培養(yǎng)條件對(duì)發(fā)酵的影響

培養(yǎng)條件對(duì)發(fā)酵的影響第1頁(yè)/共95頁(yè)4.1.1培養(yǎng)基成分

(Mediumproposition)培養(yǎng)基定義：微生物生長(zhǎng)繁殖和生物合成各種代謝產(chǎn)物所需要的按一定比例配制的多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基的重要性：微生物的生長(zhǎng)；產(chǎn)物的合成；工藝路線(xiàn)及工藝設(shè)備的選擇；產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量；影響生產(chǎn)成本；第2頁(yè)/共95頁(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(composition)碳源：糖類(lèi)、脂肪、某些有機(jī)酸、醇或碳?xì)浠衔?。氮源：花生餅粉、黃豆餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、魚(yú)粉、蠶蛹粉、尿素、廢菌絲體和酒糟等。常用的無(wú)機(jī)氮源有氨水、硫酸銨、氯化銨、硝酸鹽等。無(wú)機(jī)鹽類(lèi)：鎂、硫、磷、鐵、鉀、鈣、鈉、氯、鋅、鈷、錳等生長(zhǎng)因子(growthfactors)：維生素，如生物素，前體物(precursors)：被菌體直接用于藥物合成而自身結(jié)構(gòu)無(wú)顯著改變的物質(zhì)稱(chēng)為前體。第3頁(yè)/共95頁(yè)（1）碳源(Carbonsource)

碳源是組成培養(yǎng)基的主要成分之一。碳源的主要作用：供給菌種生命活動(dòng)所需要的能量；構(gòu)成菌體細(xì)胞成分；用于合成代謝產(chǎn)物；碳源的其它作用：客觀上也是調(diào)節(jié)維持pH的成分。調(diào)節(jié)滲透壓。第4頁(yè)/共95頁(yè)碳源如何影響pH微生物利用糖份作碳源時(shí)，如果供氧不足，造成有機(jī)酸積累。pH下降。微生物利用脂肪作碳源時(shí)，需要更多的氧，如果供氧不足，造成有機(jī)酸積累。如果醋酸鈉作為碳源，引起pH上升。CH3COONa+2O2?2CO2+H2O+NaOH第5頁(yè)/共95頁(yè)糖類(lèi)葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖和淀粉等是藥物發(fā)酵生產(chǎn)中常用的碳源。發(fā)酵過(guò)程中過(guò)多的葡萄糖會(huì)加速菌體的呼吸，如果此時(shí)通風(fēng)不足，致使培養(yǎng)基中溶解氧不能滿(mǎn)足菌體的需要，會(huì)使一些酸性中間代謝物如乳酸、丙酮酸、乙酸等積累，使培養(yǎng)基pH降低，從而抑制微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成。細(xì)菌，酵母菌一般都只能利用簡(jiǎn)單的單糖。淀粉是霉菌和放線(xiàn)菌容易利用的碳源。第6頁(yè)/共95頁(yè)淀粉(Starch)淀粉分玉米淀粉、甘薯淀粉、土豆淀粉和小麥淀粉等；價(jià)格比較低廉，來(lái)源也較豐富；微生物需有淀粉水解酶方可直接利用淀粉；大多數(shù)霉菌可直接利用碳源?？衫盟庵铺枪に噷⒌矸坜D(zhuǎn)化為糖類(lèi)，供細(xì)菌酵母菌利用。第7頁(yè)/共95頁(yè)淀粉水解(hydrolase)工藝酸水解：酸-酶法：雙酶法：高溫淀粉酶，糖化酶。雙酶法制糖主要過(guò)程：玉米淀粉原料出發(fā)，經(jīng)配料，糊化，液化和糖化，脫色過(guò)濾，制備成淀粉水解糖。第8頁(yè)/共95頁(yè)酶法(Enzymatic)制糖糊化：淀粉乳加熱，淀粉顆粒膨脹，晶體結(jié)構(gòu)消失，變成糊狀液體，淀粉不再沉淀。液化：利用淀粉酶(amylase)使糊化淀粉水解到一定的糊精和低聚糖程度，粘度大大降低，流動(dòng)性增加。糖化：（C6H10O5）n+nH2O=nC6H12O6

淀粉(glucoamylase)水

162181801000X=第9頁(yè)/共95頁(yè)

DE值:用DE值表示淀粉水解的程度或糖化程度。糖化液中還原性糖以葡萄糖計(jì)，占干物質(zhì)的百分比稱(chēng)為DE值。

DE值計(jì)算：

DE=

還原糖濃度（C2）×100%

干物質(zhì)濃度（W1）×糖液比重（d）還原糖用裴林氏法等法測(cè)定，濃度表示：葡萄糖g/100ml糖液；干物質(zhì)用阿貝折光儀測(cè)定，濃度表示：干物質(zhì)g/100g糖液。第10頁(yè)/共95頁(yè)淀粉糖制備(酸化法）1.調(diào)粉。在調(diào)粉桶內(nèi)先加部分水（可使用離交或?yàn)V機(jī)洗水），在攪拌情況下加入淀粉原料，投料完畢，繼續(xù)加水使淀粉乳達(dá)到規(guī)定濃度（40%），然后加入鹽酸調(diào)節(jié)至規(guī)定pH值。

2.糖化。調(diào)好的淀粉乳，用耐酸泵送入糖化罐，進(jìn)料完畢打開(kāi)蒸氣閥升壓力至2.8kg/cm2左右，保持該壓力3～5min。取樣，用20%碘液檢查糖化終點(diǎn)。糖化液遇碘呈醬紅色即可放料中和。第11頁(yè)/共95頁(yè)3中和。糖化液轉(zhuǎn)入中和桶進(jìn)行中和，開(kāi)始攪拌時(shí)加入定量廢炭作助濾劑，逐步加入10%碳酸鈉溶液中和，要掌握混和均勻，達(dá)到所需的pH值后，打開(kāi)出料閥，用泵將糖液送入過(guò)濾機(jī)。濾出的清糖液隨即送至冷卻塔，冷卻后糖液進(jìn)行脫色。

