第四章藥物含量測定方法驗證演示文稿

第四章藥物含量測定方法驗證演示文稿當前1頁，總共46頁。優(yōu)選第四章藥物含量測定方法驗證當前2頁，總共46頁。

第二節(jié)

定量分析樣品的前處理方法

一、概述

1.為什么要對定量分析的樣品進行前處理？

含鹵素、氮、硫、磷等有機藥物R-X（F，Cl,Br,I，N）

金屬有機藥物R-O-Me（有機酸或酚的含金屬有機藥物金屬鹽；結合不牢固）

有機金屬藥物R-Me

（結合牢固）

2.常用的處理方法不經有機破壞的分析方法藥物分析中常用的分析方法經有機破壞的分析方法當前3頁，總共46頁。（一）直接測定法例如：富馬酸亞鐵

溶于熱稀礦酸，采用鈰量法，鄰二氮菲作指示劑

二、不經有機破壞的分析方法當前4頁，總共46頁。（二）經水解后測定法

1.直接回流后測定法例如：三氯叔丁醇的含量測定

CCl3-C(CH3)2-OH+4NaOH(CH3)2CO+3NaCl+HCOONa+2H2ONaCl+AgNO3AgCl+NaNO3AgNO3+NH4SCNAgSCN+NH4NO3

2.用硫酸水解后測定法例如：硬脂酸鎂的含量測定

Mg(C17H35COO)2+H2SO4

MgSO4+2C17H35COOH

H2SO4+2NaOHNa2SO4

+2H2O

△二、不經有機破壞的分析方法當前5頁，總共46頁。（三）經氧化還原后測定法1、碘他拉酸的含量測定

2.碘番酸、膽影酸、膽影葡胺注射液、泛影酸、泛影酸納及泛影葡胺注射液的含量測定Zn還原，后銀量法二、不經有機破壞的分析方法當前6頁，總共46頁。3.利用藥物中可游離的金屬離子的氧化性測定含量

（1）含銻藥物例如：葡萄糖酸銻的含量測定

Sb5++2KISb3++2K+

++I2I2+2Na2S2O32NaI+Na2S4O6

（2）含鐵藥物2Fe3++2KI2Fe2++2K++I2I2+2Na2S2O32NaI+Na2S4O6H+二、不經有機破壞的分析方法當前7頁，總共46頁。

濕法破壞

藥物分析中常用的有機破壞的方法有

HNO3-HClO4法干法破壞(一)濕法破壞HNO3-H2SO4法

H2SO4-硫酸鹽法（凱氏定氮法）

HNO3-H2SO4-HClO4法；H2SO4-H2O2；H2SO4-KMnO4(二)干法破壞加Na2CO3或MgO以助灰化；溫度控制在420℃分為：高溫熾濁法和氧瓶燃燒法

三、經有機破壞的分析方法含氮有機藥物當前8頁，總共46頁。凱氏定氮法在催化劑作用下，用硫酸破壞有機物，使含氮物轉化成硫酸銨。加入強堿進行蒸餾使氨逸出，用硼酸吸收后，再用酸滴定，測出氮含量。1.原理2.包括四個過程：消化、蒸餾、吸收、滴定當前9頁，總共46頁。2.反應過程1.有機物中的氮在強熱和

濃H2SO4作用下，消化生成無機氮

NH2CHCOOH+2H2SO4=SO2+H2O+2CO2+NH3

2NH3+H2SO4=(NH4)2SO4

2.在凱氏定氮器中與堿作用，通過蒸餾釋放出NH3(NH4)2SO4+2NaOH=Na2SO4+2NH4OH

4.用已知濃度的HCI標準溶液滴定，根據(jù)HCI消耗的量計算出氮的含量。NH4H2BO3

+HCl=H3BO3+NH4Cl3.

NH3收集于H3BO3

溶液中。NH3+H3BO3=NH4H2BO3當前10頁，總共46頁。3.反應裝置當前11頁，總共46頁。4.反應試劑1、消化液：硫酸2、催化劑：硫酸銅、硫酸鉀3、堿溶液：40%氫氧化鈉4、吸收液：2%硼酸5、混合指示劑：（1：1）乙醇溶液

0.1%甲基紅：0.1%溴甲酚綠6、標準滴定液：0.2MHCL當前12頁，總共46頁。

5.各種試劑的作用硫酸：

1.脫水。使有機物炭化，生成C

2.氧化。H2SO4將C、H氧化為CO2和H2O蒸汽逸出，本身還原為SO2，而藥物則分解成無機氮，并與硫酸結合成硫酸銨，留在酸性溶液中當前13頁，總共46頁。硫酸銅：1.催化劑加速反應硫酸銅，氧化汞或硒粉作為催化劑以及加入少量過氧化氫作為氧化劑，次氯酸鉀防止污染。通常使用硫酸銅。2.堿性反應指示劑

