蛋白質(zhì)分子的特殊運動折疊

關(guān)于蛋白質(zhì)分子的特殊運動折疊第一頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三分子生物學(xué)中心法則

蛋白質(zhì)折疊問題又被稱為第二遺傳密碼第二頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三給定一序列，它將怎樣折疊成其特定結(jié)構(gòu)？§9蛋白質(zhì)的折疊第三頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三蛋白質(zhì)折疊研究的理論意義幾乎所有的生命活動都是由蛋白質(zhì)完成的

而蛋白質(zhì)鏈只有折疊成天然結(jié)構(gòu)才有活性

生命從蛋白質(zhì)折疊開始！第四頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三蛋白質(zhì)折疊研究的應(yīng)用意義蛋白質(zhì)工程的醫(yī)藥保健產(chǎn)品市場每年數(shù)十億美元

已知二十多種疾病與蛋白質(zhì)的錯誤折疊有關(guān)

（老年癡呆癥、瘋牛病等）蛋白質(zhì)折疊還是蛋白質(zhì)組研究的瓶頸之一第五頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三Prion疾病第六頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三Amyloidosis淀粉樣變性病AttributedtoFrerichs,1862Amyloid淀粉狀蛋白1854RudolphVirchow第七頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三有關(guān)蛋白質(zhì)折疊的幾項重要研究1930s吳憲指出蛋白質(zhì)變性是肽鏈的構(gòu)象變化而非共價鍵變化1960sC.Anfinsen

發(fā)現(xiàn)還原態(tài)RNaseA，在除去還原劑和變性劑后能夠自動氧化恢復(fù)活性，提出蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)是其熱力學(xué)最穩(wěn)態(tài)1960s人工合成牛胰島素1940sL.Pauling在蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)解出之前，根據(jù)物理化學(xué)原理預(yù)測了蛋白質(zhì)螺旋和折迭結(jié)構(gòu)NobelPrize,1973第八頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三變性條件1.溫度2.

pH3.鹽4.變性劑有機溶劑脲鹽酸胍去垢劑尿素：碳酸(全)酰胺O=C(NH2)28M胍：HN=C(NH2)26M第九頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三NativeProteinDenatured第十頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三變性原理破壞次級鍵不破壞共價鍵溫度：較高時導(dǎo)致蛋白質(zhì)交聯(lián)聚沉，凝固，不可逆pH：破壞鹽鍵，影響解離，改變相互作用的性質(zhì)鹽：活度，溶解度脲：競爭氫鍵第十一頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三蛋白質(zhì)的功能決定于它們的天然構(gòu)象，因而過去研究工作集中在蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象上，而對變性態(tài)沒有給予足夠重視。近來，人們已知道蛋白質(zhì)的非天然構(gòu)象至少在以下三方面有重要作用：1、蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性2、蛋白質(zhì)的跨膜運輸3、蛋白質(zhì)的水解和更新第十二頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三小分子蛋白質(zhì)去折疊轉(zhuǎn)變是可逆的。在周圍環(huán)境的誘導(dǎo)下，小分子蛋白質(zhì)發(fā)生去折疊，當(dāng)將環(huán)境刺激因素去掉后，去折疊的蛋白質(zhì)又可以在折疊。第十三頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三第十四頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三第十五頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三一、問題的提出蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)是由什么決定的？蛋白質(zhì)如何由一級結(jié)構(gòu)形成高級結(jié)構(gòu)？如何由一級結(jié)構(gòu)預(yù)測三級結(jié)構(gòu)？上述提法實際上要解決相同的問題分子內(nèi)、分子間的相互作用折疊過程中是否存在中間態(tài)第十六頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三

絕大多數(shù)的小蛋白質(zhì)的去折疊與再折疊是可逆的“一級結(jié)構(gòu)不僅為空間結(jié)構(gòu)編碼，而且以某種方式規(guī)定指導(dǎo)著達到這種空間結(jié)構(gòu)所經(jīng)歷的途徑”——蛋白質(zhì)折疊的密碼／立體化學(xué)密碼／第二密碼。折疊密碼的復(fù)雜性：序列相近的蛋白取相同的空間結(jié)構(gòu)；序列相同的肽段可以取不同的二級結(jié)構(gòu)。 第十七頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三兩個主要的考慮方向１．熱力學(xué)條件２．動力學(xué)條件化學(xué)反應(yīng)觀點； 相變觀點第十八頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三Milestone第十九頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三

Anfinsen對Ribonuclease的研究提出了蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)的假說。Anfinsen'swork,1957-63:formationofnativedisulfidebondsinribonucleaseAandotherproteins.