4．脫色。清糖液放入脫色桶內(nèi)，加入定量活性炭隨加隨拌，脫色攪拌時(shí)間不得少于5分鐘（指糖液放滿(mǎn)桶后），然后再送至過(guò)濾機(jī)，濾出清液盛放在貯桶內(nèi)備用。

5．離子交換。將第一次脫色濾清液送至離子交換濾床進(jìn)行脫鹽、提純及脫色。糖液通過(guò)陽(yáng)-陰-陽(yáng)-陰4個(gè)樹(shù)脂濾床后，在貯糖桶內(nèi)調(diào)整pH值至3.8～4.2。

第12頁(yè)/共95頁(yè)6．第一次蒸發(fā)。離子交換后，準(zhǔn)確調(diào)好pH值的糖液，利用泵送至蒸發(fā)罐，保持真空度在500毫米汞柱以上，加熱蒸氣壓力不得超過(guò)1公斤/厘米2，控制蒸發(fā)濃縮的中轉(zhuǎn)化糖漿濃度在42～50%左右?？沙隽线M(jìn)行第二次脫色。

7．二次脫色過(guò)濾。經(jīng)第一次蒸發(fā)后的中轉(zhuǎn)化糖漿送至脫色桶，再加入定量新鮮活性炭，操作與第一次脫色相同。二次脫色糖漿必須反復(fù)回流過(guò)濾至無(wú)活性炭微粒為止，方可保證質(zhì)量。然后將清透、無(wú)色的中轉(zhuǎn)化糖漿，送至貯糖桶。第13頁(yè)/共95頁(yè)8．第二次蒸發(fā)。該道操作基本上與第一次蒸發(fā)操作相同，只是第二次蒸發(fā)開(kāi)始后，加入適量亞硫酸氫鈉溶液（35波美度），能起到漂白而保護(hù)色澤的作用。蒸發(fā)至規(guī)定的濃度，即可放料至成品桶內(nèi)。

上述的工藝操作規(guī)程，主要指特、甲級(jí)成品而言，如生產(chǎn)乙級(jí)成品的操作工序，只要求一次脫色和一次蒸發(fā)，而且有些操作指標(biāo)也略有差異第14頁(yè)/共95頁(yè)雙酶法制糖工藝

1調(diào)漿配料槽；2，8過(guò)濾器；3，9，14，17，泵；4，10噴射加熱器；5緩沖器；6液化層流罐；7液態(tài)液貯槽；11滅菌罐；12板式換熱器；13糖化罐；15壓濾機(jī)；16糖化液貯槽；18糖液貯槽第15頁(yè)/共95頁(yè)雙酶法制備玉米粉水解糖液的

優(yōu)化工藝液化酶用量55μl/100g玉米粉(1100U/100g玉米粉)；液化時(shí)間89min；糖化酶的量400;μl/100g玉米粉(20000U/100g玉米粉)；糖化時(shí)間284min；淀粉轉(zhuǎn)化率可達(dá)到93.95%.第16頁(yè)/共95頁(yè)氮源(Nitrogensource)氮源的主要功能：構(gòu)成微生物細(xì)胞物質(zhì)含氮代謝物的原料；發(fā)酵液pH調(diào)節(jié)：在發(fā)酵罐中通入氨可起到雙重作用。第17頁(yè)/共95頁(yè)有機(jī)氮源(organicnitrogensources)有機(jī)氮源除含有豐富的蛋白質(zhì)、多肽和游離氨基酸外，往往還含有少量的糖類(lèi)、脂肪、無(wú)機(jī)鹽、維生素及其某些生長(zhǎng)因子。因而微生物在含有機(jī)氮源的培養(yǎng)基中常表現(xiàn)出生長(zhǎng)旺盛、菌體濃度增長(zhǎng)迅速的特點(diǎn)，微生物在有機(jī)氮源培養(yǎng)基中，可直接利用氨基酸和其它有機(jī)氮化合物中的各種不同結(jié)構(gòu)的碳架，來(lái)合成生命所需要的蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞物質(zhì)，而無(wú)需從糖代謝的分解產(chǎn)物來(lái)合成所需的物質(zhì)。第18頁(yè)/共95頁(yè)微生物對(duì)氨基酸利用的選擇性氮源直接作為藥物的前提物。某些氨基酸作為合成肽類(lèi)抗生素的前體物質(zhì)。螺旋霉素發(fā)酵中，發(fā)酵培養(yǎng)基里加入L-色氨酸可使螺旋霉素的產(chǎn)量顯著提高，但加入L-賴(lài)氨酸會(huì)完全抑制螺旋霉素的生物合成。纈氨酸、半胱氨酸和α－氨基己二酸等就是合成青霉素和頭孢菌素的主要前體；第19頁(yè)/共95頁(yè)蛋白胨（Peptone）最常用的氮源，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。用于蛋白胨生產(chǎn)的蛋白包括動(dòng)物蛋白（酪蛋白、肉類(lèi)）和植物蛋白（豆類(lèi)）兩種。蛋白質(zhì)經(jīng)水解降解生成的多肽，二肽及復(fù)合氨基酸物。具有蛋白質(zhì)的通性。

