環(huán)境儀器分析第七章高效液相色譜法

環(huán)境儀器分析第七章高效液相色譜法第一頁，共五十五頁，2022年，8月28日第一節(jié)概述高效液相色譜法：以氣相色譜為基礎(chǔ)，在經(jīng)典液相色譜實驗和技術(shù)基礎(chǔ)上建立的一種液相色譜法一、HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別二、HPLC與GC差別三、高效液相色譜的特點四、高效液相色譜的局限性第二頁，共五十五頁，2022年，8月28日一、HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別主要區(qū)別：固定相差別，輸液設(shè)備和檢測手段1．經(jīng)典LC：僅做為一種分離手段

柱內(nèi)徑1~3cm，固定相粒徑>100μm且不均勻常壓輸送流動相柱效低（H↑，n↓）分析周期長無法在線檢測2．HPLC：分離和分析

柱內(nèi)徑2~6mm，固定相粒徑<10μm（球形，勻漿裝柱）高壓輸送流動相柱效高（H↓，n↑）分析時間大大縮短可以在線檢測第三頁，共五十五頁，2022年，8月28日第四頁，共五十五頁，2022年，8月28日二、HPLC與GC差別相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測主要差別：分析對象的差別和流動相的差別1．分析對象

GC：在操作溫度下能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較低的樣品，高沸點、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣品不可檢測占有機(jī)物的20%

HPLC：溶解后能制成溶液的樣品，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制分子量大、難氣化、不易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性差及高聚物和離子型樣品均可檢測用途廣泛，占有機(jī)物的70~80%第五頁，共五十五頁，2022年，8月28日第六頁，共五十五頁，2022年，8月28日續(xù)前2．流動相差別GC：流動相為惰性氣體組分與流動相無親合作用力，只與固定相作用

HPLC：流動相為液體流動相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善分離度增加了因素，對分離起很大作用流動相種類較多，選擇余地廣流動相極性和pH值的選擇也對分離起到重要作用選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動相可以增大分離選擇性3．操作條件差別

GC：加溫操作

HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。┑谄唔摚参迨屙?，2022年，8月28日續(xù)前三、HPLC的特點

“三高”“一快”“一廣”高柱效——n=104片/米，柱效高（遠(yuǎn)高于一般LC）高靈敏度高選擇性分析速度快應(yīng)用范圍廣泛（可分析80%有機(jī)化合物）第八頁，共五十五頁，2022年，8月28日四、高效液相色譜的應(yīng)用方位和局限性1、應(yīng)用范圍高效液相色譜適用于分析高沸點不易揮發(fā)的、受熱不穩(wěn)定易分解的、相對分子質(zhì)量大的、不同極性的有機(jī)化合物；生物活性物質(zhì)和多種天然產(chǎn)物；合成的和天然的高分子化合物等，包括石油化工產(chǎn)品、食品、合成藥物、生物化工產(chǎn)品及環(huán)境污染物等，約占全部有機(jī)化合物的80%。其余20%有機(jī)化合物，包括永久性氣體、易揮發(fā)低沸點及中等相對分子質(zhì)量的化合物，只能用氣相色譜法。第九頁，共五十五頁，2022年，8月28日2、局限性

1）使用多種流動相成本高于GC，且易引起環(huán)境污染梯度洗脫比氣象中的程序升溫操作復(fù)雜

2）缺少通用檢測器

3）不能完成組成復(fù)雜具有多種沸程的石油產(chǎn)品的分析（毛細(xì)管氣象色譜法分析）

4）也不能替代中低壓色譜法第十頁，共五十五頁，2022年，8月28日第二節(jié)高效液相色譜的分離原理與分類一、液相色譜分離原理

固定相：吸附劑、化學(xué)鍵和固定相、離子交換樹脂或多孔凝膠流動相：各種溶劑被分離的混合物由流動相液體推動進(jìn)入色譜柱。根據(jù)各組分在固定相及流動相中的吸附能力、分配系數(shù)、離子交換作用或分子尺寸大小的差異進(jìn)行分離。色譜分離的實質(zhì)是樣品分子（溶質(zhì)）與溶劑（流動相或洗脫液）以及固定相分子間的作用，作用力大小決定色譜過程的保留行為。第十一頁，共五十五頁，2022年，8月28日不同組分在兩相間的吸附、分配、離子交換、親和力或分子尺寸等性質(zhì)存在微小差別，經(jīng)過連續(xù)多次在兩相間的質(zhì)量交換，這種性質(zhì)微小差別被疊加、放大，最終得到分離。不同組分性質(zhì)上的微小差別是色譜分離的根本---必要條件在兩相間進(jìn)行了上千次甚至上百萬次的質(zhì)量交換，是色譜分離的充分條件第十二頁，共五十五頁，2022年，8月28日二、高效液相色譜的分類

1.液固色譜（LSC）通常也稱吸附色譜法。分離原理是根據(jù)固定相對組分吸附力大小不同。依靠流動相溶劑分子與溶劑分子競爭固定相活性位置，從而是溶質(zhì)從色譜柱上洗脫下來。與硅膠表面活性位置結(jié)合力強(qiáng)的溶劑洗脫溶質(zhì)分子的能力強(qiáng)，稱強(qiáng)溶劑。常用吸附劑：硅膠或氧化鋁，5~10um

