固定液的性質(zhì)和條件1、能迅速滲入組織，使組織細(xì)胞形態(tài)在短期內(nèi)不至于有較大變化2、固定液有相當(dāng)?shù)臐B透力，對(duì)組織各部分的滲透力相等，可使組織內(nèi)外完全固定3、使組織細(xì)胞不至于因固定而引起人為的改變4、盡可能避免固定劑使組織膨脹或收縮5、使組織達(dá)到一定硬度，獲得較佳的折光率和對(duì)染料具有較強(qiáng)的親合力。固定當(dāng)前2頁(yè)，總共26頁(yè)。固定劑種類(lèi)單純固定劑：10%甲醛、4%多聚甲醛、飽和的苦味酸溶液、冰醋酸、鋨酸混合固定劑：Bouin氏固定液、Zenker液（PH2.3）、Carnoy液、改良Bouin氏固定液當(dāng)前3頁(yè)，總共26頁(yè)。固定的目的1、防止組織溶解及腐敗，以保持組織和細(xì)胞與正常生活時(shí)的形態(tài)相似2、使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪、糖、酶等各種成分轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，以保持它原有的結(jié)構(gòu)與生活時(shí)的相仿3、組織細(xì)胞內(nèi)的不同物質(zhì)經(jīng)固定后可以產(chǎn)生不同的折光率，對(duì)染料也產(chǎn)生不同的親和力，造成光學(xué)上的差異，使得在生活情況下原來(lái)看不清楚的結(jié)構(gòu)變得清晰起來(lái)，并使得細(xì)胞各部分容易著色，有利于區(qū)別不同的組織成分4、固定劑的硬化作用，增加組織硬度，便于制片

當(dāng)前4頁(yè)，總共26頁(yè)。固定時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng)1、固定液及被固定的組織必須新鮮；固定液的用量一般為組織體積的10~20倍2、固定時(shí)間視組織塊的種類(lèi)、性質(zhì)、大小，固定液的種類(lèi)性質(zhì)、滲透力的強(qiáng)弱，固定時(shí)的溫度的高低，實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡葋?lái)決定3、防止被固定的組織因固定劑的作用而發(fā)生變形4、固定所用的固定液，以新配的為好，放置過(guò)久會(huì)失效5、在固定期間搖動(dòng)組織或搖動(dòng)容器有利于固定液的滲入，對(duì)長(zhǎng)期固定的標(biāo)本，可經(jīng)常更換固定液6、固定時(shí)間太短，就會(huì)影響組織固定的效果時(shí)間太長(zhǎng)，福爾馬林會(huì)產(chǎn)生一種酸，影響核的染色當(dāng)前5頁(yè)，總共26頁(yè)。脫水透明標(biāo)本經(jīng)二甲苯透明后，折射率改變，透明度提高，使得染上色的部位更清晰地顯示出來(lái)。

步驟流水沖洗4h→70％乙醇2h→80％乙醇過(guò)夜→

90％乙醇2h→無(wú)水乙醇Ⅰ1h→無(wú)水乙醇Ⅱ1h→二甲苯Ⅰ15min→二甲苯Ⅱ15min當(dāng)前6頁(yè)，總共26頁(yè)。較常用的透明劑是二甲苯、甲苯、苯、氯仿等1、二甲苯作用較快，透明力強(qiáng)，但組織塊在其中停留過(guò)久，容易收縮變脆變硬2、甲苯的一般性質(zhì)與二甲苯相似。用法亦同，唯沸點(diǎn)較低，透明較慢，但不會(huì)使組織變脆3、苯的用法同于二甲苯，對(duì)組織的收縮作用小，但須警惕其爆炸和吸入而引起中毒。4、氯仿適于大塊組織的透明

