蛋白定量與純度分析

關(guān)于蛋白定量與純度分析第一頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三第一節(jié)蛋白質(zhì)定量分析1概況1.1蛋白含量蛋白質(zhì)定量分析通常是指測(cè)定蛋白質(zhì)溶液中的蛋白質(zhì)的量或蛋白質(zhì)粉劑中蛋白質(zhì)的量。在進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定時(shí)，首先根據(jù)蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)的特性和實(shí)驗(yàn)室的現(xiàn)有條件來(lái)確定測(cè)定方法。蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法有很多，大致可以分為四類(lèi)，重量法定氮法比色法氨基酸推算法等第二頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三

采用的測(cè)定方法不同得到的測(cè)定結(jié)果有差異。每-種方法有它獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，但是也有它的局限性。。在上述幾種測(cè)定方法中測(cè)定的數(shù)據(jù)最準(zhǔn)確的，最可靠的屬于定氮法和氨基酸推算法。這兩種測(cè)定方法都是通過(guò)測(cè)定分子中的氮元素或分子結(jié)構(gòu)來(lái)確定蛋白質(zhì)含量的。因此，測(cè)得的數(shù)據(jù)相對(duì)比較準(zhǔn)確，但是它的實(shí)驗(yàn)步驟比較多，操作比較繁瑣。其他的測(cè)定方法相對(duì)簡(jiǎn)單一些，是實(shí)驗(yàn)室常用的技術(shù)，靈敏度相對(duì)低一些。測(cè)定蛋白質(zhì)含量通常要采用兩種以上的方法，要根據(jù)蛋白質(zhì)的某些特性選擇不同的方法進(jìn)行測(cè)定。將多種方法測(cè)得的結(jié)果綜合考慮。第三頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三1.2蛋白質(zhì)濃度測(cè)定蛋白質(zhì)定量分析的方法很多，采用的定量分析方法不同其測(cè)定的基本原理也同；得到的結(jié)果有一定的差異。每一種測(cè)定方法有它的優(yōu)點(diǎn)，也有它的不足之處。在實(shí)際工作中要根據(jù)蛋白質(zhì)的特性采取相應(yīng)的方法。在諸多分析方法中使用的最多的是比色法。下面分別簡(jiǎn)單介紹各種定量分析的基本原理和方法。第四頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三1.3測(cè)定基本條件待測(cè)溶液在一定的波長(zhǎng)照射下會(huì)產(chǎn)生光吸收，在一定的濃度范圍內(nèi)光吸收值的大小與溶液濃度成正比。因此只要測(cè)出待測(cè)溶液的光吸收值和基準(zhǔn)溶液的光吸收值。便可知道待測(cè)溶液的濃度，推算出蛋白質(zhì)的含量。比色分析要考慮以下幾個(gè)條件：(1)溶液在蛋白質(zhì)的定量分析中，大部分都足采用比色法，而比色法的溶液可分兩大類(lèi)，即一類(lèi)是有色溶液，另一類(lèi)是無(wú)色溶液。第五頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三1.

a.有色溶液這是根據(jù)蛋白質(zhì)與某些化中試劑反應(yīng)生成的一類(lèi)有色溶液，該溶液能與單色光具有互補(bǔ)作用，生成互補(bǔ)色。利用光的互補(bǔ)原理進(jìn)行比色測(cè)定。有色溶液包括以下二種本色溶液：蛋白質(zhì)分子中含有變色基團(tuán)或顯色基團(tuán)，在溶液中會(huì)產(chǎn)生顏色，如血紅蛋白，血藍(lán)蛋白，鐵蛋白，細(xì)胞色素C等。顯色溶液：蛋白質(zhì)與某些化學(xué)試劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色，如雙縮脲，福林酚，茚三酮等試劑。染色溶液：蛋白質(zhì)與某些燃料結(jié)合，被染上顏色，如考馬斯亮藍(lán)，氨基黑等染料。第六頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三b.無(wú)色溶液根據(jù)蛋白質(zhì)分子中含有芳香族氨基酸，在280nm處有最大吸收峰，肽鍵在215nm處有最大吸收峰，利用最大吸收峰的特性進(jìn)行比色測(cè)定。第七頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三(2)單色光單色光的互補(bǔ)性：有色溶液與相應(yīng)的單色光生成新的互補(bǔ)色第八頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三(4)朗伯-比耳定律(Lambert-Beer)

