基因工程綜合實驗

基因工程綜合實驗第1頁/共74頁異丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）第2頁/共74頁SDS電泳:

不同的蛋白質(zhì)分子具有不同的電荷和分子量。蛋白質(zhì)在強陰離子去污劑SDS與某一還原劑(如二巰基乙醇)共同作用下并加熱使蛋白質(zhì)解離后，變性的蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合并因此而帶負(fù)電荷，不同的蛋白質(zhì)結(jié)合SDS的量僅與分子量成正比而與氨基酸的序列無關(guān)，在SDS電泳時，蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺中的遷移率僅僅取決于蛋白質(zhì)的分子量。聚丙烯酰胺凝膠電泳由丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑N，N′—亞甲基雙丙烯酰胺在催化劑作用下，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。凝膠電泳不僅具有分辨不同分子量蛋白質(zhì)的作用(即分子篩作用)，還具有濃縮作用。由于不連續(xù)緩沖系統(tǒng)具有把樣品中的SDS-多肽復(fù)合物全部濃縮于極小體積的能力，從而提高了分辨率。采用考馬斯亮藍(lán)快速染色，可及時觀察電泳分離效果。第3頁/共74頁大腸桿菌高效表達(dá)外源基因須遵循基本原則

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)，由于待表達(dá)的外源基因結(jié)構(gòu)具有多樣性，尤其是真核生物基因的結(jié)構(gòu)與大腸桿菌基因結(jié)構(gòu)之間存在較大的差異，因而在構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng)時必須具體情況具體分析。一般來說，高效表達(dá)外源基因必須考慮以下基本原則。第4頁/共74頁1、優(yōu)化表達(dá)載體的設(shè)計

為了提高外源基因的表達(dá)效率，在構(gòu)建表達(dá)載體時，對決定轉(zhuǎn)錄起始的啟動子和決定mRNA翻譯的SD序列進(jìn)行優(yōu)化。具體方法包括組合強啟動子和強終止子；增加SD序列中與核糖體16SrRNA互補配對的堿基因序列，使SD序列中6～8個堿基與核糖體16SrRNA的堿基完全配對；根據(jù)待表達(dá)外源基因的不同情況調(diào)整SD序列與起始密碼子ATG之間的距離及堿基的種類；防止核糖體結(jié)合位點附近序列轉(zhuǎn)錄后形成“莖環(huán)”二級結(jié)構(gòu)。Shine-Dalgarnosequence;SDsequence因澳大利亞學(xué)者夏因(Shine)和達(dá)爾加諾(Dalgarno)兩人發(fā)現(xiàn)該序列的功能而得名。信使核糖核酸(mRNA)翻譯起點上游與原核16S核糖體RNA或真核18SrRNA3′端富含嘧啶的7核苷酸序列互補的富含嘌呤的3～7個核苷酸序列(AGGAGG)，是核糖體小亞基與mRNA結(jié)合并形成正確的前起始復(fù)合體的一段序列。第5頁/共74頁2、提高稀有密碼子tRNA的表達(dá)作用。

數(shù)密碼子具有簡并性，而不同基因使用密碼子的頻率不相同。大腸桿菌基因?qū)δ承┟艽a子的使用表現(xiàn)了較大的偏愛性，在幾個同義密碼中往往只有一個或兩個被頻繁地使用。如編碼Pro的密碼子包括CCG、CCC、CCU和CCA等。第一個密碼子在大腸桿菌的基因中都高頻地出現(xiàn)，而另外三個密碼子出現(xiàn)的頻率很低。此時可通過點突變等方法將外源基因中的稀有密碼子轉(zhuǎn)換為在受體細(xì)胞中高頻出現(xiàn)的同義密碼子。同義密碼子使用的頻率與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的tRNA的豐度呈正相關(guān)，稀有密碼子的tRNA在細(xì)胞內(nèi)的豐度很低。在mRNA的翻譯過程中，往往會由于外源基因中含有過多的稀有密碼子而使細(xì)胞內(nèi)稀有密碼子的tRNA供不應(yīng)求，最終使翻譯過程終止或發(fā)生移碼突變。第6頁/共74頁3、提高外源基因mRNA的穩(wěn)定性。

大腸桿菌的核酸酶系統(tǒng)能專一性地識別外源DNA或RNA并對其進(jìn)行降解。對于mRNA來說，為了保持其在宿主細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性，可采取兩種措施，一是盡可能減少核酸外切酶可能對外源基因mRNA的降解，二是改變外源基因mRNA的結(jié)構(gòu)，使之不易被降解。第7頁/共74頁4、提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性