當(dāng)前7頁(yè)，總共26頁(yè)。注意事項(xiàng)1、透明時(shí)間應(yīng)由組織大小而定，—般各級(jí)停留時(shí)間在5min至15min，在純二甲苯中應(yīng)更換2次，總時(shí)間則以不超過(guò)1h為宜2、材料經(jīng)過(guò)透明，會(huì)顯示出前一步脫水的效果如何，若脫水徹底，組織則顯現(xiàn)透明狀態(tài)，如組織中有白色云霧狀說(shuō)明脫水不凈，須返工處理，但返工的效果往往不好3、使用二甲苯透明時(shí)，應(yīng)避免其揮發(fā)和吸收空氣中的水分并保持其無(wú)水狀態(tài)當(dāng)前8頁(yè)，總共26頁(yè)。浸蠟包埋1、組織經(jīng)過(guò)脫水透明處理后浸蠟4h，然后進(jìn)行包埋2、浸蠟須在恒溫箱中進(jìn)行，恒溫箱的溫度調(diào)節(jié)至高于石蠟熔點(diǎn)3度當(dāng)前9頁(yè)，總共26頁(yè)。切片可能產(chǎn)生的問(wèn)題及解決方法切片厚薄不勻原因：1、切片機(jī)有毛病2、夾刀不當(dāng)，刀的傾角太大3、未旋緊標(biāo)本臺(tái)螺旋4、石蠟塊過(guò)硬解決辦法1．矯正切片機(jī)裝置2．對(duì)癥治療3．旋緊螺旋4．將石蠟塊在水中浸泡

當(dāng)前10頁(yè)，總共26頁(yè)。材料發(fā)生裂隙破碎或脫落原因：1、脫水不干凈2、有透明劑殘留3、石蠟透入時(shí)，溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)4、由于脫水劑和透明劑的影響，使組織變硬發(fā)脆5、材料太硬或太粗補(bǔ)救辦法：1、無(wú)法彌補(bǔ)2、增加浸蠟時(shí)間，重新包埋3、無(wú)法補(bǔ)救4、用正丁醇、叔丁醇和二氧六環(huán)等進(jìn)行脫水和透明5、在蠟塊表面涂一薄層火棉膠溶液

當(dāng)前11頁(yè)，總共26頁(yè)。展片和撈片1、直接展片法：在載玻片上滴加幾滴蒸餾水，然后把切片鋪在小滴上面，用酒精燈在載玻片下面加熱，待完全展平，傾斜載玻片，倒棄多余水分，同時(shí)擺正切片。

2、溫水漂浮法：用恒溫水浴箱，先使水溫保持在42℃，使切好的石蠟切片漂浮在溫水中受熱后及在表面張力的作用會(huì)自然平整地展開(kāi)，必要時(shí)可用眼科鑷輕輕拔開(kāi)，然后撈片，并及時(shí)編號(hào)。展好的切片放在64℃恒溫烤箱中4h，烤干備用。當(dāng)前12頁(yè)，總共26頁(yè)。包埋模具染色缸當(dāng)前13頁(yè)，總共26頁(yè)。