朗伯-比耳定律(Lambert-Beer)，也稱(chēng)之為光吸收定律。比色測(cè)定要完全遵循朗伯-比耳定律。是指在一定的濃度范圍，溶液的濃度與光吸收值成正比。用公式表示為：

光吸收值(A)=lg(1/T)=KCLT為透射比，K為常數(shù)，C為溶液濃度，L為光程（吸收層厚度）朗伯-比耳定律同時(shí)反映了溶液厚度L和濃度C對(duì)光吸收的關(guān)系，測(cè)定的光吸收值隨光的波長(zhǎng)、溶液濃度和溶液的性質(zhì)不同而變化。第九頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三2測(cè)定方法：2.1比色測(cè)定2.1.1雙縮脲法：(1)原理蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵(CO-NH-)，因此，具有雙縮脲反應(yīng)的特性。在堿性溶液中蛋白質(zhì)與Cu2+形成紫紅色的絡(luò)合物，絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正。所以它是蛋白質(zhì)和肽類(lèi)物質(zhì)的特異性測(cè)定方法。但此法測(cè)定靈敏度不高，一般測(cè)試濃度在1-10mg之間，尤其適合于肽類(lèi)物質(zhì)的測(cè)定。第十頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三(2)方法：將蛋白溶液和雙縮脲試劑顯色反應(yīng)，然后在540nm處比色測(cè)定，以牛血清清蛋白或者以被測(cè)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)影響因素：干擾雙縮脲測(cè)定的因素包括：在性質(zhì)上類(lèi)似于氨基酸的化合物，如有機(jī)胺類(lèi)肽的緩沖劑，如Tris緩沖劑，可使Cu2+還原，出現(xiàn)紅色沉淀物，干擾測(cè)定。第十一頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三2.1.2福林-酚(Lowry)法：(1)原理：福林-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)是在雙縮脲法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。是在堿性溶液中蛋白質(zhì)與Cu2+形成紫紅色的絡(luò)合物，然后該絡(luò)合物再與還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑反應(yīng)產(chǎn)生深藍(lán)色溶液。此法適合于蛋白類(lèi)的定量分析，靈敏度較高，測(cè)試范圍在25-250μg之間，但專(zhuān)一性不強(qiáng)。(2)方法：將蛋白溶液利福林-酚試劑生成顏色反應(yīng)，然后在640nm處比色測(cè)定，以牛血清清蛋白或者以被測(cè)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)影響因素：干擾此測(cè)定的因素包括：在性質(zhì)上類(lèi)似于氨基酸或肽的緩沖劑。如呈色反應(yīng)，Cu2+容易被還原，出現(xiàn)紅色沉淀物，干擾測(cè)定。

第十二頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三

2.1.3考馬斯亮藍(lán)法：(1)原理：考馬斯亮藍(lán)G250是一種甲基取代的二苯基甲烷，分子中含有多個(gè)磺酸基的染料，在465nm處有最大光吸收值。考馬斯亮藍(lán)G250的磺酸基能與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，引起該染料的最大光吸收值的位置發(fā)生位移，移至595nm處出現(xiàn)最大光吸收值。由于蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物具有很強(qiáng)的光吸收，可大大提高測(cè)定蛋白質(zhì)的靈敏度，對(duì)蛋白類(lèi)的定量分析，最低測(cè)試量在1μg以上。第十三頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三(2)方法：將蛋白溶液和考馬斯亮藍(lán)G-250試劑反應(yīng)生成深藍(lán)色，然后在595nm處比色測(cè)定。以牛血清清蛋白或者以被測(cè)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)影響因素：某些去污劑如Triton-100，SDS等對(duì)測(cè)定均有一定的干擾。