大腸桿菌中含有多種蛋白水解酶，在外源基因表達(dá)產(chǎn)物的誘導(dǎo)下，蛋白水解酶的活性可能會增加。因此，須采用多種措施提高外源蛋白在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性。常用的方法包括：①將外源基因的表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì)或培養(yǎng)基中；②選用某些蛋白水解酶缺陷株作為受體菌；③對外源蛋白中水解酶敏感的序列進(jìn)行修飾或改造；④在表達(dá)外源蛋白的同時，表達(dá)外源蛋白的穩(wěn)定因子。第8頁/共74頁5、優(yōu)化培養(yǎng)與誘導(dǎo)過程

優(yōu)化培養(yǎng)過程包括多方面，首先是與細(xì)菌生長密切相關(guān)的條件或因素，如培養(yǎng)系統(tǒng)中的溶氧（轉(zhuǎn)速）、pH值、溫度和培養(yǎng)基的成分等，這些條件的改變都會影響細(xì)菌的生長及基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。第二方面是對外源基因表達(dá)條件的優(yōu)化。細(xì)菌生長到一定的階段后，開始誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)，誘導(dǎo)的方式包括添加特異性誘導(dǎo)物和改變培養(yǎng)溫度等。第9頁/共74頁實驗用材料、器皿及試劑1、材料菌株和質(zhì)粒：BL21(pETTEVCP)

垂直電泳裝置2、試劑

—IPTG貯備液：

—l×凝膠電泳加樣緩沖液：

—30%Acr-0.8%Bis（W/V）

—TEMED:直接用原液，避免揮發(fā)。

—電極緩沖液（pH8.3）

—2×樣品稀釋液

—染色液

—脫色液

第10頁/共74頁pET-22b（+）質(zhì)粒圖譜TEV-CPBamHIEcoRI第11頁/共74頁第12頁/共74頁

1、蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)（1）將含有外源基因的單菌落加入到10ml含有Amp的LB培養(yǎng)基中，37℃220rmp過夜培養(yǎng)（14-16小時）。（2）取300μl培養(yǎng)液于10ml無抗生素的LB培養(yǎng)基（1:100），37℃220rmp培養(yǎng)45分鐘，至菌液OD600≌0.4-1.0（最好0.6），加入40μlIPTG至終濃度為1mmol/L，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)2-3小時。（3）取上述菌液1ml于離心管中，并以未誘導(dǎo)的空白載體的細(xì)菌培養(yǎng)物為對照，冰上放置5分鐘，離心（6000rmp）1

分鐘。（4）在沉淀中加入100μl的1×凝膠加樣緩沖液，沸水中加熱5

分鐘。離心（12000rmp）1分鐘，（5）取上清進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。實驗操作程序第13頁/共74頁2、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（1）制備分離膠按下表配制分離膠。

6.255.63.10.18750.12512.530%Acr-0.8%Bis（mL）1mol/LpH8.8Tris-HCl緩沖液（mL）H2O（mL）10%SDS（mL）10%過硫酸銨（mL）TEMED（uL）用量試劑將上述膠液配好，混合后，迅速注入兩塊玻璃板的間隙中，至膠液面離玻璃凹槽3.5cm左右。然后在膠面上輕輕鋪1cm高的水，加水時通常順玻璃板慢慢加入，勿擾亂膠面。垂直放置膠板于室溫約20-30min左右使之凝聚，此時，在凝膠和水之間可以看到很清晰的一條界面，然后析出膠面上的水。第14頁/共74頁（2）制備濃縮膠

制備方法按下表相對比例混合所需溶液，用少量灌入玻璃板間隙中，沖洗分離膠膠面，然后倒出。把余下的倒入玻璃板間隙中，使液面與玻璃板凹槽處齊平，插入梳子，室溫放置20-30min。凝聚后小心拔出梳子。取出梳子后向形成的膠孔加入蒸餾水，沖洗出未凝聚的丙烯酰胺等，倒出孔中水，再加入電極緩沖液。1.671.257.030.10.110.030%Acr-0.8%Bis（mL）1mol/LpH6.8Tris-HCl（mL）H2O（mL）10%SDS（mL）10%過硫酸銨（mL）TEMED（μL）用量試劑第15頁/共74頁（3）將灌好膠的玻璃板垂直固定在電泳槽上，帶凹槽的玻璃板與電泳槽緊貼在一起，形成一個貯液槽，向其中加入電極緩沖液液，使其與膠孔中的緩沖液相接觸。在電泳槽下端的貯液槽中也加入電極緩沖液。（4）加樣：加樣的量應(yīng)適中，樣品中至少含有0.25μg的蛋白質(zhì)，染色后才能檢測得出，1.0μg的蛋白質(zhì)則十分明顯。樣品的點樣體積根據(jù)樣品溶液的濃度和凝膠孔的大小，可在20μL。加樣時用微量進(jìn)樣器（50-100μL體積）吸取已處理好的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品20μL（或根據(jù)商品說明加樣）。

1X凝膠電泳加樣緩沖液：

50mmol/LTris-CI(pH6.8)50mmol/LDTT2%SDS0.1%溴酚藍(lán)