切片盒切片機(jī)當(dāng)前14頁(yè)，總共26頁(yè)。HE

蘇木精—伊紅染色法簡(jiǎn)稱(chēng)HE染色法，石蠟切片技術(shù)里常用的染色法之一。S蘇木精染液為堿性，主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體著紫藍(lán)色；伊紅為酸性染料，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色。HE染色法是組織學(xué)、胚胎學(xué)、病理學(xué)教學(xué)與科研中最基本、使用最廣泛的技術(shù)方法。當(dāng)前15頁(yè)，總共26頁(yè)。染色步驟1、64℃烤片30min2、脫蠟至水（二甲苯ⅠⅡ各15min，無(wú)水乙醇ⅠⅡ各5min，90％、80％、70％乙醇各1min）3、蒸餾水浸洗3min4、蘇木素染3min5、鹽酸酒精分化6、自來(lái)水返藍(lán)15min7、伊紅染色30min8、脫水（70％、80％、90％乙醇各30s，無(wú)水乙醇ⅠⅡ各2min，二甲苯ⅠⅡ各15min）9、封片鏡檢當(dāng)前16頁(yè)，總共26頁(yè)。當(dāng)前17頁(yè)，總共26頁(yè)。當(dāng)前18頁(yè)，總共26頁(yè)。幾種常見(jiàn)的染色問(wèn)題脫蠟：切片中白色的區(qū)域脫蠟不徹底，染色液由于石蠟斑點(diǎn)的殘留而不能滲透著色。原因：①烤(烘)片溫度太低，脫蠟前沒(méi)有充分烤(烘)干。②二甲苯脫蠟時(shí)間不足，或二甲苯使用過(guò)久，造成脫蠟不盡。對(duì)策：切片需退回到脫蠟步驟，延長(zhǎng)脫蠟時(shí)間，或跟換二甲苯，重新染色。當(dāng)前19頁(yè)，總共26頁(yè)。染色：蘇木素著色原因：染色時(shí)間短；蘇木素過(guò)度氧化，失去染色能力；分化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。蘇木素染色太淺，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)顏色對(duì)比度差。對(duì)策：切片重新染色。當(dāng)前20頁(yè)，總共26頁(yè)。細(xì)胞核過(guò)染，核膜、核仁等不清晰，細(xì)胞質(zhì)(尤其是皮膚上皮細(xì)胞)含有大量的細(xì)胞核染色液蘇木精，導(dǎo)致細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)比例失調(diào)。原因：與圖2相反，染色液時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、切片太厚、分化步驟時(shí)間太短。對(duì)策：如果切片不是因?yàn)樘瘢撋?、漂白、重新染色，?duì)于染色和分化時(shí)間做些適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。若太厚則需要重新切片。當(dāng)前21頁(yè)，總共26頁(yè)。切片細(xì)胞核棕色，表明蘇木精沒(méi)有充分藍(lán)化，或蘇木精過(guò)度氧化失去染色能力原因：蘇木精染色液過(guò)度氧化和切片在蘇木精染液染色后返藍(lán)不足。對(duì)策：染色前檢查蘇木精染色液的染色能力，過(guò)渡氧化，應(yīng)及時(shí)更換。其次，在蘇木精染色后，給切片以足夠的藍(lán)化時(shí)間。當(dāng)前22頁(yè)，總共26頁(yè)。染色后有雜質(zhì)原因：蘇木精染色液中的金屬膜，黏附在玻片上。對(duì)策：每天染色前仔細(xì)過(guò)濾蘇木精染色液，或建議使用半氧化蘇木精染色液。當(dāng)前23頁(yè)，總共26頁(yè)。伊紅著色切片中央?yún)^(qū)域伊紅染色不均勻，可能為弱堿性溶液殘留導(dǎo)致伊紅拒染所致原因：伊紅染液的pH值可能大于5；也可能是藍(lán)化液殘留過(guò)多；切片太?。换蚯衅?jīng)伊紅染色后在乙醇脫水時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。對(duì)策：檢查伊紅染液的pH值，用乙酸將其調(diào)節(jié)在4.6-5.0之間，使伊紅染色色彩艷麗。確保每次藍(lán)化后，用自來(lái)水沖干凈。檢查切片的厚度。脫水時(shí)不要讓切片在低濃度乙醇停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，因?yàn)楹嗟牡蜐舛纫掖紩?huì)將伊紅的顏色分化掉。當(dāng)前24頁(yè)，總共26頁(yè)。原因：伊紅染色液濃度太高；切片在伊紅染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；切片在伊紅染色后經(jīng)乙醇脫水步驟時(shí)過(guò)的太快，而使乙醇分化伊紅的作用不能產(chǎn)生。對(duì)策：適當(dāng)稀釋伊紅染色液，減少伊紅染色時(shí)間，或者使切片在乙醇脫水等步驟時(shí)，停留時(shí)間相對(duì)均勻。同樣，也要檢查切片的厚度是否合適。伊紅深染導(dǎo)致細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)沒(méi)有層次，缺乏對(duì)比當(dāng)前2