第十四頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三2.2紫外光吸收法：2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線法(1)原理：蛋白質(zhì)分子中含有芳香族氨基酸(苯丙氨酸，酪氨酸，組氨酸的等)，在280nm處有最大吸收峰。蛋白質(zhì)在最大吸收峰λmax波長(zhǎng)處的吸光值的強(qiáng)弱與蛋白的濃度成正比。這種方法適合于蛋白質(zhì)分子中含有較多芳香族氨基酸的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析，對(duì)某些含芳香族氨基酸較少的蛋白質(zhì)，測(cè)定靈敏度較低，如膠原蛋白。第十五頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三(2)方法：在實(shí)際工作中紫外光吸收法最常用的一種蛋白質(zhì)方法，它是以配制一系列不同濃度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液．以不含被測(cè)蛋白的溶液為參比溶液，在同樣條件下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，將測(cè)得的數(shù)據(jù)繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后在同樣條件下測(cè)定未知樣品的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得未知樣品的濃度。此法測(cè)量比較準(zhǔn)確，但使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線隔一段時(shí)間進(jìn)行校正。第十六頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三2.2.2消光系數(shù)法：(1)原理：蛋白質(zhì)分子中含有芳香族氨基酸，在280nm處的特定吸光值。蛋白質(zhì)分子中所含氨基酸數(shù)量不同，它們?cè)?80nm處吸光值的強(qiáng)弱就有差異。因此，每一種純的單一蛋白質(zhì)在280nm處有一個(gè)特定的消光系數(shù)。如果已知某個(gè)蛋白質(zhì)的消光系數(shù)，只要在280nm處測(cè)定出該蛋白吸光值就可以計(jì)算出其相應(yīng)的含量。計(jì)算公式如下：第十七頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三

測(cè)得吸光值×N×1000測(cè)得吸光值×N×10蛋白質(zhì)濃度(mg/m1)==

消光系數(shù)×100消光系數(shù)

式中的N為稀釋倍數(shù)，10是常數(shù)，是指在標(biāo)定消光系數(shù)時(shí)，蛋白溶液的濃度為100ml溶液中含有1000mg蛋白質(zhì)，在計(jì)算公式中約分得到常數(shù)10。

第十八頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三例如：胰蛋白酶的消光系數(shù)是13.5。將胰蛋白酶溶液稀釋100倍，測(cè)得的光吸收值是0.27，通過(guò)上述公式計(jì)算其濃度。

0.27×100×10

蛋白質(zhì)濃度(mg/m1)==2013.5

第十九頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三

(2)方法：將待測(cè)蛋白稀釋成一定濃度在280nm處測(cè)定吸光值(測(cè)得的吸光值處落在0.1-1.0范圍內(nèi))。(3)影響因素：在蛋白質(zhì)的混合溶液中或在280nm有干擾物質(zhì)存在時(shí)，對(duì)該溶液測(cè)定均有較大的影響。不具有普遍性。測(cè)試靈敏度所不同。第二十頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三2.2.3F因子測(cè)定法(1)原理：由于蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此，蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。最大吸收峰的波長(zhǎng)在280nm處。而在波長(zhǎng)260nm處光吸收較弱。這兩種波長(zhǎng)吸光值的強(qiáng)弱與濃度成正比。通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)溶液在280nm和260nm處的光吸收值，求出A280/A260的比值，從表中查出F因子，通過(guò)計(jì)算公式可以計(jì)算出待測(cè)蛋白質(zhì)的含量。第二十一頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三

蛋白質(zhì)濃度(mg/m1)=F×(l/d)×A280×NF：F因子

d：比色杯的厚度

N：稀釋倍數(shù)(2)方法取一定濃度的蛋白溶液，分別測(cè)定280nm和260nm處的光吸收值。求出A280/A260的比值，從F因子表中查出F因子。紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量A280／A260的比值與F因子的關(guān)系見(jiàn)表1第二十二頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三

表1紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量F因子表1A280/A269F因子A280/A269F因子1.751.1160.8460.6561.631.0810.8220.6321.521.0540.8040.6071.401.0230.7840.5851.360.9940.7670.5651.300.9700.7520.5451.250.9440.7300.5081.160.8990.7050.4781.090.8520.6710.4221.030.8140.6440.3770.9790.7760.6150.3220.9390.7430.5950.2780.8740.682

第二十三頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三2.3定氮法4.3.1凱氏定氮法：(1)原理：因?yàn)槊恳环N蛋白質(zhì)都有其恒定的含氮量(約為14-16％)，只要測(cè)出其氮元素的含量就可以推算出其蛋白質(zhì)的量。因此，可以通過(guò)測(cè)定有機(jī)化合物或蛋白質(zhì)分子中氮元素的含量來(lái)推算蛋白質(zhì)的含量。計(jì)算公式如下：蛋白質(zhì)(mg/ml)=測(cè)得的含氮量×14×6.25