Keydiscovery:theinformationneededforfoldingiscontainedintheaminoacidsequence.第二十頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三二、蛋白質(zhì)折疊的熱力學(xué)考慮Anfinsen的經(jīng)典熱力學(xué)假說：

Anfinsen認為天然蛋白質(zhì)多肽鏈所采取的構(gòu)象是在一定環(huán)境條件下（如溶液組分、pH、溫度、離子強度等），整個系統(tǒng)的總Gibbs自由能取最低，所以處于變性狀態(tài)的多肽鏈能夠在這樣的環(huán)境下自發(fā)折疊成天然構(gòu)象。第二十一頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三Anfinsen實驗

變性蛋白的復(fù)性實驗從二硫鍵入手,提出假設(shè),實驗驗證其正確性:材料:牛胰核糖核酸酶含4對二硫鍵26-84 40-9558-110 65-72-S-S-交聯(lián)方式:7x5x3x1=105種,天然只占其中一種第二十二頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三牛胰核糖核酸酶第二十三頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三Anfinsen實驗?zāi)Ｐ?：空間障礙，只允許一種構(gòu)象（二硫鍵配對）模型2：生物合成的結(jié)果模型3：先形成了熱力學(xué)穩(wěn)定構(gòu)象，然后形成二硫鍵加固實驗否定了前兩種假設(shè)，肯定了第三種第二十四頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三Anfinsen實驗實驗一：1.脲變性。RNAase+8M脲+巰基乙醇脲使得肽鏈展開，酶失活2.透析除脲和巰基乙醇，3.pH~8弱堿性條件，溶液暴露于空氣中，重新氧化復(fù)性，酶活力重新獲得第二十五頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三巰基乙醇第二十六頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三脲變性過量巰基乙醇導(dǎo)致還原第二十七頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三Anfinsen實驗實驗二1.

脲變性。RNAase+8M脲+巰基乙醇脲使得肽鏈展開，酶失活2.透析除巰基乙醇，然后通O2，再透析除脲結(jié)果：酶活性恢復(fù)到~0.01第二十八頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三錯配的二硫鍵只需要加一點點巰基乙醇就可復(fù)性第二十九頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三Anfinsen實驗1.由實驗一可知，模型２（生物合成的結(jié)果）不成立，因為離體條件下復(fù)性的蛋白具有全部酶活性（后來又有實驗證明體外解折疊是完全的，全人工合成）2.由實驗二可知，模型１（空間障礙，只允許一種構(gòu)象（二硫鍵配對））不成立，否則，復(fù)性的蛋白應(yīng)該具有幾乎全部酶活性3.模型３（先形成了熱力學(xué)穩(wěn)定構(gòu)象，然后形成二硫鍵加固）能夠解釋both結(jié)果。結(jié)論：蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)決定三級結(jié)構(gòu)形成三級結(jié)構(gòu)所需要的所有信息包含在一級結(jié)構(gòu)中。第三十頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三Anfinsen實驗Anfinsen實驗的啟示：1.成功需要一點點運氣（簡單的單結(jié)構(gòu)域蛋白）2.抓住主要矛盾，善于洞察問題的本質(zhì)3.

嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐评聿皇堑玫秸_結(jié)論的必要條件正確的前提＋正確的推導(dǎo)＝正確的結(jié)論正確的前提＋錯誤的推導(dǎo)＝正確或錯誤的結(jié)論錯誤的前提＋正確的推導(dǎo)＝錯誤的結(jié)論（大概率）錯誤的前提＋錯誤的推導(dǎo)＝正確或錯誤的結(jié)論Model1and2都有實驗支持第三十一頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三同時代取得的其它一些結(jié)果折疊是以結(jié)構(gòu)域為單位進行的。