1.色澤：白色粉末或淺黃色粉末2.總氮量：14.5%以上3.水份≤5%4.灰份：5%以下5.總磷量≤0.2%6.氯化物≤5%7.pH值：5-7

。第20頁(yè)/共95頁(yè)牛肉膏(BeefExtract)采用新鮮牛肉經(jīng)過(guò)剔除脂肪、消化、過(guò)濾、濃縮而得到的一種棕黃色至棕褐色的膏狀物。有牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黃色。牛肉膏當(dāng)中含有肌酸、肌酸酐、多肽類(lèi)、氨基酸類(lèi)、核苷酸類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、礦物質(zhì)類(lèi)及維生素類(lèi)的水溶性物質(zhì)。該產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于生物制藥發(fā)酵及各種培養(yǎng)基的制備。第21頁(yè)/共95頁(yè)酵母浸提物酵母粉(YeastExtractpowder)[酵母浸粉]采用新鮮酵母經(jīng)酵母自溶、過(guò)濾、濃縮、噴霧干燥而得到的一種淺黃色至類(lèi)白色干燥粉末。有酵母自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黃色。極具吸濕性，酵母粉含有氨基酸類(lèi)、肽類(lèi)、水溶性維生素、及酵母多糖、酵母核酸組成的一種混合物，含有豐富的B族維生素和各種氨基酸。核苷酸類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、礦物質(zhì)類(lèi)及維生素類(lèi)的水溶性物質(zhì)。一般的用量為0.2%～0.5%。酵母膏(YeastExtract)[酵母浸膏]采用新鮮酵母經(jīng)酵母自溶、過(guò)濾、濃縮而得到的一種棕黃色至棕褐色的膏狀物。有酵母自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黃色至淺棕色。含氨基酸類(lèi)、肽類(lèi)、水溶性維生素、及酵母多糖、酵母核酸組成的一種混合物，含有豐富的B族維生素和各種氨基酸。核苷酸類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、礦物質(zhì)類(lèi)及維生素類(lèi)的水溶性物質(zhì)。一般的用量為0.2%～0.5%。第22頁(yè)/共95頁(yè)黃豆粉（soybeanmeal)黃豆粉是發(fā)酵生產(chǎn)中常用的有機(jī)氮源。根據(jù)油脂含量可將其分為三類(lèi)：全脂黃豆粉(含油脂18%)，低脂黃豆粉(含油脂9%)，脫脂黃豆粉(含油脂2%)。低溫提取油脂后加工制備；高溫提取油脂后加工制備。酶解大豆水解液的應(yīng)用及優(yōu)點(diǎn)。棉籽餅粕，花生粕也是應(yīng)用較廣泛的有機(jī)氮源。第23頁(yè)/共95頁(yè)玉米漿(CornSteepLiquor，簡(jiǎn)稱(chēng)CSL)玉米漿是用亞硫酸浸泡玉米的水經(jīng)過(guò)濃縮加工制成的，呈鮮黃到暗褐色、濃稠不透明的絮狀懸浮物，約含50%干物質(zhì)；玉米漿中含有較豐富的玉米可溶性蛋白，很容易被微生物利用。富含維生素。由于玉米的來(lái)源，不同加工條件各異，因此，玉米漿的成分常有較大波動(dòng)，在使用時(shí)應(yīng)注意適當(dāng)調(diào)配。玉米漿粉的應(yīng)用。第24頁(yè)/共95頁(yè)無(wú)機(jī)氮源(inorganicNsource)