凱氏定氮法是將含氮有機(jī)化合物或蛋白質(zhì)與濃硫酸共熱硝化，有機(jī)氮轉(zhuǎn)變成氨，氨又與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，硫酸銨在堿性條件下被分解，放出氨氣，用水蒸汽蒸餾將氨氣蒸出，硼酸吸收，然后用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液進(jìn)行滴定。第二十四頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三

(2)實(shí)驗(yàn)方法：蛋白質(zhì)→消化→氨→硫酸銨→氨→硼酸銨→滴定→含氮量→蛋白質(zhì)含量。凱氏定氮法是一種經(jīng)典方法，靈敏度高，使用的儀器比較簡(jiǎn)單，但操作比較繁瑣，影響的因素較多，日前使用的不多。(3)影響因素:空氣中的氨氣,標(biāo)準(zhǔn)堿的濃度第二十五頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三凱氏定氮裝置1.安全管2.導(dǎo)管3.汽水分離管4.樣品入口5.塞子6.冷凝管7.吸收瓶8.隔熱液套9.反應(yīng)管10.蒸汽發(fā)生瓶第二十六頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三2.3.2原子吸收光譜法(1)原理：基本理是通過(guò)原子燈發(fā)出的被測(cè)元素的特征譜線在通過(guò)原子化器時(shí)，被待測(cè)元素的基態(tài)原子所吸收，使原子燈發(fā)出的被測(cè)元素的特征譜線強(qiáng)弱發(fā)生改變，通過(guò)檢測(cè)特征譜線的變化來(lái)測(cè)定原子吸收光譜，利用這些光信號(hào)的變化的強(qiáng)弱測(cè)定化合物中各種元素的含量。利用這一性質(zhì)，通過(guò)原子吸收光譜儀測(cè)定蛋白質(zhì)中的氮元素便可計(jì)算出蛋白質(zhì)的量。(2)方法：通過(guò)原子吸收光譜儀直接測(cè)定蛋白質(zhì)的氮元素，或者通消化后測(cè)定消化液中氮元素。這種經(jīng)典方法的測(cè)試靈敏度高，操作比較簡(jiǎn)單，但需要大型的原子光譜儀，一般的實(shí)驗(yàn)室不具備。第二十七頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三2.4重量法：(1)原理：在溶液中同時(shí)存在揮發(fā)性溶劑和非揮發(fā)溶質(zhì)，結(jié)冰的溶劑在高真空度的條件下直接升華，溶質(zhì)被干燥，獲得蛋白質(zhì)干粉，然后進(jìn)行重量分析。(2)方法：精確吸取一定的蛋白質(zhì)溶液凍干，恒重后，稱(chēng)重，即得蛋白質(zhì)重量。這種方法適用于比較珍貴的樣品，重量法要求的天平的精度比較高。

第二十八頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三3定量分析應(yīng)注意的問(wèn)題要使分析方法有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，選擇最佳的測(cè)定條件：是十分重要。它包括儀器測(cè)量，試樣反應(yīng)和參比溶液等條件。2.1光學(xué)儀器的最小測(cè)量誤差：任何分光光度計(jì)都有一定的測(cè)量誤差，這是由于光學(xué)系統(tǒng)穩(wěn)定性的差異所造成的，實(shí)驗(yàn)條件的瞬間變化，導(dǎo)致讀數(shù)波動(dòng)，對(duì)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性有一定的影響，尤其是試樣濃度過(guò)高或過(guò)低均會(huì)引起的誤差。因此，測(cè)定時(shí)合適的吸光度測(cè)量范圍是很重要的。根據(jù)Lamber-Beer定律，可以推出測(cè)定結(jié)果的相對(duì)誤差。第二十九頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三

若要使測(cè)定結(jié)果的相對(duì)誤差最小，通過(guò)Lamber-Beer定律的方程解，從理論上得出相對(duì)誤差最小值是：吸光度(A)=0.434

透光率(T)=36.8％。

也就是說(shuō)吸光度讀數(shù)應(yīng)控制在光譜儀上最靈敏的范圍內(nèi)，

(A)=0.434、(T)=36.8％。是儀器誤差最小的。第三十頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三

