動物細胞工程-藥生所

世界生物醫(yī)藥發(fā)展概況自上世紀90年代以來，生物醫(yī)藥市場增速一直都維持在全球藥品市場增速的2-3倍。以2007年為例，全球生物技術(shù)藥物年銷售額同比增長12.5%，總額突破750億美元，這一增速是2007年全球藥品市場增速（6.4%）的兩倍?？贵w藥物是近年來增長率最快的生物技術(shù)藥物，全球年銷售額從1997年的3.1億美元上升到2007年的270億美元，十年內(nèi)增長了87倍。抗體藥物在生物藥物產(chǎn)業(yè)中所占份額也從2000年的1/5上升到2007年的1/3，且年均增長12.4%，遠遠高于全球制藥行業(yè)6%的增長水平。經(jīng)濟學(xué)家們預(yù)計2007～2012年的抗體藥物年平均銷售額增長率將保持在14%左右，實際超過預(yù)計。第一頁，共77頁。Epogen(EPO,促紅細胞生成素)Humulin（胰島素）Intron-A(α-IFN,α-干優(yōu)素)Engreix-B(乙肝疫苗)Cerezyme(葡萄腦苷脂酶)Activase(t-PA,組織纖維蛋白溶酶原激活劑)Humatrope(hGH,生長激素)Reopro(抗Gpllb/IIIa抗體)Avonex(IFNβ-la,β-la干擾素)Protropin/Nutropi(somatrem/somatropin)Pulmozyme(α-鏈球菌DNA酶)Proleukin(IL-2,白介素-2)Leukine(GM-CSF,粒細胞巨噬細胞集落刺激因子)早期上市的主要生物技術(shù)產(chǎn)品第二頁，共77頁。由培養(yǎng)動物細胞產(chǎn)生的部分藥品產(chǎn)品臨床用途產(chǎn)生細胞干擾素癌癥、病毒感染 Namalwa干擾素癌癥、病毒感染 CHOEPO貧血 CHOtPA溶血栓CHOVIII因子 血友病CHO乙肝表面抗原疫苗CHO人生長激素侏儒癥CHOGCSF化療解救CHO單抗OKT3腎移植 雜交瘤第三頁，共77頁。當前的生物技術(shù)研究前沿生物醫(yī)藥學(xué)科綜合治療性抗體組織工程技術(shù)生物藥遞送技術(shù)RNAi藥物基因治療天然藥物合成生物學(xué)干細胞治療新型疫苗第四頁，共77頁。2010年全球生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)IMSHealthMarketprognosis血液制品9.0%抗體14.2%診斷試劑18.0%疫苗9.4%基因工程藥物49.4%第五頁，共77頁。生物醫(yī)藥在全球前十大藥品中的排名銷售排名2002年2008年2014年名稱類別名稱類別名稱類別1Atorvastatin小分子Lipitor小分子Avastin單抗2Simvastatin小分子Plavix小分子Humira單抗3Omeprazole小分子Advair小分子Rituxan單抗4Olanzapine小分子Enbrel重組蛋白Enbrel重組蛋白5Amlodipine小分子Remicade單抗Lantus重組蛋白6Erythropoietin生物藥Diovan小分子Herceptin單抗7Lansoprazole小分子Rituxan單抗Crestor小分子8Seroxat小分子Nexium小分子Spiriva小分子9Celebrex小分子Avastin單抗Remicade單抗10Zoloft小分子Herceptin單抗Gleevec小分子GlobalPharmaceuticalMarketReview&WorldTopTen/TwentyDrugs2008第六頁，共77頁。美國FDA已經(jīng)批準或即將批準的治療性抗體藥物年份學(xué)名/商品名特點靶分子用途1986Muromomab/Orthoclone鼠源抗體CD3抗移植排斥反應(yīng)1994Abciximab/ReoPro嵌合抗體GPIIb/IIIa經(jīng)皮穿刺冠狀動脈成形術(shù)，心絞痛1997Rituximab/Rituxan嵌合抗體CD20B細胞非何杰金淋巴瘤，慢性淋巴細胞白血?。?010）1997Daclizumab/Zenapax人源化抗體CD25移植排斥1998Basiliximab/Simulect嵌合抗體CD25移植排斥1998Palivizuma/Synagis人源化抗體RSV嬰幼兒呼吸道合胞病毒1998Infliximab/Remicade嵌合抗體TNF-a潰瘍性結(jié)腸炎，類風濕性關(guān)節(jié)炎1998Trastuzumab/Herceptin人源化抗體HER2乳腺癌，HER2+胃癌（2010）第七頁，共77頁。