10%甘油第16頁/共74頁（5）電泳及結(jié)果測量將電泳槽及電泳儀相連接，上槽為負(fù)極，下槽為正極。打開電源開關(guān)，將電壓調(diào)到最大，調(diào)節(jié)電流旋鈕，使每板電流為25mA進(jìn)行電泳，直至樣品中染料遷移至下端1cm時，停止電泳。取下玻璃板，小心地把其中一塊玻璃板從凝膠上取下來。第17頁/共74頁3、染色和脫色

將分離膠部分取下，放在盛有染色液的染色槽中浸泡30min左右。倒去染色液，用蒸餾水漂洗一次，然后加入脫色液，室溫浸泡凝膠或者放在搖床上振動脫色，更換幾次洗脫液，直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰。97664429M123kDa圖8TRSV-CPSDS電泳

1，3：誘導(dǎo)處理菌液；

2：未誘導(dǎo)菌液；

M：蛋白質(zhì)分子量第18頁/共74頁思考題1、簡述SDS的原理及測定的方法。2、誘導(dǎo)外源基因在大腸桿菌中表達(dá)的方法有哪些？加入IPTG的作用是什么？(作業(yè))3、在聚丙烯酰胺中的為什么蛋白質(zhì)的遷移率僅僅取決于其分子量？4、聚丙烯酰胺凝膠電泳中，凝膠由哪幾部分構(gòu)成？（作業(yè)）5、大腸桿菌高效表達(dá)外源基因必須遵循基本原則？第19頁/共74頁實驗八農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草基因轉(zhuǎn)化原理：農(nóng)桿菌發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)章魚堿型、胭脂堿型、農(nóng)桿堿型和琥珀堿型甘露堿型、黃瓜堿型和農(nóng)桿堿型冠癭堿第20頁/共74頁LB(25bp)RB(25bp)T-DNA(23kb)

圖4-12Ti質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖

Vir區(qū)基因(30-40kb)Ti200kbT-DNA的轉(zhuǎn)化需要Vir區(qū)基因的表達(dá)和左右邊界（LB、RB）的存在第21頁/共74頁Ti質(zhì)粒作為基因轉(zhuǎn)化的載體形式：共整合載體同源序列LBRBKm

rKmR目的基因同源序列同源序列vir區(qū)第22頁/共74頁雙元載體助手Ti質(zhì)粒pAL4404LBRB多克隆位點植物選擇基因細(xì)菌選擇基因lacRK2orivir區(qū)第23頁/共74頁將雙元載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌的兩種方法細(xì)胞內(nèi)含有攜帶Vir區(qū)基因的質(zhì)粒，常用菌株有LBA4404、EHA105三親交配法凍融法將提取的雙元載體與含Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌混合，在液氮中速凍1分鐘，然后在37℃下融化。第24頁/共74頁

影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化效率的因素：1、菌株染色體背景

不同農(nóng)桿菌株的類型的chv基因決定了其對受體細(xì)胞的識別和附著能力的差異。根癌農(nóng)桿菌的胭脂堿型和琥珀堿型生長快、不結(jié)球，轉(zhuǎn)化易于操作，但共培養(yǎng)時菌體附著能力較差：章魚堿型則生長慢、易結(jié)球，轉(zhuǎn)化難于操作，但共培養(yǎng)時菌體附著后不易洗去。2、共培養(yǎng)介質(zhì)細(xì)菌培養(yǎng)基：受體植物為農(nóng)桿菌宿主，所需共培養(yǎng)時間短；植物受體培養(yǎng)基：具有通用性，特別適合共培養(yǎng)時間較長的植物。否則易造成農(nóng)桿菌過度繁殖，導(dǎo)致植物外植體呼吸作用抑制和細(xì)菌分泌物毒害。

第25頁/共74頁3、侵染濃度和時間

濃度過高、時間過長會引起農(nóng)桿菌細(xì)胞間的競爭性抑制，而且過度增殖會抑制受體細(xì)胞的呼吸作用；濃度過底、時間過短則造成受體細(xì)胞表面農(nóng)桿菌附著不足。禾谷類作物一般侵染濃度較高，接種濃度為OD600＝1.0－2.0；侵染時間1-2小時。煙草、大白菜等對侵染敏感的雙子葉植物要求菌體濃度要低的多,一般為OD600=0.5；侵染時間5－10分鐘。第26頁/共74頁4、共培養(yǎng)條件

（1）共培養(yǎng)溫度農(nóng)桿菌在20~30℃的范圍內(nèi)都可以生長

vir區(qū)基因表達(dá)的適宜溫度多在20~25℃共培養(yǎng)溫度25℃左右

外植體生長溫度通常在25－26℃左右（2）共培養(yǎng)PH值酸性培養(yǎng)環(huán)境有利于農(nóng)桿菌的侵染。因為植物細(xì)胞釋放的對農(nóng)桿菌有趨化作用的化學(xué)物質(zhì)（如酚類、糖類）雖然在不同酸堿度下比較穩(wěn)定，但在pH=5.0－5.8時對vir基因的誘導(dǎo)能力最高。