濃度測(cè)量的相對(duì)誤差與溶液透射率(T)的關(guān)系如圖所示：圖1

第三十一頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三3.2比色測(cè)定呈色反應(yīng)在定量分析中，有許多物質(zhì)的測(cè)定是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)生成顏色后再進(jìn)行比色測(cè)定，一般要注意下列問(wèn)題(1)顏色反應(yīng)后的生成物必須在選定測(cè)定波長(zhǎng)有較大的光吸收(2)顏色反應(yīng)后生成物理化性質(zhì)必須穩(wěn)定，顯色條件容易控制，重復(fù)性好(3)對(duì)照性好，反應(yīng)物和生成物之間的最大吸收波長(zhǎng)之差，差值一般要在60nm以上。第三十二頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三

3.3參比溶液的選擇根據(jù)樣液的性質(zhì)不同，可選擇不同的參比溶液。(1)溶劑參比：當(dāng)樣液的組分比較簡(jiǎn)單，與其它組分共存對(duì)所測(cè)定波長(zhǎng)無(wú)任何吸收劑為參比。(2)溶液參比：參與反應(yīng)的試劑在所測(cè)定波長(zhǎng)部分干擾，可按照顯色反應(yīng)的條件，選用不加被測(cè)試樣品的溶液為參比。(3)純水參比：試樣與共存組分在測(cè)定波長(zhǎng)均有較大的吸收，可選用水為空白，先測(cè)出試樣和對(duì)照的光吸收值，然后用試樣的吸收值減去對(duì)照的光吸收值即可。第三十三頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三.

4定量分析小結(jié)

方法機(jī)理關(guān)鍵技術(shù)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)比色法光互補(bǔ)色呈色反應(yīng)應(yīng)用廣泛影響因素多紫外法最大吸收峰蛋白質(zhì)純度操作簡(jiǎn)單基準(zhǔn)物有局限定氮法轉(zhuǎn)化氮元素蛋白質(zhì)消化結(jié)果準(zhǔn)確步驟繁瑣重量法冰點(diǎn)升華樣品恒重結(jié)果準(zhǔn)確專(zhuān)一性差第三十四頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三第二節(jié)蛋白質(zhì)純度1概念1.1蛋白質(zhì)純度蛋白質(zhì)的純度分析，是從蛋白質(zhì)樣品中確定目標(biāo)蛋白和雜質(zhì)的分析方法，也是蛋白質(zhì)分析中的一類(lèi)重要方法。任何一個(gè)蛋白質(zhì)制品從理論上說(shuō)都含有二類(lèi)組分，即蛋白質(zhì)和雜質(zhì)。蛋白質(zhì)：是樣品中主要的成分，是分析的目標(biāo)蛋白雜質(zhì)：是殘留的非目標(biāo)蛋白和殘留的小分子，無(wú)機(jī)鹽等因此，蛋白質(zhì)純度分析方法大致分為兩類(lèi)。第三十五頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三(1)目標(biāo)蛋白與雜蛋白的分析(2)目標(biāo)蛋白與非蛋白的分析從廣義上說(shuō)蛋白質(zhì)純度一般是指樣品中是否含有雜蛋白的，不包括無(wú)機(jī)鹽和有機(jī)小分子的分析鑒定。因?yàn)橛行┑鞍踪|(zhì)要在一定無(wú)機(jī)鹽和有機(jī)小分子的保護(hù)下才比較穩(wěn)定。因此，某些產(chǎn)品中要添加一些小分子化合物。但是如果要進(jìn)行蛋白質(zhì)的含量測(cè)定，則要包括雜蛋白，無(wú)機(jī)鹽和有機(jī)小分子的測(cè)定。第三十六頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三1.2蛋白質(zhì)純度的表示方法一個(gè)天然蛋白或一個(gè)重組蛋白質(zhì)，產(chǎn)品的純度是一個(gè)重要的指標(biāo)。純度的表示方法主要根據(jù)實(shí)際用途區(qū)分。如化學(xué)試劑的純度一樣，主要有化學(xué)純，分析純，優(yōu)級(jí)純等。蛋白質(zhì)的純度通常有兩種方式表示。(1)工業(yè)用的用百分含量表示：如：95％、99％、99.9％(2)實(shí)驗(yàn)室用的以用途表示：有實(shí)驗(yàn)室級(jí)純(1ab)

電泳純(electrophoresis)

色譜純(choromatography)。第三十七頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三2分析的方法：2.1光譜法：2.1.1光譜掃描法：一種純度的蛋白質(zhì)溶液在一定的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描就會(huì)得到一個(gè)特征吸收光譜，可以根據(jù)掃描光譜的吸收曲線的形狀，吸收峰的位置，數(shù)量和大小判斷該蛋白的純度。用紫外吸收光譜測(cè)定樣品的純度，既方便又靈敏，測(cè)得結(jié)果可靠，是常用的純度分析方法。光譜分析的特點(diǎn)：主要是鑒別目標(biāo)蛋白質(zhì)和非蛋白類(lèi)雜質(zhì)。第三十八頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三