2000Gemtuzumab/Mylotarg人源化抗體CD33急性復(fù)發(fā)性髓性白血病2001Alemtuzumab/Campath人源化抗體CD52難治性慢性淋巴細胞白血病2002Ibritomomab/Zevalin鼠源抗體CD20難治的B細胞非何杰金淋巴瘤2002Adalimumab/Humira全人源抗體TNF-α銀屑病和銀屑病關(guān)節(jié)炎2003Omalizumab/Xolair人源化抗體IgE重癥哮喘2003Tositumomab/Bexxar鼠源抗體CD20B細胞淋巴瘤2003Efalizumab/Raptiva人源化抗體CD牛皮癬2004Cetuximab/Erbitux嵌合抗體EGFR結(jié)腸直腸癌2004Bevacizumab/Avastin人源化抗體VEGFR結(jié)腸癌2004Natalizumab/Tysabri人源化抗體整合素-α4多發(fā)性硬化病2006Ranibizumab/Lucentis人源化抗體VEGF-A濕性老年性黃斑病2006Panitumumab/Vectibix全人源抗體EGFR結(jié)腸直腸癌第八頁，共77頁。2007Eculizumab/Soliris人源化抗體C5蛋白陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿2008Certolizumab/Cimzia人源化抗體TNF-α風濕性關(guān)節(jié)炎2009Golimumab/Simponi全人源抗體TNF-α類風濕和銀屑病關(guān)節(jié)炎2009Canakinumab/Ilaris全人源抗體IL-1b冷吡啉相關(guān)周期性綜合征2009Ustekinumab/Stelara全人源抗體IL-12,IL23成人中重度銀屑病2009Ofatumumab/Arzerra全人源抗體CD20難治的慢性淋巴細胞白血病2010Tocilizumab/Actemra人源化抗體IL-6受體治療無效的中重度類風關(guān)節(jié)炎2010Denosumab/Prolia全人源抗體RANKL預(yù)防絕經(jīng)期后的婦女骨折2010Denosumab/Xgeva全人源抗體RANKL預(yù)防實體瘤骨轉(zhuǎn)移2011Ipilimumab/Yervoy全人源抗體CTLA-4晚期或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤2011Brentuximabvedotin/Adcetris嵌合抗體CD30霍奇金淋巴瘤，系統(tǒng)性間變性大細胞淋巴瘤2011Belimumab/Benlysta全人源抗體BLyS受體系統(tǒng)性紅斑狼瘡2012Pertuzumab/Perjeta人源化抗體HER-2HER2+的晚期轉(zhuǎn)移性乳腺癌2012Raxibacumab/Abthrax全人源抗體炭疽毒素治療吸入性炭疽病第九頁，共77頁。在我國批準上市的國外單抗藥物抗體名稱商品名抗體類型適應(yīng)證Muromonab-CD3愛歐山鼠源性抗體抗腎移植排斥Daclizumab賽尼哌人源化抗體預(yù)防腎移植后急性排斥Infliximab類美克人源化抗體重癥銀屑病、關(guān)節(jié)炎Rituximab美羅華嵌合抗體非霍奇金淋巴瘤Trastuzumab赫賽汀人源化抗體HER2過度表達乳腺癌Basiliximab蘇萊克嵌合抗體抗器官移植排斥Cetuximab愛必妥嵌合抗體惡性腫瘤Adalimumab修美樂全人源抗體自身免疫性疾病Bevacizumab阿瓦斯汀人源化抗體惡性腫瘤第十頁，共77頁。在中國批準上市的國產(chǎn)單抗藥物年份抗體名稱/商品名公司名抗體類型適應(yīng)證1999抗人T淋巴細胞CD3單抗/WuT3武漢生物制品所鼠源性抗體抗移植排斥2003抗人白細胞介素-8單抗/恩博克大連亞維藥業(yè)鼠源性抗體牛皮癬2005人Ⅱ型TNFR-Fc融合蛋白/益賽普上海中信國健融合蛋白風濕性關(guān)節(jié)炎2006碘[131I]腫瘤細胞核單抗/唯美生上海美恩生物嵌合抗體惡性腫瘤2006碘[131I]美妥昔單抗/利卡汀成都華神生物鼠源性抗體原發(fā)性肝癌2008尼妥珠單抗/泰欣生北京百泰生物藥業(yè)人源化抗體惡性腫瘤2011人Ⅱ型TNFR-Fc融合蛋白/強克上海賽金生物醫(yī)藥融合蛋白風濕性關(guān)節(jié)炎2011重組抗CD25單抗/健尼哌上海中信國健人源化抗體自身免疫性疾病第十一頁，共77頁。動物細胞工程基本概念應(yīng)用細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)原理和方法（細胞融合或基因轉(zhuǎn)導(dǎo)等），通過某種工程學(xué)手段（遺傳操作等），在細胞整體水平或細胞器水平上，按照人們的意愿來改變細胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)或獲得細胞產(chǎn)品（特定的蛋白制品）的一門綜合科學(xué)技術(shù)。第十二頁，共77頁。單克隆抗體細胞融合細胞培養(yǎng)胚胎移植(提高產(chǎn)仔率)核移植(克隆牛、羊等)動物細胞工程第十三頁，共77頁。一、動物細胞生物反應(yīng)器