多種放線(xiàn)菌、霉菌或細(xì)菌都能利用各種無(wú)機(jī)氮源為主要或輔助氮源，常用的有硫酸銨、硝酸銨等。銨鹽中的銨氮可以直接被菌體利用來(lái)合成細(xì)胞中的含氮物質(zhì)，硝基氮必須先還原成氨后，才能被利用，所以銨鹽的利用比硝基快。第25頁(yè)/共95頁(yè)無(wú)機(jī)氮源的生理酸或生理堿物質(zhì)生理酸性物質(zhì)：如硫酸銨（NH4）2SO4?2NH3+H2SO4生理堿性物質(zhì)，如硝酸鹽NaNO3+4H2?NH3+2H2O+NaOH第26頁(yè)/共95頁(yè)無(wú)機(jī)鹽及微量元素磷酸鹽:核蛋白等重要細(xì)胞物質(zhì)的組成部分，許多輻酶(或輻基)、高能磷酸鍵的組成部分磷在菌體生長(zhǎng)、繁殖和代謝活動(dòng)中起著極其重要的作用，磷還可以防止青霉素的破壞，過(guò)量的磷酸鹽對(duì)某些抗生素合成產(chǎn)生抑制作用。培養(yǎng)基中鈣鹽過(guò)多時(shí)，會(huì)形成磷酸鈣沉淀，降低培養(yǎng)基中可溶性磷的含量，當(dāng)培養(yǎng)基中磷和鈣均要求較高濃度時(shí)，可將兩者分別消毒或逐步補(bǔ)加。第27頁(yè)/共95頁(yè)硫和鐵硫也是菌體細(xì)胞蛋白質(zhì)的組成部分。它參與合成含硫氨基酸的元素，也是某些抗生素分子中的組成元素。含硫的氨基酸，如甲硫氨酸是甲基供體。鐵是菌體細(xì)胞色素、細(xì)胞色素氧化酶和過(guò)氧化物酶的組成元素，是菌體生命活動(dòng)必須的元素之一。第28頁(yè)/共95頁(yè)微量金屬無(wú)素鋅、鎂、鈷等離子是某些酶的輔基或激活劑。微量的鋅對(duì)青霉素發(fā)酵有促進(jìn)作用，但過(guò)量時(shí)對(duì)青霉素有破壞作用。鎂離子除了有激活一些酶的作用外，還可提高抗生素生產(chǎn)菌對(duì)自己所產(chǎn)抗生素的耐性。鈷離子也能激活一些酶，又是維生素B12的組成元素，發(fā)酵中加入一定量的鈷鹽，能使維生素B12的產(chǎn)量提高數(shù)倍。第29頁(yè)/共95頁(yè)前體物(precursors)前體物以整體結(jié)構(gòu)加入到新合成的物質(zhì)中。在培養(yǎng)基中加入前體物可大大提高產(chǎn)物的濃度。如何尋找到合適的前體物是培養(yǎng)基配方研究的重點(diǎn)。青霉素的前體物質(zhì)是苯乙酸及有關(guān)衍生物；金霉素的前體物質(zhì)是氯化物；維生素B12的前體物是鈷化物；胡蘿卜素的前體物是β-紫羅蘭酮，等等第30頁(yè)/共95頁(yè)促進(jìn)劑促進(jìn)劑是指哪些既不是營(yíng)養(yǎng)物又不是前體，但能提高產(chǎn)物產(chǎn)量的添加劑。加入巴比妥鹽能使利福霉素單位增加，并能使鏈霉菌推遲自溶，延長(zhǎng)分泌期第31頁(yè)/共95頁(yè)抑制劑（inhibitor)加入抑制劑會(huì)抑制某些代謝途徑的進(jìn)行，同時(shí)會(huì)使另一代謝途徑活躍，從而獲得人們所需要的某種產(chǎn)物或使正常代謝的某一代謝中間物積累起來(lái)。四環(huán)素發(fā)酵中，加入溴化劑(NaBr)能抑制金霉素形成的代謝途徑，促進(jìn)四環(huán)素的生成。第32頁(yè)/共95頁(yè)水在液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，水的比例最大。水源：自來(lái)水，深井水，河水，不同地區(qū)的水源；水質(zhì)：主要是水中的雜質(zhì)，尤其是微量元素的含量。自來(lái)水管中的鐵銹往往在不同時(shí)間含量不同。一般在早班時(shí)含量最高。第33頁(yè)/共95頁(yè)增加細(xì)胞通透性的物質(zhì)表面活性劑：吐溫-80；曲拉通TolueneTritonX-100Span-20但需注意是否殘留在產(chǎn)品中，是否符合藥品安全第34頁(yè)/共95頁(yè)4.1.2培養(yǎng)基的種類(lèi)培養(yǎng)基的種類(lèi)與選擇培養(yǎng)基的類(lèi)型：按培養(yǎng)基組成物質(zhì)的純度，分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基(復(fù)合培養(yǎng)基)。按培養(yǎng)基的狀態(tài)，培養(yǎng)基可分為固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。依據(jù)在生產(chǎn)中的用途(或作用)，可將生產(chǎn)上應(yīng)用培養(yǎng)基分為孢子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和生產(chǎn)培養(yǎng)基。第35頁(yè)/共95頁(yè)(1)孢子(spore)培養(yǎng)基孢子培養(yǎng)基是供菌種繁殖孢子的一種常用固體培養(yǎng)基，對(duì)這種培養(yǎng)基的要求是能夠使菌體迅速生長(zhǎng)，產(chǎn)生較多優(yōu)質(zhì)的孢子，并要求這種培養(yǎng)基不易引起菌種發(fā)生變異。孢子培養(yǎng)基的基本配制要求：營(yíng)養(yǎng)不要太豐富(有機(jī)氮源)，否則不易產(chǎn)生孢子；如土豆葡萄糖培養(yǎng)基(PD).所用無(wú)機(jī)鹽的濃度要適量，否則會(huì)影響孢子量和孢子顏色；要注意孢子培養(yǎng)基的pH和濕度。生產(chǎn)中常用的孢子培養(yǎng)基有麩皮培養(yǎng)基，大(小)米培養(yǎng)基，由葡萄糖(或淀粉)、無(wú)機(jī)鹽、蛋白胨等配制的瓊脂斜面培養(yǎng)基第36頁(yè)/共95頁(yè)(2)種子(seed)培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基是供孢子發(fā)芽和菌種生長(zhǎng)繁殖用的。營(yíng)養(yǎng)成分應(yīng)是易被菌體吸收利用的，同時(shí)要比較豐富與完全，其中氮源和維生素的含量要高些，但總濃度以略稀薄為宜以便菌體的生長(zhǎng)繁殖。種子培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分是易于吸收的碳源和氮源，如葡萄糖、硫酸銨、尿素、玉米漿、酵母膏和蛋白胨等。種子質(zhì)量的好壞對(duì)發(fā)酵的影響很大，為了使培養(yǎng)的種子能夠滿(mǎn)足發(fā)酵的要求，必須將種子培養(yǎng)基和發(fā)酵的要求聯(lián)系起來(lái)考慮。最后一級(jí)種子培養(yǎng)基的成分應(yīng)接近發(fā)酵培養(yǎng)基，可使種子進(jìn)入發(fā)酵培養(yǎng)基后能迅速適應(yīng)，快速生長(zhǎng)。第37頁(yè)/共95頁(yè)(3)發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基是供菌種生長(zhǎng)、繁殖和合成產(chǎn)物之用。它既要使種子接種后迅速生長(zhǎng)，達(dá)到一定的菌體濃度，又要使長(zhǎng)好的菌體能迅速合成所需產(chǎn)物。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成除有菌體生長(zhǎng)所必需的元素和化合物外，還要有產(chǎn)物所需的特定元素、前體和促進(jìn)劑等。但如果生長(zhǎng)和生物合成產(chǎn)物需要的總的碳源、氮源、磷源等的濃度太高，或生長(zhǎng)和合成兩階段各需的最適條件不同時(shí)，還應(yīng)考慮補(bǔ)加培養(yǎng)基來(lái)滿(mǎn)足發(fā)酵工藝的要求第38頁(yè)/共95頁(yè)4.1.3培養(yǎng)基的優(yōu)化培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的原理：根據(jù)微生物的性質(zhì)選取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的種類(lèi)；培養(yǎng)基的組分（來(lái)源和加工方法）；配比；緩沖能力，粘度，消毒是否徹底，是否破壞？原料中是否有不良雜質(zhì)。注意快速利用的碳(氮)源和慢速利用的碳(氮)源的相互配合,發(fā)揮各自的優(yōu)勢(shì),避其所短。要注意生理酸、堿性鹽和pH緩沖劑的加入和搭配。第39頁(yè)/共95頁(yè)碳氮比選用適當(dāng)?shù)奶嫉?。培養(yǎng)基中的碳氮比的影響十分明顯。氮源過(guò)多，會(huì)使菌體生長(zhǎng)過(guò)于旺盛，pH偏高，不利于代謝產(chǎn)物的積累；氮源不足，則菌體繁殖量少，從而影響產(chǎn)量。碳源過(guò)多，則容易形成較低的pH，若氮源不足，易引起菌體衰老和自溶。從碳氮元素分析來(lái)看，酵母菌細(xì)胞中碳氮比約為100:20；霉菌約為100:10；一般工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮比約為100:0.2-2.0（思考：為何低得多）。第40頁(yè)/共95頁(yè)碳氮比如何計(jì)算？含碳化合物與含氮化合物：C/N比。重量比,摩爾比。含碳原料中C含量的計(jì)算：含N原料，氨基酸中的N計(jì)算：蛋白質(zhì)的原料（豆餅粉等）中N的計(jì)算：要根據(jù)粗蛋白質(zhì)的含量，折算成N含量。含N原料中，如有C的含量，也應(yīng)計(jì)入C源總量。第41頁(yè)/共95頁(yè)培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法一般采用搖瓶，小型發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)；先進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，最后再進(jìn)行綜合實(shí)驗(yàn)。在選擇培養(yǎng)基中使用的最適原材料種類(lèi)和濃度配比時(shí)，經(jīng)常采用的方法有單因子實(shí)驗(yàn)法、正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)等。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)或均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)等方法，可大大加快試驗(yàn)進(jìn)程。第42頁(yè)/共95頁(yè)4.1.4影響培養(yǎng)基質(zhì)量的因素原材料質(zhì)量的影響水質(zhì)的影響滅菌操作的影響糖類(lèi)在高溫條件下易被破壞，特別是還原糖與氨基酸、肽類(lèi)或蛋白質(zhì)等有機(jī)氮源一起加熱時(shí)，更容易產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，形成5-甲基糠醛和鬃色的類(lèi)黑精。為避免糖類(lèi)與其它成分在滅菌過(guò)程中相互接觸，在生產(chǎn)中有時(shí)將糖和其它成分分別滅菌，第43頁(yè)/共95頁(yè)其他因素的影響