第27頁/共74頁

（3）誘導(dǎo)物和抑制物酚類是vir區(qū)基因表達(dá)的主要信號物質(zhì)。是否添加視植物種類不同而異。宿主植物不需添加。（4）共培養(yǎng)時間

T~DNA的整合表達(dá)需要16小時以上。共培養(yǎng)時間要視植物類型而異，如煙草、生菜和花生一般在2天左右；水稻、玉米和小麥等禾谷類作物一般為3天；西瓜、甜瓜等瓜類以4－6天為佳。5、其他影響因素

外植體的類型，外植體的生理狀態(tài)、抑菌劑種類等。第28頁/共74頁實驗所用器皿及試劑1、器皿與材料

—超凈工作臺

—光照培養(yǎng)箱

—28℃恒溫?fù)u床

—高速離心機

—1.5ml無菌Eppendorf管

—微量移液器及各種型號吸頭

—鑷子、刀子等

—培養(yǎng)皿

—含目的基因的農(nóng)桿菌

—NC89煙草葉片2、藥品試劑

—卡那霉素（50mg/mL）

—利福平（30mg/mL）

—羧芐青霉素(250mg/mL)

—乙醇溶液（70%）

—0.1%氯化汞溶液第29頁/共74頁操作程序1、培養(yǎng)基的配制—YEP培養(yǎng)基（參見細(xì)菌培養(yǎng)基的配制）——預(yù)分化培養(yǎng)基：MS大量元素，MS微量元素，MS維生素，鐵鹽，蔗糖30g/L，6-BA3mg/L，NAA0.2mg/L，pH5.8，瓊脂9g/L?！狹S0培養(yǎng)液及共培養(yǎng)基：MS大量元素，MS微量元素，MS維生素，鐵鹽，蔗糖30g/L，pH5.8（注：共培養(yǎng)基添加瓊脂9g/L）——選擇培養(yǎng)基：MS大量元素，MS微量元素，MS維生素，鐵鹽，蔗糖30g/L，6-BA3mg/L，NAA0.2mg/L，pH5.8，瓊脂9g/L，卡那霉素100mg/L，羧卞青霉素500mg/L（注：卡那霉素和羧芐青霉素在冷卻到60℃時加入倒制平板）——生根培養(yǎng)基：MS大量元素，MS微量元素，MS維生素，鐵鹽，蔗糖20g/L，pH5.8，瓊脂9g/L，羧卞青霉素250mg/L（注：羧芐青霉素在倒制平板前加。第30頁/共74頁培養(yǎng)基配置一組：預(yù)分化培養(yǎng)基：1000ml（500ml/瓶、2瓶，）分裝后封口，高壓滅菌，冷卻至60℃分裝平板40皿。大量元素20X母液

50ml/L微量元素100X母液

10ml/L維生素100X母液10ml/L鐵鹽100X母液10ml/L蔗糖定溶后調(diào)pH5.8

瓊脂粉9g/L（每瓶4.5g）30g/L3mg/L0.2mg/L6-BANAA第31頁/共74頁

瓊脂粉大量元素20X母液/L

50ml/L微量元素100X母液/L

10ml/L維生素100X母液10ml/L鐵鹽100X母液10ml/L蔗糖定溶后調(diào)pH5.89g/L（每瓶4.5g）30g/L二組：共培養(yǎng)培養(yǎng)基：1000ml（500ml/瓶、2瓶）分裝后封口，高壓滅菌，冷卻至60℃分裝平板40皿。第32頁/共74頁三組：選擇培養(yǎng)基：1200ml（300ml/瓶、4瓶）分裝后封口，高壓滅菌，冷卻至60℃，加入卡那霉素和羧芐青霉素，分裝平板皿。大量元素20X母液

50ml/Lx1.2微量元素100X母液

10ml/L維生素100X母液10ml/L鐵鹽100X母液10ml/L蔗糖定溶后調(diào)pH5.8

瓊脂粉9g/L30g/L3mg/L0.2mg/L6-BANAA

羧芐青霉素

500mg/L卡那霉素100mg/L第33頁/共74頁大量元素20X母液/L

50ml/Lx1.8微量元素100X母液/L

10ml/L維生素100X母液10ml/L鐵鹽100X母液10ml/L蔗糖定溶后調(diào)pH5.830g/L四組：MS液體培養(yǎng)基：1800ml（150ml/瓶、12瓶）