生物反應(yīng)器是利用酶或生物體（如微生物、細胞）所具有的生物功能，在體外進行生化反應(yīng)的裝置系統(tǒng)，是一種生物功能模擬機，如發(fā)酵罐、固定化酶或細胞反應(yīng)器等。動物細胞生物反應(yīng)器近年來得到迅速的發(fā)展，利用動物細胞可以準確、有效地生產(chǎn)醫(yī)藥生物技術(shù)制品，如活性肽、單抗、細胞因子、生長因子等。第十四頁，共77頁。利用動物細胞生物反應(yīng)器產(chǎn)生蛋白的必要性1．細菌和酵母系統(tǒng)產(chǎn)生哺乳動物蛋白并不另人滿意，主要原因是該系統(tǒng)不一定能產(chǎn)生完全正確的哺乳動物蛋白。2．動物細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)往往經(jīng)過一系列翻譯后修飾，才能成為成熟蛋白，而微生物系統(tǒng)不一定能實現(xiàn)翻譯后修飾。3．翻譯后修飾因不同的蛋白而有差異，其中以糖基化最為常見，尤其對于分泌的蛋白更是如此，其他修飾也可發(fā)生。4．翻譯后修飾對某些蛋白的活性是不可缺少的。修飾也將影響蛋白在體內(nèi)的穩(wěn)定性、清除率，以及組織分布等。第十五頁，共77頁。蛋白翻譯后修飾的原因蛋白活性調(diào)節(jié)的需要蛋白相互作用的需要亞細胞水平定位的需要等第十六頁，共77頁。哺乳動物蛋白常見的翻譯后修飾—————————————————————————————————————————————————————糖基化(glycosylation)谷氨酸的g-羧化(g-carboxylation)門冬氨酸的b-羥化(b-hydroxylation)磷酸化與硫酸化(phosphorylation&sulphatation)蛋白水解加工(proteolyticprocessing)酰胺化(amidation)—————————————————————————————————————————————————————還有：甲基化、乙酰化、甲酰化、十四烷基化、異戊二烯基化、氨基化–去氨基化、二硫鍵形成、硝化等共兩百多種類型。第十七頁，共77頁。蛋白質(zhì)翻譯后修飾主要內(nèi)容:泛素化糖基化磷酸化乙?；谆谑隧?，共77頁。泛素化在生命過程中的作用泛素化是泛素與其他蛋白結(jié)合，并進一步降解蛋白的過程。對于細胞分化、細胞器的合成、細胞凋亡、DNA修復(fù)、新蛋白的合成、調(diào)控細胞增殖和蛋白質(zhì)運輸?shù)壬磉^程都起到很重要的作用。第十九頁，共77頁。蛋白糖基化的作用糖基化在生物過程中起著重要作用，如免疫保護、病毒復(fù)制、細胞生長、細胞之間黏附、炎癥的產(chǎn)生等。糖基化在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中形成的大部分蛋白是糖蛋白第二十頁，共77頁。蛋白磷酸化的作用可逆的磷酸化過程幾乎涉及所有的生理及病理過程，如細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤的發(fā)生、新陳代謝、神經(jīng)活動、肌肉收縮以及細胞的增殖、發(fā)育和分化等作用。第二十一頁，共77頁。蛋白的乙酰化作用組蛋白的乙?；腿ヒ阴；腔虮磉_過程中重要的調(diào)控方式，是轉(zhuǎn)錄過程中的關(guān)鍵修飾。組蛋白去乙?；竿ㄟ^去除組蛋白的乙酰基和其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控參與腫瘤發(fā)生和進展。組蛋白的乙酰化乙?；鰪娹D(zhuǎn)錄去乙酰化抑制轉(zhuǎn)錄第二十二頁，共77頁。蛋白甲基化的作用組蛋白上的甲基化，不僅在真核細胞染色質(zhì)的遺傳外修飾中占有中心地位，對細胞分化、發(fā)育、基因表達、基因組穩(wěn)定性及癌癥研究均有深遠的影響。其他類型的甲基化的異?；蚣谆傅耐蛔兂?dǎo)致疾病的發(fā)生。第二十三頁，共77頁。動物細胞生物反應(yīng)器的基本特征1．需要用基因轉(zhuǎn)導(dǎo)或細胞融合等方法建立必要的生產(chǎn)細胞系；2．需要大量、高密度培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)液與培養(yǎng)設(shè)備；3．需要控制細胞的生長與蛋白的表達；4．在產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中，出現(xiàn)一些可能影響安全性的副產(chǎn)品，包括細胞碎片蛋白、DNA、病毒等，需要在產(chǎn)品的純化過程中加以清除；5．在細胞培養(yǎng)中，可出現(xiàn)對細胞有害的副產(chǎn)品，如氨離子、乳酸等，應(yīng)在培養(yǎng)液的組成以及培育條件等方面考慮限制這些毒性產(chǎn)物的釋放。第二十四頁，共77頁。動物細胞技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的問題1．產(chǎn)量低