培養(yǎng)基的pH:pH對(duì)菌體的生物代謝有較大的影響。在工業(yè)上，通過(guò)改變培養(yǎng)基成分的配比，使在發(fā)酵過(guò)程中的pH變化適合菌種代謝的要求，或者直接加酸或堿調(diào)節(jié)。培養(yǎng)基粘度：特別是用如淀粉、黃豆餅粉、花生餅粉等，所配制的培養(yǎng)基比較稠厚，對(duì)空氣的利用、染菌率的控制以及各項(xiàng)參數(shù)的自控都不利，對(duì)提取精制也有影響。第44頁(yè)/共95頁(yè)4.2菌種擴(kuò)大培養(yǎng)種子的概念3.4.1實(shí)驗(yàn)室種子培養(yǎng)3.4.2生產(chǎn)車(chē)間種子培養(yǎng)3.4.3接種齡與接種量3.4.4影響種子質(zhì)量的因素3.4.5種子質(zhì)量的控制措施第45頁(yè)/共95頁(yè)保存菌種的種類(lèi)菌種的保存方式：斜面菌；砂土管，低溫保存，冷凍干燥管，液氮保存；孢子懸浮液，液體種子，固體種；菌種的活化：尤其是冷藏法保存的菌種需先培養(yǎng)一定時(shí)間再移接若干代。第46頁(yè)/共95頁(yè)菌種低溫保藏設(shè)備超低溫冰箱（-85℃）和液氮瓶（-195℃）：一般植物或微生物種子保存用超低溫冰箱較多。-85℃冰箱，要選擇質(zhì)量好的，尤其是冰箱壓縮機(jī)的性能是最主要的指標(biāo)。冰箱所在地的電源應(yīng)有保證。以防斷電時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)引起菌種的衰退。電壓穩(wěn)定（故需要配穩(wěn)壓電源）。第47頁(yè)/共95頁(yè)冷凍菌種的復(fù)活將冷凍或液氮保藏的菌種取出，迅速放入37℃水浴中解凍。一般需2~2.5min，等完全解凍后，用無(wú)菌吸管，在安瓿管內(nèi)注入0.3-0.5ml的無(wú)菌生理鹽水或1%麥芽汁等適宜的液體培養(yǎng)基，輕輕振蕩，使凍于菌體溶解呈懸浮狀。取0.1～0.2ml菌體懸浮液，移植于適宜的瓊脂斜面／平板培養(yǎng)基上，剩余的菌液，注入適宜的液體培養(yǎng)基內(nèi)，然后在建議的溫度下培養(yǎng)。第48頁(yè)/共95頁(yè)菌種擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程保存菌種（斜面種，沙土管，凍干管）↓斜面種子（活化，培養(yǎng)）↓搖瓶，茄子瓶斜面，固體培養(yǎng)基↓種子罐（一級(jí)，二級(jí)，三級(jí)或四級(jí)）第49頁(yè)/共95頁(yè)4.2.1實(shí)驗(yàn)室種子培養(yǎng)對(duì)于細(xì)菌類(lèi)種子，一般采用從斜面移接到三角搖瓶；對(duì)于產(chǎn)孢子的菌種，可采用砂土管孢子，或冷凍管孢子等，接入固態(tài)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)大量孢子；對(duì)于不產(chǎn)孢子的放線(xiàn)菌或霉菌，也可在茄子瓶中大量培養(yǎng)菌絲體，或搖瓶培養(yǎng)。第50頁(yè)/共95頁(yè)孢子濃度與OD值的關(guān)系：由于測(cè)定OD值比孢子數(shù)的測(cè)定更為簡(jiǎn)單，而孢子數(shù)與OD值存在一定的線(xiàn)性關(guān)系，故經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)，可確定兩者之間的關(guān)系。計(jì)算公式Y(jié)=80.79045X+3.61871（3-27）式中Y—孢子濃度，個(gè)/mL；X—OD750。第51頁(yè)/共95頁(yè)4.2.2生產(chǎn)車(chē)間種子培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的菌懸液或菌絲體種子接入種子罐，一般采用壓差法。孢子懸浮液一般采用微濾法。注意罐壓應(yīng)高于氣壓。逐級(jí)擴(kuò)大的種子罐；種子罐級(jí)數(shù)的確定：依據(jù)菌種特性，孢子發(fā)芽數(shù)量，菌種繁殖速度，發(fā)酵罐容積等。一般細(xì)菌類(lèi)，可采用一級(jí)種子；生長(zhǎng)慢的菌種，采用二級(jí)種子（發(fā)芽罐和繁殖罐二級(jí)）；第52頁(yè)/共95頁(yè)淺盤(pán)式種曲培養(yǎng)機(jī)該種曲機(jī)分為兩部分：培養(yǎng)室和附屬裝置。培養(yǎng)室是一個(gè)臥式的夾套式壓力容器。培養(yǎng)室內(nèi)有小車(chē)，車(chē)內(nèi)放置10~20個(gè)培養(yǎng)盤(pán)。曲料放在培養(yǎng)盤(pán)內(nèi)。培養(yǎng)室內(nèi)還設(shè)有循環(huán)室內(nèi)空氣用的風(fēng)扇、種曲流向分配盤(pán)和加濕霧化器等。附屬裝置包括種曲供給裝置（二級(jí)種曲貯罐、無(wú)菌壓縮空氣供給裝置）、空氣供給裝置（空壓機(jī)、壓縮空氣貯罐、過(guò)濾器和滅菌裝置）、真空吸引裝置（水力噴射器，用于培養(yǎng)室內(nèi)物料降溫）、溫度調(diào)節(jié)裝置（控溫臺(tái)、溫冷水調(diào)溫裝置和加濕裝置）。第53頁(yè)/共95頁(yè)種曲培養(yǎng)機(jī)第54頁(yè)/共95頁(yè)4.2.3接種齡與接種量接種齡：以菌種處于旺盛的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且菌體量未達(dá)到最高峰時(shí)為宜；過(guò)于年輕的種子，造成前期生長(zhǎng)慢，發(fā)酵周期長(zhǎng)的后果；年老的種子，生產(chǎn)能力下降，菌絲過(guò)早衰老。