2.1.2光吸收比值法：一種純物質(zhì)在紫外光區(qū)有其最大光吸收峰，如核酸的最大吸收峰在260nm，蛋白質(zhì)的最大吸收峰在280nm。同一溶液在這兩種波場(chǎng)下測(cè)得的光吸收值是不同的。利用在280nm和260nm處測(cè)得的光吸收值之比，即可得到蛋白質(zhì)的純度。如純核酸的標(biāo)準(zhǔn)光吸收比為A280/A260=0.5、純蛋白的標(biāo)準(zhǔn)光吸收比為A280/A260=1.8。特點(diǎn)：僅限于蛋白質(zhì)溶液中含有核酸或核酸溶液中含有蛋白質(zhì)的純度測(cè)定。

含有核酸的蛋白質(zhì)溶液，可分別測(cè)定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的經(jīng)驗(yàn)公式，即可算出蛋白質(zhì)的濃度。蛋白質(zhì)濃度=1.45×A280－0.74×A260(mg/ml)此經(jīng)驗(yàn)公式是通過(guò)一系列已知不同濃度比例的蛋白質(zhì)（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所測(cè)定的數(shù)據(jù)來(lái)建立的第三十九頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三

2.2層析法：2.2.1原理：一個(gè)純的蛋白質(zhì)在穩(wěn)定的層析條件下，得到的保留值只有一個(gè)，如果得到的層析峰多于一個(gè)就可以視為不純。所以根據(jù)層析峰的數(shù)量判斷物質(zhì)的純度。層析法鑒定蛋白質(zhì)純度的方法有：(1)保留值法在一定的層析條件下各種蛋白質(zhì)組分在層析柱內(nèi)的保留值是一定的，通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)的層析保留值(保留時(shí)間，保留體積)就能確定蛋白質(zhì)組分，從而可以判斷蛋白質(zhì)的純度。如：排阻層析根據(jù)蛋白質(zhì)不同的分子量可得到不同的保留體積，若流速恒定的條件下，其保留時(shí)間也是一定的。圖2

第四十頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三第四十一頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三

(2)基準(zhǔn)物標(biāo)定法：已知物內(nèi)標(biāo)法，在被鑒定物的樣品中加入己知基準(zhǔn)物，稱(chēng)內(nèi)標(biāo)物。通過(guò)層析分離，從得到的層析峰的增高或峰的位置來(lái)判斷。圖3第四十二頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三

第四十三頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三

2.2.2層析的模式層析分析鑒定法的方法很多，但根據(jù)層析的分離機(jī)理利方法來(lái)分類(lèi)，大致可分為以下幾類(lèi)。根據(jù)蛋白質(zhì)質(zhì)量和分子形狀的層析分離模式根據(jù)蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)多少和分子極性的差異的層析分離模式根據(jù)蛋白質(zhì)的帶電荷多少和分子吸附基團(tuán)的差異的層析分離模式。常用的分離模式有：排阻層析疏水層析吸附層析高效液相第四十四頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三(4)幾種色譜方法的比較方法機(jī)理關(guān)鍵技術(shù)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)排阻層析分子量分離層析介質(zhì)應(yīng)用廣泛分析時(shí)間長(zhǎng)疏水層析極性分離緩沖溶液分離度好鹽濃度較高吸附層析電荷分離介質(zhì)性質(zhì)通用性好條件難控制高效液相極性分離溶劑系統(tǒng)靈敏度高高純有機(jī)溶劑第四十五頁(yè)，共五十二頁(yè)，編輯于2023年，星期三2.3電泳法：2.3.1原理：一個(gè)純的蛋白質(zhì)在一定的電泳條件下得到的電泳圖譜只有一個(gè)條帶，如聚丙烯酰胺電泳(PAGE)。所以根據(jù)蛋白質(zhì)的電泳條帶的數(shù)量判斷蛋白質(zhì)純度。2.3.2方法：電泳鑒定蛋白質(zhì)純度的方法有:

凈電荷電泳(PAGE)SDS-電泳(SDS)

等電聚焦電泳(IEF)