與微生物系統(tǒng)比較，動物細胞重組蛋白的產(chǎn)量較低；2．生產(chǎn)設(shè)備與技術(shù)復(fù)雜

細胞生長慢，工藝條件要求高，易染菌；3．控制生產(chǎn)過程較困難

細胞生長速度與產(chǎn)物表達量的控制要求高；4．細胞在培養(yǎng)過程中易受損傷

動物細胞比微生物脆弱，培養(yǎng)條件要求苛刻；5．產(chǎn)品純化困難

培養(yǎng)液中含有大量外源性蛋白，原材料的質(zhì)量不好控制，如血請等；6．成本較高

所用儀器設(shè)備、培養(yǎng)基等材料價格貴。第二十五頁，共77頁。細胞工程在優(yōu)化細胞株過程中的應(yīng)用1．防止細胞凋亡凋亡抑制方法，培養(yǎng)基補充，基因策略(bcl-2等)；2．代謝工程通過代謝調(diào)控抑制乳酸鹽和氨水等毒性代謝產(chǎn)物產(chǎn)生；3．分子伴侶工程增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中與蛋白分泌有關(guān)的分子伴侶蛋白數(shù)量；4．轉(zhuǎn)譯后加工工程(糖基化工程)通過合適的糖基轉(zhuǎn)移酶過表達達到此目的。第二十六頁，共77頁。生物反應(yīng)器生物反應(yīng)器在生物過程中起中心作用，是實現(xiàn)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵設(shè)備，是連接原料和產(chǎn)物的橋梁。細胞或酶等生物催化劑（游離或固定化）生物反應(yīng)器空氣CO2等冷卻水原材料培養(yǎng)基滅菌底物產(chǎn)物廢物除菌檢測和控制產(chǎn)物預(yù)處理產(chǎn)品提取或液化副產(chǎn)物第二十七頁，共77頁。生物反應(yīng)器中復(fù)雜的相互關(guān)系細胞調(diào)節(jié)