接種量：種子液體積與接種后培養(yǎng)液體積之比。決定于菌種的繁殖速度。接種量一般為5-15%。接種量多：縮短時(shí)間，產(chǎn)物提前合成；但太多，則影響產(chǎn)物合成。易形成菌絲球。第55頁(yè)/共95頁(yè)4.2.4影響種子質(zhì)量的因素原材料的質(zhì)量；原材料的產(chǎn)地，同一產(chǎn)地不同批次質(zhì)量的波動(dòng)；培養(yǎng)條件：pH，溫度，濕度，通氣等。斜面的冷藏時(shí)間。如何判斷種子的質(zhì)量：pH，培養(yǎng)基中磷，氮，氨基酸含量，菌絲形態(tài)，濃度，培養(yǎng)液外觀，酶活。第56頁(yè)/共95頁(yè)4.2.5種子質(zhì)量的控制措施菌種培養(yǎng)人員的素質(zhì)和責(zé)任心；菌種觀察及選擇（菌絲形態(tài)整齊，孢子豐滿(mǎn)）。菌種穩(wěn)定性定期檢查的必要性；經(jīng)常性的搖瓶實(shí)驗(yàn)確定其生產(chǎn)性能。無(wú)菌檢查。第57頁(yè)/共95頁(yè)4.3培養(yǎng)基滅菌4.3.1概述4.3.2培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌4.3.3空氣除菌第58頁(yè)/共95頁(yè)4.3.1概述4.3.1.1滅菌操作的重要性滅菌是指用化學(xué)的或物理學(xué)的方法殺滅或除掉物料或設(shè)備中所有有生命的有機(jī)體的技術(shù)或工藝過(guò)程。工業(yè)發(fā)酵法藥物生成多為需氧的純種發(fā)酵過(guò)程，因此與生產(chǎn)相關(guān)的原材料、設(shè)備等均需徹底除菌，這是防止發(fā)酵過(guò)程染菌、確保正常生產(chǎn)的關(guān)鍵。第59頁(yè)/共95頁(yè)4.3.1.2滅菌方法火焰滅菌:接種針,玻璃棒,三角瓶口.干熱滅菌:160度,1小時(shí).用于滅菌后需保持干燥的物品.電熱法或紅外線(xiàn).濕熱滅菌:培養(yǎng)基等.射線(xiàn)滅菌:紫外(工作場(chǎng)所),γ射線(xiàn)(干料).化學(xué)試劑滅菌:工作場(chǎng)所.高壓靜電滅菌:空氣.介質(zhì)過(guò)濾除菌:空氣.第60頁(yè)/共95頁(yè)化學(xué)試劑滅菌0.1-0.25%高錳酸鉀:皮膚滅菌;2-5%漂白粉:用具和車(chē)間環(huán)境消毒;75%酒精:皮膚和玻璃器皿表面;0.25%新潔爾滅溶液:皮膚和玻璃器皿表面;環(huán)境消毒.0.5%甲醛:6-12小時(shí)可殺滅所有芽孢細(xì)菌,可用于無(wú)菌室,搖瓶間,空罐,車(chē)間和熏蒸滅菌5%石炭酸或1%來(lái)蘇爾:器械或無(wú)菌室,車(chē)間環(huán)境第61頁(yè)/共95頁(yè)4.3.2培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌濕熱滅菌法：對(duì)培養(yǎng)基和設(shè)備的滅菌,以濕熱法為佳。效率高,經(jīng)濟(jì)實(shí)用.濕蒸汽穿透力強(qiáng),濕熱使蛋白質(zhì)凝固,使微生物致死.常用用于培養(yǎng)基的滅菌.主要參數(shù):滅菌溫度，時(shí)間和壓力.常用:121度,20-30min.培養(yǎng)基滅菌過(guò)程中，在殺菌的同時(shí)，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分受破壞。故應(yīng)同時(shí)兼顧。應(yīng)選擇恰當(dāng)?shù)臏缇鷹l件。第62頁(yè)/共95頁(yè)滅菌方式空罐滅菌(空消)：實(shí)罐滅菌(實(shí)消)：種子罐，發(fā)酵罐，計(jì)量罐，補(bǔ)料罐等。間歇或連續(xù)滅菌(連消)管道滅菌等過(guò)濾器除菌固態(tài)培養(yǎng)基的滅菌：蒸煮第63頁(yè)/共95頁(yè)（1）加熱滅菌原理微生物的熱阻：加熱滅菌原理：熱凝固微生物蛋白質(zhì)。不可逆變性一般營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，60度，10min（巴氏法），死亡。細(xì)菌芽孢：100度，致死需數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)。嗜熱菌，120度，20-30min死亡。致死溫度：殺死微生物的極限溫度。致死時(shí)間：在致死溫度下，殺死全部微生物所需時(shí)間在致死溫度以上，溫度越高，致死時(shí)間越短。熱阻：微生物在某一條件下的致死時(shí)間。第64頁(yè)/共95頁(yè)微生物對(duì)各種滅菌劑的相對(duì)熱阻滅菌方式大腸桿菌細(xì)菌芽孢霉菌孢子噬菌體干熱110002~101濕熱1300萬(wàn)2~101~5酚11億1~230甲醛12502~102紫外線(xiàn)12~55~105~10第65頁(yè)/共95頁(yè)微生物的熱死規(guī)律--對(duì)數(shù)殘留定律：在一定溫度下，微生物熱死遵循分子反應(yīng)速度理論，菌的死亡速率-dN/dt與任何一瞬間殘存的活菌數(shù)成正比。-dN/dt=KN故：滅菌時(shí)間t=Log(N0/Nt)2.303/K