ribonucleaseA去除5C-末端殘基后,蛋白質(zhì)就喪失了正確形成二硫鍵的能力。(H.Taniuchi,J.Biol.Chem.245,5459-5468;1970)含有兩個或多個結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，相鄰結(jié)構(gòu)域的解折疊是近似相互獨立的。第三十二頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三LevinthalParadox對一個100個氨基酸殘基的小蛋白質(zhì)鏈假設(shè)：只有主鏈二面角和可以轉(zhuǎn)動每個二面角只有3個可能值則：總構(gòu)象數(shù)為3200如果：每轉(zhuǎn)動一次時間為10-15秒則：歷遍所有構(gòu)象約需1072年而：宇宙年齡為1.51010第三十三頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三三、折疊的動力學(xué)考慮有無中間體？最低自由能構(gòu)象能否達到？折疊過程是怎樣的？第三十四頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三單一結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，不存在平衡中間態(tài)。兩態(tài)折疊第三十五頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三折疊中間態(tài)的發(fā)現(xiàn)首先在折疊、去折疊的早期動力學(xué)時(快速反應(yīng))中發(fā)現(xiàn)。(Cytochromec:A.IkaiandC.Tanford,Nature230,100-102;1971;ribonucleaseA:T.Y.Tsong,R.L.BaldwinandE.L.Elson,PNAS68,2712-2715;1971)第三十六頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三折疊中間態(tài)?無輔基肌紅蛋白(Apo-Mb)變性圖（圓二色譜CD結(jié)果）第三十七頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三快速檢測蛋白質(zhì)折疊的方法第三十八頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三通過二硫鍵捕捉中間體

－－捕獲二硫鍵碘乙酸抑制二硫鍵的生成，在不同的時間加入碘乙酸，得到二硫鍵數(shù)目不同，構(gòu)象不同的蛋白質(zhì)，然后利用柱層析分離第三十九頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三牛胰蛋白酶抑制劑的二硫鍵折疊途徑中間體限速第四十頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三蛋白質(zhì)折疊過程的時間尺度第四十一頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三多肽鏈能夠采取的構(gòu)象個數(shù)是個天文數(shù)字，平均每個Aa可以有10種構(gòu)象，100Aa的多肽鏈有10100種可能的構(gòu)象。從一個構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪粋€構(gòu)象所需最短時間10－13s，則該蛋白嘗試所有的構(gòu)象的時間是1085s=1077y，而人們觀察到蛋白質(zhì)體內(nèi)、體外折疊的時間是10-1～10-3s.

結(jié)論：蛋白質(zhì)的折疊不是隨機嘗試所有可能的構(gòu)象直到遇到某個自由能最低的構(gòu)象，而是沿著某些確定的途徑進行的。蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象未必是最低自由能的構(gòu)象，而是動力學(xué)途徑中所能得到的穩(wěn)定的構(gòu)象。LevinthalParadox第四十二頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三能量偏移限制了折疊過程中對不合理構(gòu)象的嘗試第四十三頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三對蛋白折疊過程的共識

－－兩種過程成核：小蛋白多步：大蛋白，以結(jié)構(gòu)域為單位第四十四頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三蛋白質(zhì)折疊的啟動疏水塌縮經(jīng)熔球中間態(tài)（moltenglobulestate）二級結(jié)構(gòu)生成框架結(jié)構(gòu)模型特殊作用的啟動Disulfidebonds去折疊態(tài)中的殘留有序結(jié)構(gòu)第四十五頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三第四十六頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三1、局部肽段形成一些構(gòu)象單元（螺旋、折疊和轉(zhuǎn)角等）——Motifs——三級結(jié)構(gòu)；

2、肽鏈內(nèi)部的疏水作用引起一個塌陷過程，然后經(jīng)調(diào)整，形成不同層次的結(jié)構(gòu)。3、“熔球態(tài)”的中間狀態(tài)。在熔球態(tài)中，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)已基本形成，蛋白質(zhì)的整體空間結(jié)構(gòu)也初具規(guī)模。在熔球態(tài)時，分子立體的結(jié)構(gòu)再作一些局部調(diào)整，最后形成正確的立體結(jié)構(gòu)第四十七頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三蛋白質(zhì)折疊的現(xiàn)代研究從頭算(abinitio

)預(yù)測1D->3D目標(biāo)：疏水表面埋藏最大，loop熵減最小設(shè)計新的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)象病的研究蛋白質(zhì)錯誤折疊產(chǎn)生淀粉樣纖維，導(dǎo)致構(gòu)象病，eg:Alzheimer'sandParkinson'sdiseases(J.W.Kelly,NatureStruct.Biol.9,323-325;2002).第四十八頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三第四十九頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三折疊過程的動力學(xué)模擬動力學(xué)模擬能夠成功的再現(xiàn)折疊過程的細節(jié)，例如過渡態(tài)的結(jié)構(gòu)(D.Baker,Nature405,39-42;2000)和折疊中間體