過程操作

細胞環(huán)境

細胞形態(tài)反應(yīng)器特性第二十八頁，共77頁。生物反應(yīng)器1．攪拌式

經(jīng)典的動物細胞反應(yīng)器；2．氣升式

有氧傳遞速度大、傳熱效果及混合性能好；3．中空纖維管

細胞密度大、血清用量小、細胞不易受損；4．流化床式

比表面積大、適合培養(yǎng)各種細胞。第二十九頁，共77頁。1．攪拌式

（籠式攪拌器）第三十頁，共77頁。2．氣升式

（氣腔式反應(yīng)器）

懸浮培養(yǎng)或

微載體培養(yǎng)用第三十一頁，共77頁。中空纖維反應(yīng)器：左右兩箭頭為無菌空氣進出口。細胞生長在由半透性的多孔膜制成的中空纖維管外表面。3．中空纖維管

中空纖維貼壁反應(yīng)器培養(yǎng)基出口細胞培養(yǎng)基入口第三十二頁，共77頁。4．流化床式

流化床反應(yīng)器

基本原理是使支持細胞生長的微粒呈流態(tài)化。由膠原制成的微粒，具有像海綿一樣的多孔性，用非毒性物質(zhì)增加其比重，使之達到1.6或更高，以便它在高速向上流動的培養(yǎng)波中里流態(tài)化。細胞接種于微粒中，通過反應(yīng)器垂直向上循環(huán)流動的培養(yǎng)液使之成為流化床，不斷提供給細胞必要的營養(yǎng)成分，細胞得以在微粒中生長。同時新鮮培養(yǎng)液不斷地被加入，培養(yǎng)產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物又不斷地被排除。第三十三頁，共77頁。流化床、攪拌式、微載休培養(yǎng)細胞密度的對比培養(yǎng)類型 細胞類型 細胞密度(cell/mL)流化床

貼壁依賴性 1.3×108流化床 雜交瘤 0.3×108微載體攪拌釜 貼壁依賴性 0.2-2×107恒化床

雜交瘤2.0×106第三十四頁，共77頁。二、動物細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)原代培養(yǎng)：10代以內(nèi)的組織培養(yǎng)細胞；

正常細胞：

10－50代未經(jīng)轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)細胞；轉(zhuǎn)化細胞：重組DNA進入受體的過程叫“轉(zhuǎn)化”,得到重組DNA的細胞叫“轉(zhuǎn)化細胞”；細胞系:特定基因背景的無限傳代細胞，BHK-21,CHO-K1,MDCK,MRC-5,Namalwa,Vero,WI-38。第三十五頁，共77頁。動物細胞培養(yǎng)過程動物胚胎或幼齡動物的組織、器官細胞懸浮液胰蛋白酶10代細胞原代培養(yǎng)50代細胞傳代培養(yǎng)細胞株無限傳代細胞系單個細胞加培養(yǎng)液遺傳物質(zhì)未改變遺傳物質(zhì)已改變動物組織細胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細胞網(wǎng)絡(luò)起來形成有一定彈性和韌性的組織和器官。第三十六頁，共77頁。