K:反應(yīng)速率常數(shù)（1/min),K值越小，微生物越耐熱。故殺菌時(shí)間t越長(zhǎng)。Nt：微生物殘留數(shù)。Nt為0的條件是時(shí)間無(wú)限長(zhǎng)。故一般取Nt=0.001。第66頁(yè)/共95頁(yè)通常細(xì)菌芽孢的K=1（1/min）；枯草芽孢桿菌的K=3.8~2.6。而營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的K=10~1000億。滅菌要以能殺死細(xì)菌芽孢為準(zhǔn)。通常計(jì)算也不取最耐熱的芽孢菌。選用一般耐熱的用于計(jì)算足矣。微生物的殘留曲線(xiàn)（見(jiàn)下圖）：

以滅菌時(shí)間為橫坐標(biāo)，以微生物對(duì)數(shù)殘留Log(N0/Nt)（%）為縱坐標(biāo)，作圖，由此圖可求得K值。其斜率為-K值。第67頁(yè)/共95頁(yè)第68頁(yè)/共95頁(yè)嗜熱芽孢桿菌在不同溫度下的殘留曲線(xiàn)第69頁(yè)/共95頁(yè)微生物殺滅反應(yīng)速率常數(shù)K（1/min)K值可用Arrhenius方程表示：A：常數(shù)（1/min)；T：絕對(duì)溫度；R：氣體常數(shù)。E:反應(yīng)所需的活化能（Cal/mol)，活化能可以用于表示一個(gè)化學(xué)反應(yīng)發(fā)生所需要的最小能量。反應(yīng)的活化能通常表示為Ea，單位是千焦耳每摩爾。