分裝后封口，高壓滅菌。第34頁/共74頁

五組

YEP農(nóng)桿菌培養(yǎng)基：300ml（50ml/瓶、6瓶，）

蛋白胨10g/L

酵母粉10g/LNaCl5g/L

定溶分裝后，封口，高壓滅菌六組無菌水：24瓶（150ml/瓶）無菌三角瓶100ml12個，50ml70個無菌濾紙12包

50ml離心管12個

第35頁/共74頁2、基因轉(zhuǎn)化

注：以下操作均須在超凈工作臺上進(jìn)行，所需器皿均須滅菌

1、煙草Nc89種子催芽后，播種于塑料盤中，常規(guī)管理，至2-3

片真葉期，備用。

2、將農(nóng)桿菌（內(nèi)含帶卡那霉素抗性基因的表達(dá)載體），在固體

LB（含卡那霉素50mg/L，利福平20mg/L）培養(yǎng)基上劃線接種；在28℃、黑暗條件下培養(yǎng)3天。

3、挑取農(nóng)桿菌(攜帶重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落)接種于含有

50mg/L卡那霉素的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃，250rpm，振蕩培養(yǎng)約48小時,至對數(shù)生長后期。第36頁/共74頁4、將處于對數(shù)生長后期的農(nóng)桿菌液，在無菌離心管中，

3000rpm，離心5分鐘；用液體MS0重懸浮，稀釋3倍（OD600=0.4~0.6），用于轉(zhuǎn)化。5、取煙草葉片，用水洗去表面的污物，吸干多余的水分，用70%

乙醇消毒30秒，再用0.1%HgCl2

消毒10分鐘，用無菌水沖洗

5次，滅菌濾紙吸去表面水，用刀片切成小塊(0.5×0.5cm2)

左右。6、將切好的煙草葉片，平放于預(yù)分化培養(yǎng)基中，25℃，光照時間16小時/天，光照強度2000LX，預(yù)培養(yǎng)2天。7、將預(yù)培養(yǎng)后的煙草葉片浸入同時準(zhǔn)備好的菌液中10分鐘，中間搖動幾次；然后用滅菌的濾紙吸干多余菌液，接入共培養(yǎng)基；弱光下，28℃，共培養(yǎng)2-3天（外植體基部可見微菌落）。第37頁/共74頁8、共培養(yǎng)后的外植體先用含羧卞青霉素500mg/L的無菌水洗滌3

次，再用含羧芐青霉素500mg/L的MS0培養(yǎng)液洗1次，然后用滅菌濾紙吸干，轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)(條件同預(yù)培養(yǎng))；每15天更換一次培養(yǎng)基。9、待芽長至1cm左右時，切下，移入MS生根培養(yǎng)基中，若20-30天后，轉(zhuǎn)基因苗將會生根。10、待根系發(fā)育好后，移入盛有無菌土（基質(zhì)）的花盆中（注意洗凈根部培養(yǎng)基），用塑料薄膜保濕2天后，溫室常規(guī)管理。對抗性苗進(jìn)行抗性鑒定.第38頁/共74頁

選擇培養(yǎng)（轉(zhuǎn)化）芽分化生根

預(yù)培養(yǎng)共培養(yǎng)選擇培養(yǎng)（未轉(zhuǎn)化）第39頁/共74頁實驗結(jié)果描述：選擇培養(yǎng)3周后，觀察實驗結(jié)果。發(fā)現(xiàn)煙草葉片周圍產(chǎn)生大量愈傷組織，并有芽點產(chǎn)生。表明，外源基因可能已整合與煙草的基因組中。第40頁/共74頁思考題1、在植物基因轉(zhuǎn)化中，應(yīng)用的農(nóng)桿菌主要有哪兩種類型？2、根據(jù)農(nóng)桿菌染色體毒性(chv)基因不同（合成冠廮堿的不同），又分別分為哪些類型？3、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物基因轉(zhuǎn)化中，Ti質(zhì)粒作為基因轉(zhuǎn)化的基因載體，主要有哪兩種形式？4、將雙元載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌的方法。5、在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化中，常用的共培養(yǎng)介質(zhì)有哪幾種？6、在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化中，用于誘導(dǎo)vir區(qū)基因活化的酚類物質(zhì)主要有哪些？第41頁/共74頁7、植物基因轉(zhuǎn)化中應(yīng)用的DNA直接吸收轉(zhuǎn)化法主要包括哪些？8、在用農(nóng)桿菌侵染植物外植體時，菌液濃度過高或高低，侵染時間過長或過短，均會造成轉(zhuǎn)化效率的降低，為什么？（作業(yè)）9、農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化中，培養(yǎng)時間要視植物類型而異，如煙草、生菜和花生一般在2天左右；水稻、玉米和小麥等禾谷類作物一般為3天；西瓜、甜瓜等瓜類以4~6天為佳。10、農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化中，共培養(yǎng)溫度一般為多少度？，共培養(yǎng)基的pH一般為多少？。11、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化中，T-DNA完成轉(zhuǎn)移所必需的兩個條件是什么？（作業(yè)）12、描述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草基因轉(zhuǎn)化的基本步驟。