除單細胞原生動物外，細胞培養(yǎng)過程具有以下特性：①細胞生長緩慢，易受微生物污染，培養(yǎng)時需用抗生素；②動物細胞較微生物大得多．無細胞壁，機械強度低，適應(yīng)環(huán)境能力差；③培養(yǎng)過程需氧量少，且不耐受強力通風與攪拌形成的較大流體剪切力：④在培養(yǎng)中，細胞相互粘連以集群形式存在，培養(yǎng)過程具有群體效應(yīng)、錨地依賴性、接觸抑制性及功能全能性：⑤培養(yǎng)過程產(chǎn)物分布于細胞內(nèi)外，反應(yīng)過程成本較高，但產(chǎn)品價格昂貴；⑥大規(guī)模培養(yǎng)時，不可照用微生物反應(yīng)的經(jīng)驗；⑦原代培養(yǎng)細胞一般繁殖50代即退化死亡。動物細胞培養(yǎng)特性第三十七頁，共77頁。用于細胞培養(yǎng)的部分細胞系細胞 來源 用途COS 非洲綠猴腎細胞 小規(guī)模量單抗CHO 中國倉鼠卵巢細胞 表達重組蛋白BHK 倉鼠腎細胞 生產(chǎn)畜用疫苗MDCK 狗腎細胞 生產(chǎn)畜用疫苗MRC-5 人胚肺組織細胞 產(chǎn)生人用疫苗Namalwa 淋巴母細胞樣細胞 生產(chǎn)a-干擾素Vero 猴腎臟成纖維細胞 生產(chǎn)人用制品WI-38 胚肺組織細胞 生產(chǎn)人用疫苗第三十八頁，共77頁。細胞培養(yǎng)過程的放大1．篩選細胞系2．確定培養(yǎng)條件3．產(chǎn)物表達的優(yōu)化4．中試放大5．放大生產(chǎn)第三十九頁，共77頁。細胞培養(yǎng)的環(huán)境1．培養(yǎng)用品的無菌處理

器材、培養(yǎng)基、試劑等；2．培養(yǎng)條件

水質(zhì)、pH、滲透壓、溫度、空氣、攪拌速度。第四十頁，共77頁。細胞培養(yǎng)基

1．天然培養(yǎng)基：血漿凝塊、血清淋巴液、胚胎浸液及羊水、腹水等。2．合成培養(yǎng)基：DMEM、RPMI1640、Ham’sF12、IMDM等。包含氨基酸（氮源）、糖（碳源）、鹽類、維生素、激素、生長因子、微量元素、脂等；10%血清。第四十一頁，共77頁。無血清懸浮培養(yǎng)

1．無血清培養(yǎng)基

可替代血清功能的生物材料配制細胞培養(yǎng)基，如牛血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素等；2．無動物來源培養(yǎng)基

需要的蛋白來源于重組蛋白或者蛋白水解物；3．無動物蛋白培養(yǎng)基部分添加物是來源于植物蛋白的水解片段或合成多肽片段等其他衍生物；4．化學(xué)組分限定培養(yǎng)基最安全、最理想的培養(yǎng)基，可保證培養(yǎng)基批次間一致性，少量動物來源蛋白水解物、蛋白都是成分明確。第四十二頁，共77頁。常用培養(yǎng)方法1．懸浮培養(yǎng)2．貼壁培養(yǎng)3．微載體培養(yǎng)（葡聚糖）4．包埋和微囊培養(yǎng)（瓊脂糖、海藻酸鈣凝膠）第四十三頁，共77頁。1.貼壁培養(yǎng)分散的細胞懸浮液在培養(yǎng)器中往往要貼附在壁上，這叫細胞貼壁。原來是圓形的細胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展呈多種形態(tài)。此后細胞就開始有絲分裂并很快進入對數(shù)生長期。一般在數(shù)天后就鋪滿生長表面，形成致密的細胞單層，叫做單層細胞，這種培養(yǎng)的方法又叫單層細胞培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)中有一個非常有趣的現(xiàn)象是細胞的接觸抑制。當貼壁生長的細胞生長到表面相互接觸時，就停止分裂增殖，長成單層的細胞經(jīng)過一段時間，一定須在重新分散后分瓶繼續(xù)培養(yǎng)，使其繼續(xù)分裂增殖，這叫傳代。2.懸浮培養(yǎng)是指細胞在培養(yǎng)器中自由懸浮生長過程，主要用于懸浮生長的細胞培養(yǎng)，如雜交瘤細胞等。動物細胞懸浮培養(yǎng)是在微生物發(fā)酵的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。由于動物細胞的特點，如沒有細胞壁保護，不能耐受劇烈的攪拌和通氣，因此在許多方面又與經(jīng)典的發(fā)酵有所不同。對于小規(guī)程培養(yǎng)多采用轉(zhuǎn)瓶和滾瓶培養(yǎng)，大規(guī)模培養(yǎng)多采用發(fā)酵罐式的細胞培養(yǎng)反應(yīng)器。懸浮培養(yǎng)，設(shè)備結(jié)構(gòu)簡單，有成熟的理論計算，可以借鑒微生物發(fā)酵的部分經(jīng)驗，放大效應(yīng)小。但是懸浮培養(yǎng)的細胞密度較低，轉(zhuǎn)化細胞懸浮培養(yǎng)有潛在致癌危險。此外，有許多動物細胞屬于貼壁依賴性的，不能懸浮培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)的關(guān)鍵是要選擇適當?shù)臄嚢韬屯庋b置。第四十四頁，共77頁。3.微載體培養(yǎng)系統(tǒng)微載體是直徑為60~250μm的微珠。采用微裁體系統(tǒng)培養(yǎng)動物細胞，細胞易壁于微載體上，微載體（和細胞）懸浮于培養(yǎng)基中，細胞在微載體表面逐漸生長成單層。這種模式把單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點融匯在一起，具有兩種培養(yǎng)方法的優(yōu)點。1)表面積/體積比大；2)由于微裁體懸浮于培養(yǎng)基中，是均勻懸浮培養(yǎng)，簡化了細胞生長各種環(huán)境因素的監(jiān)測和控制，細胞生長環(huán)境亦均勻；3)培養(yǎng)基利用率高；4)采樣重演性好；5）收獲過程不復(fù)雜；6)放大較容易；7)勞動強度小，占用空間小。4.包埋培養(yǎng)