有機物全部消化后，出現(xiàn)硫酸銅的蘭綠色，可以作為指示劑。

當前14頁，總共46頁。40%氫氧化鈉

堿性條件下，使硫酸銨釋放出氨氣。加入氫氧化鈉溶液要過量；要防止樣液中氨氣逸出。硼酸H3BO3：半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收氨的作用。硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影響指示劑變色反應。

鹽酸：HCl滴定液常量法中取0.1M比較合適，半微量法中則在0.02～0.05M之間比較合適。

當前15頁，總共46頁。6.注意事項取樣量：

常量法：相當于含氮量2530mg半微量法：相當于含氮量1.02.0mg2.蒸餾加濃堿NaOH，加的量為H2SO4量的4倍常量分析：≥80mlNaOH，25ml的2%硼酸，半微量分析：例如10ml樣品，10mlNaOH，

10ml2%硼酸3.硼酸保持過量。4.標準酸濃度：一般常量用0.1mol/L

半微量用0.05mol/L

微量用0.01mol/L當前16頁，總共46頁。氧燃瓶燃燒法(oxygenflaskcombustionmethod)1.原理將含有待測元素的有機藥物放入充滿氧氣的密閉燃燒瓶中進行燃燒，使有機結構部分徹底分解為二氧化碳和水，而待測元素根據(jù)電負性的不同轉化為不同價態(tài)的氧化物（或無氧酸），被吸收于適當?shù)奈找褐?，然后根?jù)欲測物質的性質，采用適宜的分析方法進行檢查或定量測定。當前17頁，總共46頁。適用范圍：含鹵素、硫、氮、硒等有機藥物的分析。特點：簡便、快速、破壞完全，尤其適用于微量樣品的分析。2.氧燃瓶燃燒法的適用范圍及特點當前18頁，總共46頁。

3.儀器裝置燃燒瓶為500、1000或2000ml無色、磨口、厚壁、硬質玻璃錐型瓶瓶塞空心底部熔封鉑絲一根，下端呈螺旋狀或網狀當前19頁，總共46頁。

4.稱樣用材料及稱樣

A.固體樣品無灰濾紙

B.液體樣品紙袋

C.軟膏類樣品：將適量樣品置不含被測成分的蠟油紙中包裹嚴密，外層再用無灰濾紙包裹當前20頁，總共46頁。當前21頁，總共46頁。5.吸收液

作用將樣品經燃燒分解所產生的各種價態(tài)的鹵素、硫、氮、硒等，定量地吸收并轉變?yōu)橐欢ǖ谋阌跍y定的價態(tài)

吸收液的選擇氟水（HF)

氯

NaOH溶液（HCl溶解度低）溴

H2O2-NaOH（NaOH-硫酸肼飽和溶液碘

NaOH－硫酸肼飽和溶液硫

NaOH或H2O2

硒硝酸溶液當前22頁，總共46頁。6.操作方法①燃燒瓶燃燒前的準備：用洗液洗凈后，按各藥品項下的規(guī)定加入吸收液，將瓶口用水濕潤，小心急速地通入氧氣1min，立即用表面皿覆蓋瓶口。②樣品的準備：取樣品適量，精密稱定后按規(guī)定方法包裹，固定于鉑絲下端的網內或螺旋處。③樣品的燃燒：點燃包有供試品的濾紙尾部，迅速放入燃燒瓶中，按緊瓶塞，加水少量封閉瓶口，俟燃燒完畢（應無黑色碎片），充分振搖，使生成的煙霧完全吸入吸收液中，放置15min，用水少量沖洗瓶塞及鉑絲，合并洗液及吸收液，同法另做空白試驗。然后按各藥品項下規(guī)定的方法進行鑒別、檢查或含量測定。當前23頁，總共46頁。①根據(jù)被燃燒分解的樣品量選用適宜大小的燃燒瓶。ChP（2005）規(guī)定的燃燒瓶體積為500、1000或2000ml三種，采用常量或半微量分析。（4）注意事項

當前24頁，總共46頁。

待分解樣品量

燃燒瓶的體積3~5mg（微量分析）150~250ml20~30mg（半微量分析）300~500ml50~60mg1000ml0.6~0.7g或更多2000ml或特殊結構的燃燒瓶當前25頁，總共46頁。

正確選用燃燒瓶的目的在于：樣品能在足夠的氧氣中燃燒分解完全；有利于將燃燒分解產物較快地吸收到吸收液中；防止爆炸的可能性。②測定含氟有機藥物時，用石英制燃燒瓶③鉑絲燃燒時起催化作用④應同時做空白試驗⑤燃燒時要注意防爆⑥燃燒要完全⑦燃燒產生的煙霧完全被吸收當前26頁，總共46頁。應用示例：碘苯酯的測定返回當前27頁，總共46頁。（二）數(shù)據(jù)要求

回收率%=（測定平均值—空白值）/加入量×100%要求制備高、中、低三濃度的樣品，各測定3次。應報告已知加入量的回收率，或測定結果平均值與真實值之差及其可信限。當前28頁，總共46頁。