(C.Clementi,P.A.JenningsandJ.N.Onuchic,PNAS97,5871-5876;2000)第五十頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三BakerD.等認為，如果多肽鏈所采取的構(gòu)象中只有一個低自由能狀態(tài)，即天然構(gòu)象，則所有非天然構(gòu)象多肽鏈將遵循經(jīng)典熱力學(xué)假說，由高能態(tài)向低能態(tài)轉(zhuǎn)變，最終形成天然構(gòu)象。但有些蛋白，天然構(gòu)象也許并非是多肽鏈自由能最低的構(gòu)象或唯一的低能構(gòu)象，多肽鏈采取非天然的構(gòu)象也很穩(wěn)定，而這兩種構(gòu)象之間轉(zhuǎn)變需要克服很高勢壘而難以實現(xiàn)，那么蛋白質(zhì)在折疊過程中就會有兩種途徑的競爭，一種是正確折疊形成天然構(gòu)象，一種是錯誤折疊形成非天然構(gòu)象。蛋白質(zhì)之所以能夠形成正確的構(gòu)象，是由于一些因素在蛋白質(zhì)折疊的動力學(xué)過程中起驅(qū)動作用。第五十一頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三“輔助性組裝學(xué)說”相對于“自組裝”學(xué)說，認為蛋白質(zhì)多肽鏈的正確折疊和組裝需要其他蛋白質(zhì)分子的幫助，分子伴侶與折疊酶一起，構(gòu)成了兩種重要的輔助折疊分子。第五十二頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三折疊酶折疊酶催化蛋白質(zhì)折疊過程中共價鍵的異構(gòu)化，主要有有PDI和PPI。PPI，脯胺酰順反異構(gòu)酶PDI，二硫鍵異構(gòu)酶第五十三頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三四、分子伴侶（chaperone）

許多蛋白質(zhì)的多肽單體在離體條件下能折疊、組裝成具有生物學(xué)功能的聚合體，但在體內(nèi)絕大多數(shù)新生肽三維結(jié)構(gòu)的形成，需要一類稱為分子伴侶的輔助蛋白的存在。分子伴侶是能夠結(jié)合和穩(wěn)定另外一種蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定構(gòu)象，并能通過有控制的結(jié)合和釋放，促進新生多肽的折疊、多聚體的裝配或降解及細胞器蛋白的跨膜運輸?shù)鹊囊活惖鞍?。在動物、植物、細菌?nèi)廣泛分布和存在，其功能是介導(dǎo)其它蛋白質(zhì)的折疊和裝配，而本身卻不是最終功能蛋白質(zhì)分子的組成部分。第五十四頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三定義一類在序列上沒有相關(guān)性但有共同功能的蛋白質(zhì)，它們在細胞內(nèi)幫助其他含多肽的結(jié)構(gòu)完成正確的組裝，而且在組裝完畢后與之分離，不構(gòu)成這些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)執(zhí)行功能時的組份.第五十五頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三分子伴侶的特征

從參與促進一個反應(yīng)而本身不在最終產(chǎn)物中出現(xiàn)這一點來看，分子伴侶具有酶的特征。但從以下三方面來看，分子伴侶和酶很不同。1、分子伴侶對靶蛋白沒有高度專一性，同一分子伴侶可以促進多種氨基酸序列完全不同的多肽鏈折疊成為空間結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能都不相關(guān)的蛋白質(zhì)。2、它的催化效率很低。行使功能需要水解ATP，以改變其構(gòu)象，釋放底物，進行再循環(huán)。3、它和肽鏈折疊的關(guān)系，是阻止錯誤折疊，而不是促進正確折疊。4.多能性（脅迫保護防止交聯(lián)聚沉，轉(zhuǎn)運，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，組裝細胞骨架）5.進化保守性第五十六頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三分子伴侶的分類伴侶素家族(Charperonin,Cpn)GroE(Hsp60)家族和Tric家族熱休克蛋白70家族(Hsp70)熱休克蛋白90家族(Hsp90)其它種類的分子伴侶應(yīng)激蛋白第五十七頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三第五十八頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三第五十九頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期三五、蛋白質(zhì)折疊/去折疊的實驗研究方法Fast/Ultrafastmixing

Stopped-flow,quenchflow,continuousflow,..