對懸浮生長和貼壁依賴生長的細胞都適用，細胞生長的密度高，抗剪切力和抗污染能力強。對懸浮生長的細胞用海藻酸鈣包埋，對貼壁依賴生長細胞用膠原包埋。由于動物細胞培養(yǎng)慢而費用高，且對剪切力敏感，經(jīng)包埋后可有效的保護細胞。第四十五頁，共77頁。5.微囊化培養(yǎng)在動物細胞微囊化制備中，主要是應(yīng)用海藻酸—聚氨基酸方法，簡單過程是動物細胞與海藻酸溶液混合攪拌，經(jīng)過微囊發(fā)生器將微球滴入氯化鈣溶液中，形成凝膠，然后再用聚氨基酸處理，使微球表面成膜，最后用檸檬酸處理去除微球內(nèi)的鈣離子，以便球內(nèi)的海藻酸成液態(tài)，動物細胞得以懸浮在其中。動物細胞的微囊化中海藻酸和聚氨基酸是關(guān)鍵材料。微囊化方法能使細胞處于相對穩(wěn)定、受剪切力小的環(huán)境中，而養(yǎng)分和氧又可以從微囊外的培養(yǎng)液擴散進入。1000L氣升式細胞反應(yīng)器系統(tǒng)第四十六頁，共77頁。細胞培養(yǎng)的操作方式1．分批式操作2．半連續(xù)式操作（反復(fù)分批式或換液培養(yǎng)）3．流加式操作（分批培養(yǎng)過程中間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基）4．連續(xù)罐流式操作（連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基）第四十七頁，共77頁。分批、連續(xù)、流加操作方式的比較4.因經(jīng)常滅菌會降低儀器使用壽命第四十八頁，共77頁。大規(guī)模生產(chǎn)的操作1．培養(yǎng)基的配制2．種子細胞的制備3．雜交瘤細胞的大規(guī)模培養(yǎng)4．產(chǎn)品的分離純化5．產(chǎn)品的冷凍干燥第四十九頁，共77頁。單批細胞培養(yǎng)及反應(yīng)時間3.125ml62.5ml1.25L10kL500L25Lday16~20day21~25day11~15day28~32day1~5day8~12day6~10day13~17day18~22day15~19day20~24day23~27day25~29day21~25day30~34day26~30儲槽10kLday32day25后續(xù)純化分分離過程day26day33母細胞庫第五十頁，共77頁。生物產(chǎn)品生產(chǎn)工藝開發(fā)要素第五十一頁，共77頁。動物細胞培養(yǎng)的應(yīng)用