第42頁/共74頁轉(zhuǎn)基因植物的分子分析

對轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行分子分析，常在三種水平進(jìn)行檢測外源基因的整合和表達(dá)。DNA水平是否整合PCRSouthernRNA水平是否轉(zhuǎn)錄Northern蛋白質(zhì)水平是否翻譯WesternELISA第43頁/共74頁實驗九植物總DNA的提取

原理：（二破、一抽、一沉）植物細(xì)胞中總DNA包括：核DNA、線粒體DNA、葉綠體DNA

破壁：液氮研磨破膜：SDS或CTAB一類的去污劑抽提：大多數(shù)蛋白可通過氯仿或苯酚處理后變性、沉淀除去，絕大部分RNA則可通過經(jīng)處理過的RnaseA除去多糖類雜質(zhì)去除較困難，通過暗處理，乙醇分級沉淀沉淀：異丙醇或乙醇

第44頁/共74頁影響植物DNA提取得率和質(zhì)量的因素1、材料選取時，應(yīng)盡量選幼嫩的葉片（3-4葉）。2、液氮研磨要充分，快速，否則影響裂解效果。3、再裂解過程和抽提過程中，中間搖動幾次，增加材料和裂解液的接觸。4、抽提液中飽和酚的PH值應(yīng)接近8.0，這樣可減少離心后水酚雙面的交界面上有DNA滯留。5、在沉淀DNA時加入NaAc混合后，應(yīng)放置幾分鐘，使Na+與DNA結(jié)合形成鹽，這樣在異丙醇或乙醇中鹽不容易被溶解。6、操作過程中，動作應(yīng)緩慢，減少機械損傷，保證基因組DNA的完整性。第45頁/共74頁提取DNA的檢測

帶型彌散：DNA降解1、電泳法：瓊脂糖凝膠電泳前面量多含有RNA

點樣孔亮帶蛋白或雜質(zhì)2、光吸收法：檢測260nm和280nm的光吸收值。大于2.0RNA多RNase

小于1.8雜質(zhì)或蛋白多抽提3、核酸濃度計算：OD260x50ng/ulx稀釋倍數(shù)第46頁/共74頁實驗所用材料、儀器和試劑1、重要的實驗材料

植物材料：轉(zhuǎn)馬鈴薯Y病毒外殼蛋白基因的轉(zhuǎn)基因煙草葉片引物：

PVY-5：GCAAATGACACAATGCATGCPVY-3：TCACATGTTCTTGACTCCAA第47頁/共74頁2、主要儀器和器皿

第48頁/共74頁基本原理和用途

離心技術(shù)是借助于離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，根據(jù)物質(zhì)顆粒的沉降系數(shù)、質(zhì)量、密度及浮力等因素的不同，而使物質(zhì)分離的技術(shù)。隨著生物化學(xué)、分子生物學(xué)和生物工程的發(fā)展，離心分離技術(shù)已在科研、生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。特別是超速離心技術(shù)已經(jīng)成為分離、純化和鑒別各種生物大分子的重要手段之一。第49頁/共74頁離心機的分類及用途低速離心機：轉(zhuǎn)速為8000rpm以下；相對離心力為10000g以下；主要用于分離細(xì)胞、細(xì)胞碎片及培養(yǎng)基殘渣等顆粒物，也用于粗結(jié)晶的較大顆粒的分離。高速離心機：轉(zhuǎn)速為10000～25000rpm；相對離心力為10000～

100000g；主要用于分離各種沉淀物、細(xì)胞碎片和較大的細(xì)胞器等。為了防止高速離心過程中溫度升高而使酶等生物分子變性失活，有些高速離心機設(shè)有冷凍裝置，所以叫做冷凍離心機。超速離心機：轉(zhuǎn)速為25000～80000rpm；最大相對離心力為

500000g；為了防止溫度升高和降低空氣阻力和磨擦，超速離心機設(shè)有冷凍和真空系統(tǒng)。主要用于生物大分子、細(xì)胞器和病毒等的分離、純化。第50頁/共74頁儀器型號和控制面板5810R型高速冷凍離心機控制面板shortfasttemptempprogspeedtimestartstop▽△open第51頁/共74頁操作規(guī)程1、插上電源，按離心機右側(cè)壁上“I/O”鍵打開電源開關(guān)，儀器自檢，依次顯示eppendorf5810RV5.4如上圖控制面板的顯示屏所示介面。2、按“open”鍵打開離心機蓋，根據(jù)離心樣品的體積和樣品離心的要求選擇合適的轉(zhuǎn)子和離心管，將轉(zhuǎn)子放置在軸上并用六角螺絲刀擰緊。3、旋上轉(zhuǎn)子蓋，輕輕按下離心機蓋，電子鎖自動鎖上機蓋。按控制面板上的“temp”鍵，此時該鍵上方所對應(yīng)的數(shù)字閃爍，按“△”或“▽”鍵設(shè)定所需溫度，然后按控制面板上的“fasttemp”鍵，然后機器會根據(jù)轉(zhuǎn)子的型號自動運行一個離心程序，使離心室的溫度快速降至所需溫度（到達(dá)設(shè)定溫度后，機器會發(fā)出提示音）。第52頁/共74頁4、待機器發(fā)出提示音后，按“open”鍵打開機蓋，旋開轉(zhuǎn)子蓋，將裝有樣品且平衡好的離心管對稱放入轉(zhuǎn)子中，旋上轉(zhuǎn)子蓋，蓋好機蓋。