E越小，K值越大。微生物越不耐熱。即被殺滅的速度越快。殺滅的時(shí)間就越短。K表示微生物耐熱性，隨微生物種類(lèi)和滅菌溫度而異。相同溫度下，K值越小，則微生物愈耐熱。同一微生物在不同滅菌溫度下，K值不同。T越高，K值越大；故提高滅菌溫度，可使K值增大，滅菌時(shí)間則可縮短。K=Ae–E/RT(min-1)第70頁(yè)/共95頁(yè)培養(yǎng)基成分破壞速率常數(shù)培養(yǎng)基滅菌同時(shí)，培養(yǎng)基成分受破壞。培養(yǎng)基成分受熱分解反應(yīng)和細(xì)菌死亡一樣都屬于一級(jí)反應(yīng)。也可用反應(yīng)速率常數(shù)表示其受破壞的程度。故培養(yǎng)基成分破壞速率常數(shù)k′也可用Arrhenius方程表示。-dC/dt=k′Cln(C/C0)=-k′tk′1=A′e–E′/RT(min-1)第71頁(yè)/共95頁(yè)菌體和營(yíng)養(yǎng)成分破壞速率常數(shù)的關(guān)系溫度為T(mén)1時(shí)，菌體和營(yíng)養(yǎng)成分的破壞速率常數(shù)溫度為T(mén)2時(shí)，菌體和營(yíng)養(yǎng)成分的破壞速率常數(shù)第72頁(yè)/共95頁(yè)速率常數(shù)之比：菌體營(yíng)養(yǎng)成分第73頁(yè)/共95頁(yè)當(dāng)滅菌溫度由T1提高到T2時(shí)。結(jié)論：當(dāng)溫度增高時(shí)，菌的死亡速率常數(shù)增大的倍數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于培養(yǎng)基成分破壞常數(shù)增加的倍數(shù)。故高溫短時(shí)滅菌具優(yōu)越性。第74頁(yè)/共95頁(yè)（2）影響培養(yǎng)基滅菌的其它因素培養(yǎng)基成分：油脂，糖類(lèi)及一定濃度的蛋白質(zhì)增加微生物的耐熱性。培養(yǎng)基pH：6~8之間，微生物最耐熱。pH小于6，氫離子易滲入細(xì)胞內(nèi)，pH越低，所需滅菌時(shí)間越短。培養(yǎng)基顆粒度：顆粒越小，越易滅菌。泡沫：培養(yǎng)基產(chǎn)泡沫對(duì)滅菌不利。對(duì)于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌難度更大：顆粒不均；塊狀；滅菌后的二次污染；水分含量偏低，熱容量小；三相共存，有空隙，熱傳遞阻力大。第75頁(yè)/共95頁(yè)（3）培養(yǎng)基滅菌的設(shè)計(jì)計(jì)算分批滅菌，當(dāng)溫度一定，加熱滅菌達(dá)到要求所需的時(shí)間可由下式求得：加熱時(shí)間：t=1/K(lnN0/Nt)=2.303/K(logN0/Nt)根據(jù)：

-dN/dt=KN=Ae–E/KTN積分后：殺菌效果：ln（N0/N）=A∫t0e

–E/KTdtK=Ae–E/RT(min-1)第76頁(yè)/共95頁(yè)t2t1t3第77頁(yè)/共95頁(yè)在大批量滅菌過(guò)程中，加熱（升溫）和冷卻（降溫）的時(shí)間較長(zhǎng)，應(yīng)考慮其滅菌效果。Δ升溫=ln（N0/N1）

=A∫t10e

–E/KTdtΔ維持=ln（N1/N2）=A∫t20e

–E/KTdtΔ降溫=ln（N2/N）=A∫t30e

–E/KTdt全部殺菌時(shí)間之殺菌效果為：Δ總=Δ加熱+Δ加熱+Δ冷卻=A（∫t10e

–E/KTdt+∫t20e

–E/KTdt+∫t30e

–E/KTdt）故維持時(shí)間t2：t2=1/K[(lnN0/N)-A∫t10e–E/KTdt-A∫t30e–E/KTdt]N0，N1，N2，N分別為在滅菌時(shí)間0，t1,t1+t2,t1+t2+t3的殘留菌數(shù)第78頁(yè)/共95頁(yè)滅菌計(jì)算舉例（溫度和時(shí)間和確定）間歇滅菌時(shí)間的計(jì)算(升溫到規(guī)定溫度后的保溫時(shí)間)：40m3培養(yǎng)基，121℃（滅菌速率常數(shù)K=1.8min-1），培養(yǎng)液污染程度：2×105個(gè)耐熱細(xì)菌芽孢，滅菌失敗概率0.001（即每滅菌1000批次，只允許有1個(gè)菌殘留），求滅菌時(shí)間。培養(yǎng)液中細(xì)菌總數(shù)N0=40×106×2×105=8×1012個(gè)滅菌后的菌數(shù)Nt=0.001個(gè)滅菌時(shí)間t=Log(N0/Nt)2.303/Kt=2.303/1.8[lg(8×1012/0.001)]=第79頁(yè)/共95頁(yè)培養(yǎng)基連續(xù)滅菌優(yōu)點(diǎn)：可用高溫短時(shí)間滅菌，營(yíng)養(yǎng)成分破壞少。發(fā)酵罐利用率高；蒸汽負(fù)荷?。豢勺詣?dòng)控制；勞動(dòng)強(qiáng)度低。常用板式熱交換器加熱。第80頁(yè)/共95頁(yè)第81頁(yè)/共95頁(yè)管道式連續(xù)超高溫滅菌

物料在連續(xù)流動(dòng)的狀態(tài)下通過(guò)套管式熱交換器加熱至138～150℃，并在這一溫度下保持一定的時(shí)間(2～4秒)以達(dá)到無(wú)菌水平，

第82頁(yè)/共95頁(yè)常見(jiàn)的滅菌條件-1種子罐、發(fā)酵罐、計(jì)量罐、補(bǔ)料罐等的空罐滅菌及管道滅菌條件：從各管道通通入蒸汽，使罐內(nèi)壓力0.147MPa，45min；滅菌時(shí)，從各閥門(mén)排出空氣及蒸汽，尢其對(duì)死角要?dú)⒕鷱氐?；關(guān)閉蒸汽后，待罐內(nèi)壓力低于空氣過(guò)濾器壓力時(shí)，通入無(wú)菌空氣保壓0.098MPa。發(fā)酵