1．獲得細胞產(chǎn)物，如蛋白質(zhì)生物制品，包括病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體等；2．制備燒傷病人植皮所需的皮膚細胞；3．獲得檢測用細胞，檢測有毒物質(zhì)的毒性。第五十二頁，共77頁。三、動物細胞的基因工程基因工程基本概念在生物體外，通過對DNA分子進行人工“剪切”和“拼接”，對生物的基因進行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細胞內(nèi)進行無性繁殖，使重組基因在受體細胞內(nèi)表達，產(chǎn)生出人類所需要的基因產(chǎn)物。

第五十三頁，共77頁。高表達細胞株的建立基因轉(zhuǎn)染選擇瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法，既取決于實驗的要求，同時經(jīng)濟和技術(shù)因素也可考慮在內(nèi)。1．基因瞬時轉(zhuǎn)染

常見于實驗室研究，瞬時轉(zhuǎn)染跳過了通過細胞的鑒定與選擇來判斷質(zhì)粒整合至細胞基因組這一步，速度快。2．基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

用于臨床或商業(yè)目的，一個穩(wěn)定轉(zhuǎn)染能將目的基因DNA整合到宿主細胞染色體組中。第五十四頁，共77頁。動物細胞的核酸轉(zhuǎn)移方法1．磷酸鈣沉淀法；2．DEAE－右旋糖酐法；3．脂質(zhì)體包被法；4．微量注射法；5．電脈沖法；6．基因槍；7．逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。第五十五頁，共77頁。1、化學(xué)法磷酸鈣沉淀法：目的基因與磷酸鈣等物質(zhì)混合，形成沉淀的DNA微細顆粒，易通過細胞膜進入細胞內(nèi)，并整合到受體細胞基因組中，在適當條件下得以表達。方法簡單，但轉(zhuǎn)化效率低。Ca2(PO4)2+DNA→混合微細顆粒（Ca離子濃度125mmol，DNA離子濃度5～0ug/ml，PH7.0）↓沉淀反應(yīng)20~30min↓細胞在沉淀物中暴露5~24h第五十六頁，共77頁。2、物理方法電穿孔法（electroporotion）將細胞置于高壓脈沖電場中，通過電壓使細胞產(chǎn)生可逆性的穿孔。周圍基質(zhì)中的DNA可滲進細胞，進而表達。瞬間細胞細胞膜核摸通透性增加高壓脈沖DNA滲入細胞第五十七頁，共77頁。3、顯微注射法（microinjection）

利用顯微操作把目的基因直接注入靶細胞或細胞核中第五十八頁，共77頁。第五十九頁，共77頁。ClonesheepDolly體細胞提取核重組細胞回植Dolly卵細胞去核細胞第六十頁，共77頁。外源基因在細胞中的表達1．降解2．游離狀態(tài)3．整合到宿主細胞的染色體第六十一頁，共77頁。病毒表達載體1．SV40病毒載體2．逆轉(zhuǎn)錄病毒載體3．牛痘病毒載體4．牛乳頭瘤病毒載體5．腺病毒載體6．多瘤病毒7．Epstein-Barrvirus,Sinbisvirus8．重組病毒載體等第六十二頁，共77頁。細胞轉(zhuǎn)基因遺傳標記的選擇系統(tǒng)1．二氫葉酸還原酶基因選擇系統(tǒng)(dhfr)2．胸苷激酶基因選擇系統(tǒng)(tk)3．新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(neo)4．氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat)5．綠色熒光蛋白基因(gfp)特定的遺傳標志（基因）和相應(yīng)的選擇培養(yǎng)劑:MTX(dhfr),HAT(tk),四環(huán)素(tetr),卡那霉素(kanr)和新霉素(neo)基因。第六十三頁，共77頁。細胞株篩選1．傳統(tǒng)篩選方法

最常用的方法是有限稀釋克?。↙DC）；2．流式細胞術(shù)和細胞分選

膜標記技術(shù)，優(yōu)勢在于篩選數(shù)目大幅增加；3．基于細胞分泌率的高表達細胞的篩選

凝膠微液滴技術(shù)檢測，基于基質(zhì)的分泌檢測；4．細胞篩選的自動化系統(tǒng)

激光激活分析和處理系統(tǒng)，自動挑選克隆，Cello系統(tǒng)。第六十四頁，共77頁。四、雜交瘤技術(shù)