[說明]

（1）如果此次離心不需要很長時間，則可以在上述操作后，按住“short”鍵，此時機器會運行“short”程序進(jìn)行離心，此時操作面板上的“prog”上方所對應(yīng)的數(shù)字會顯示“SH”字樣。按“short”鍵時間的長短，會決定轉(zhuǎn)速的高低，當(dāng)放開手后，轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速會逐漸降低直至到零，“open”鍵燈亮，按“open”鍵打開機蓋，旋開轉(zhuǎn)子蓋取出樣品。（2）如果此次需要保證離心時間，則按下述操作進(jìn)行。第53頁/共74頁5、按控制面板上的“speed”鍵，此時該鍵上方所對應(yīng)的數(shù)字閃爍，按“△”或“▽”鍵設(shè)定離心所需轉(zhuǎn)速。另外，連續(xù)按兩次“speed”鍵，該鍵上方所顯示的數(shù)值則是離心力的值，按“△”或“▽”鍵可設(shè)定所需離心力值的大小來完成離心。根據(jù)離心要求選擇。6、按控制面板上的“time”鍵，此時該鍵上方所對應(yīng)的數(shù)字閃爍，按“△”或“▽”鍵設(shè)定所需離心時間。另外，連續(xù)按兩次或者三次該鍵，則可以調(diào)整轉(zhuǎn)速升高或者降低加速度的梯度值，可根據(jù)離心樣品不同的需要進(jìn)行調(diào)節(jié)。

[說明]

（1）設(shè)置完成后如果要保存此次設(shè)置的參數(shù)，可以連續(xù)按兩次“prog”鍵，此時該鍵上方對應(yīng)的數(shù)字閃爍，按“△”或“▽”鍵選擇要保存在哪個文件名下，選擇完畢，按住“prog”鍵直至屏幕顯示“ok”后，放開手，這時此次設(shè)置的參數(shù)就被保存了。第54頁/共74頁

下次離心如需要同樣離心參數(shù)時，不用按其它按鍵設(shè)定，只需要按下“prog”鍵，然后按“△”或“▽”鍵找到程序名就可以直接“start”鍵開始進(jìn)行離心。（2）如果不要保存此次設(shè)置的參數(shù)，可以直接按“start”鍵進(jìn)行離心。此時“prog”鍵上方對應(yīng)的數(shù)字顯示為“0”

（“0”表示未保存的當(dāng)前運行程序）。7、離心時間結(jié)束后，速度會逐漸降低，到零時“open”鍵燈亮，可按該鍵使機蓋打開，旋開轉(zhuǎn)子蓋取出樣品。8、關(guān)閉機器時，先按控制面板上的“”鍵關(guān)閉控制面板電源，再關(guān)閉機器側(cè)壁“I/O”開關(guān)，拔下插入外電網(wǎng)電源插頭。第55頁/共74頁注意事項1、離心機移動后,最好4個小時后再使用。2、檢查離心機電源插座能否負(fù)擔(dān)離心機的使用功率(250V,10A)。3、離心機使用時離心套管一定要對稱放置，并質(zhì)量相等。4、離心開始前必須檢查轉(zhuǎn)子蓋是否旋好，并且蓋好機蓋。5、由于控制面板上面的按鍵是觸摸式的，所以在設(shè)置參數(shù)時不要用力去按按鍵，以免造成按鍵失靈。當(dāng)所設(shè)置的參數(shù)達(dá)到最大或者最小值時，再繼續(xù)按“△”或“▽”數(shù)值顯示不會變動，這時就不要再繼續(xù)按按鍵了。6、使用完機器后不要馬上蓋上機蓋，應(yīng)等離心室內(nèi)壁化霜，清理干凈后，再蓋上機蓋。7、關(guān)閉機器時一定要記住，先按控制面板上的“”鍵，關(guān)閉控制面板電源，在關(guān)閉機器側(cè)壁開關(guān)，拔下插頭。8、轉(zhuǎn)子長期不用時，一定要取出，再次使用時注意使用潤滑油。第56頁/共74頁1.提取緩沖液（120ml，12個樣品）配制