第三節(jié)藥品質量標準分析方法驗證一、準確度

是指用該方法測定結果與真實值接近的程度，用回收率表示（一）含量測定方法的準確度1.原料藥可用已知純度對照品或樣品進行測定；或與已建準確度的另一方法測定的結果進行比較。2.制劑要考察輔料對回收率的影響。采用在空白輔料中加入原料對照品的方法作回收率試驗，然后計算RSD。

具體做法：測定高、中、低三個濃度，n=3,共9個數(shù)據(jù)來評價回收率的RSD＜2%；用UV和HPLC發(fā)時，一般回收率可達98%～102%；容量法可達99.7%～100.3%

當前29頁，總共46頁。二、精密度

是指在規(guī)定的測試條件下，同一個均勻樣品，經多次測定結果之間的接近程度。

（一）精密度表示方法1.偏差(deviation,d)d=測得值-平均值=Xi-X

2.標準偏差（standarddeviation,SD或S）

S=[(∑Xi–X)2/(n-1)]1/23.相對標準差(relativestandarddeviation,RSD)也稱變異系數(shù)(coefficientofvariation,CV)RSD=標準偏差/平均值×100%=S/X×100%當前30頁，總共46頁。（二）重復性、中間精密度及重現(xiàn)性1.重復性在相同條件下,由一個分析人員測定所得結果的精密度.2.中間精密度在同一個實驗室，不同時間由不同分析人員用不同設備測定結果的精密度。3.重現(xiàn)性在不同實驗室由不同分析人員測定結果的精密度。當前31頁，總共46頁。（三）數(shù)據(jù)要求

應報告S或SD、RSD和可信限。用統(tǒng)計學的可信性分析(t或f）。當前32頁，總共46頁。

三、專屬性是指在其他成分(如雜質、降解產物、輔料等)可能存在下，采用的方法能準確測定出被測物的特性。鑒別反應、雜質檢查、含量測定方法，均應考察其專屬性。

（一）鑒別反應應能與其它共存的物質或相似化合物區(qū)分，不含被測組分的樣品均應呈現(xiàn)負反應。當前33頁，總共46頁。（二）含量測定和雜質測定色譜法和其他分離法，應附代表性的圖譜，以說明專屬性。

圖中應注明各組分的位置，色譜法中分離度應符合要求。在能獲得雜質的情況下，可加到試樣中，考察對結果的干擾。在雜質和降解物不能獲得的情況下，可用以驗證方法和藥典方法進行對照；也可用對試樣加速破壞的方法，比較兩種方法。當前34頁，總共46頁。四、檢測限（limitofdetection,

LOD)是指試樣中被測物能被檢測出的最低濃度或量，是限度檢驗指標。它無需測定，只要指出高于或低于該規(guī)定的濃度或量即可。（一）常用的方法

1.非儀器分析目視法用已知濃度被測物，試驗出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。2.儀器分析方法

UV法：LOD=f.3S空=C樣/A樣×

3S空

Flu法：LOD=f.3S空=C樣/(F樣-F空)×

3S空

GC和HPLC法：

LOD=S/N=2或3

當前35頁，總共46頁。（二）數(shù)據(jù)要求應附測試圖，說明測試過程和檢測限結果。當前36頁，總共46頁。

五、定量限（limitofquantitation,

LOQ)

是指樣品中被測物能被定量測定的最低量，其測定結果應具一定準確度和精密度。雜質和降解產物進行定量測定時，要求

LOQ.常用信噪比法確定定量限，一般以S/N=10時相應的濃度進行測定。當前37頁，總共46頁。

六、線性

是指在設定的范圍內，測試結果與試樣中被測物濃度直接呈正比關系的程度。

UV法：首先制備一個標準系列，濃度點n=5;A=0.3～.0.7

建立回歸方程C=aA+b;r＞0.9999。HPLC法：制備一個標準系列，濃度點n=5～7;以C對h或A或與內標物的峰面積之比，建立回歸方程r＞0.9999。當前38頁，總共46頁。七、范圍

是指達到一定精密度、準確度和線性、測試方法適用的高低限度或量的區(qū)間。

原料藥和制劑含量測定：范圍應為測試濃度的80%-～120%。

制劑含量均勻度檢查：范圍應為測試濃度的70%-～130%。

溶出度或釋放度中的溶出量測定：范圍應為限度的±20%。當前39頁，總共46頁。

八、耐用性

是指在測定條件下有效的變動時，測定結果不受影響的承受

程度。典型的變動因素有：被溶液的穩(wěn)定性、樣品提取次數(shù)、時間等。HPLC法變動因素有：流動相組成與pH，色譜柱，柱溫，流速等。

GC法變動因素有：色譜柱，固定相，擔體、柱溫、進樣口和檢測器溫度等。當前40頁，總共46頁。

分析方法效能指標的具體應用：1.用于鑒別試驗的方法：只要求專屬性、耐用性，其余不要求。2.用于原料藥中雜質測定和制劑中降解產物測定的方法：①用于定量：除了檢測限不要求外，其余七項指標均要求。②限