——尿素51g

——1MTris.CI（pH8.0）6ml

——0.5MEDTA（pH8.0）2.4ml

——3.5MNaCI12ml

——苯酚7.5ml

——10%SDS12ml

——10%LDS12ml

試劑配好后定容至120ml，65℃水浴中溶解。然后加入0.3g的亞硫酸氫鈉，分裝于11個50ml的離心管中（每管10ml），置于冰水中。實驗操作程序（一）轉(zhuǎn)基因植物總DNA的提取

所用抽提緩沖液應(yīng)在用前配制，加入亞硫氫酸鈉后，易氧化，不能過夜。亞硫氫酸鈉應(yīng)避光保存。第57頁/共74頁2、提取程序1）取新鮮的轉(zhuǎn)基因煙草葉片2g，加入足量的液氮充分研磨后，移入盛有提取液的離心管中，震蕩數(shù)秒中，然后置于冰水中20分鐘，中間震蕩2-3次。每次研磨材料的量不宜過多，操作應(yīng)快。

液氮研磨移入離心管第58頁/共74頁

置冰上20min振蕩2－3次第59頁/共74頁2）10000r/min，4℃，離心15分鐘。3）取上清液，加入3.5ml3MNaAC（pH5.3），混勻，再加2ml氯仿：異戊醇（24：1），輕輕混勻后，冰水中放置20分鐘。

離心倒出上清第60頁/共74頁4）10000r/min，4℃，離心15分鐘。5）取上清液，加入等體積冷的異丙醇，顛倒試管混勻，冰水中放置10分鐘。

取上清加入異丙醇第61頁/共74頁6）用吸管撈出絮狀DNA，離心1min使DNA到管底，經(jīng)70%乙醇洗滌2次后，干燥，加500ul的TE緩沖液，65℃水浴中溶解。

沉淀DNA絮狀DNA撈出DNA7）加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）抽提，即混勻后,12000rpm離心5min,取上清。再用等體積氯仿：異戊醇（24：1）抽提一次，取上清。加入1/10體積3MNaAC（pH5.3），2倍總體積冷的無水乙醇沉淀DNA。第62頁/共74頁8）-20℃放置10分鐘至數(shù)小時，室溫，12000r/min，離心5分鐘。9）沉淀用70%的乙醇洗滌2次，干燥后，加入50ulTE回溶，

-20℃保存。

洗滌DNA干燥DNA第63頁/共74頁思考題1、描述植物總DNA提取的基本過程。(作業(yè))2、植物總DNA主要包括：核DNA、線粒體DNA、葉綠體DNA。3、植物總DNA提取方法中，破壞細(xì)胞膜常用的的陰離子去污劑有：SDS、CTAB等。4、在植物總DNA提取過程中，蛋白質(zhì)、RNA及多糖等雜質(zhì)的去除，常采用什么方法？（作業(yè)）5、純化DNA時，一般先用酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）抽提一次，再用氯仿：異戊醇（24：1）抽提一次，最后用乙醇或異丙醇沉淀。第64頁/共74頁實驗十酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）技術(shù)原理：

ELISA為酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linkedImmunoSorbentAssay）的簡稱。利用抗原和抗體特異結(jié)合的特點，將抗原直接或間接地固定在固相，然后使其與酶標(biāo)抗體反應(yīng)，再加入酶的底物，利用酶與底物的呈色反應(yīng)，來判斷抗原的存在及濃度。辣根過氧化物酶—鄰苯二胺；堿性磷酸酶—4-硝基酚磷酸第65頁/共74頁ELISA檢測程序包括抗體或抗原的包被、免疫反應(yīng)及檢出。包被就是將抗原或抗體固定在固相載體表面，亦稱包埋。包被可采用物理吸附或共價交聯(lián)的方法。包被的好壞是影響固-液抗體-抗原反應(yīng)的重要因素之一。

ELISA中最常用的固相載體是多孔的聚苯乙烯微量反應(yīng)板。聚苯乙烯微量反應(yīng)板對蛋白質(zhì)有較強的物理吸附作用，與蛋白類抗原（體）結(jié)合較強。使用聚苯乙烯反應(yīng)板時，應(yīng)用低離子強度并偏堿性的包被液，因在此條件下蛋白質(zhì)易被吸附，緩沖液pH值在6.0以下時，非特異性吸附會有所增加。聚苯乙烯微量反應(yīng)板第66頁/共74頁

加入酶標(biāo)抗體抗原吸附加入酶標(biāo)抗體(如羊抗兔)抗體(如兔抗抗原)與抗原結(jié)合

加入酶底物,呈有色反應(yīng)B抗原抗體抗原與抗原結(jié)合(捕捉抗原)加入酶底物,呈有色反應(yīng)C抗原(蛋白質(zhì))酶