適用于相對分子質(zhì)量200~1000的組分大多數(shù)屬于非離子型化合物

第十三頁，共五十五頁，2022年，8月28日續(xù)前2．固定相：與LC比，固定相粒徑不同（<10μm）

（2）高分子多孔小球：YSG

原理：吸附+分配蒹小孔凝膠作用特點：柱選擇性好，峰形好，柱效低適用：分離弱極性化合物（1）硅膠表孔硅膠（薄殼硅膠）全多孔硅膠無定形YWG5~6μm5×104

球形YQG3~4μm8×108

堆積硅珠YQG3~4μm8×108

理想

原理：吸附特點：峰易拖尾適用：分離極性化合物第十四頁，共五十五頁，2022年，8月28日續(xù)前3．流動相：底劑（烷烴）+有機(jī)極性調(diào)節(jié)劑

例：正己烷或庚烷+氯仿---4．影響k的因素：與固定相性質(zhì)和流動相性質(zhì)有關(guān)溶質(zhì)分子極性↑，洗脫能力↓，k↑，tR↑

溶劑系統(tǒng)極性↑，洗脫能力↑，k↓，tR↓注：調(diào)節(jié)溶劑極性，可以控制組分的保留時間5．出柱順序：強(qiáng)極性組分后出柱，弱極性組分先出柱對具有不同官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高的選擇性對同系物（即分子量大小）的選擇性分離弱。常用于分離同分異構(gòu)體，可用于脂溶性化合物的分析，如磷脂、甾體化合物、脂溶性維生素第十五頁，共五十五頁，2022年，8月28日2.液液色譜法（LLC）

其流動相和固定相都是液體，固定相是通過化學(xué)鍵合的方式固定在基質(zhì)（惰性載體）上的。分離原理：根據(jù)各組分在固定相與流動相中的相對溶解度（分配系數(shù)）的差異進(jìn)行分離，分離過程是一個分配平衡過程。理論上說，流動相與固定相之間應(yīng)互不相溶第十六頁，共五十五頁，2022年，8月28日據(jù)所用固定液與流動相液體極性的差異，液-液分配色譜可分為正相色譜和反相色譜。正相色譜：固定相的極性>流動相的極性洗脫順序:按組分極性從小到大流出。流動相溶劑：非極性疏水性溶劑，如庚烷、己烷及異辛烷。極性大的溶劑是強(qiáng)溶劑常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等調(diào)節(jié)組分的保留時間常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物（如酚類、胺類、羰基累計氨基酸類等）根據(jù)化合物在固定相及流動相中分配系數(shù)的不同進(jìn)行分離，不適合于分離幾何異構(gòu)體第十七頁，共五十五頁，2022年，8月28日反相色譜：固定相的極性小于流動相極性。組分的洗脫順序和正相色譜相反，極性大的組分先流出，極性小的組分后流出。固定相：共價結(jié)合到載體上的一些直鏈碳?xì)浠衔铮缯镣?。疏水性?qiáng)的化合物在色譜柱中滯留時間長反相色譜法中不同的化合物因各自的疏水特性得到分離。適于分離帶有不同疏水基團(tuán)（非極性基團(tuán)）的化合物、帶有不同極性基團(tuán)的化合物反相色譜中，水在流動相中所占比例可調(diào)，所以可用于水溶性、脂溶性化合物的分離第十八頁，共五十五頁，2022年，8月28日液-液分配色譜技術(shù)的關(guān)鍵是相體系選擇。可通過調(diào)節(jié)流動相的極性，來獲得良好的柱效和縮短分析時間。液-液分配色譜可用于幾乎所有類型化臺物，極性的或非極性的、有機(jī)物或無機(jī)物、大分于或小分于物質(zhì)的分離，只要官能團(tuán)不同、或者官能團(tuán)數(shù)目不同、或者是分子量不同均可獲得滿意的分離。第十九頁，共五十五頁，2022年，8月28日離子交換色譜法

固定相:帶電荷的基團(tuán)常用苯乙烯和二乙烯苯交聯(lián)形成的聚合物為骨架在表面末端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基為陽離子交換樹脂，接上季胺基為陰離子交換樹脂。按質(zhì)量作用定律，樹脂上可電離的離子與流動性中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進(jìn)行交換，各離子與離子交換基團(tuán)之間因具有不同的電荷吸引力而分離。主要用于可電離化合物的分離，如多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核苷和各種堿基的分離等第二十頁，共五十五頁，2022年，8月28日4.離子對色譜

又稱偶離子色譜法。是在流動相中加入具有與被測離子相反電荷的離子，即“離子對試劑”，使之與被測離子形成中性離子對化合物，此離子對化合物在反相色譜柱上被保留。保留的強(qiáng)弱主要取決于離子對化合物的解離平衡常數(shù)和離子對試劑的濃度主要用于分析離子強(qiáng)度大的酸堿物質(zhì)。分析堿性物質(zhì)常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉，辛烷磺酸鈉分析酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨，四丁基磷酸鹽第二十一頁，共五十五頁，2022年，8月28日空間排阻色譜法（凝膠色譜法）固定相：有一定孔徑的多孔性填料流動相：可以溶解樣品的溶劑相對分子量小的化合物可以進(jìn)入孔中，滯留時間長；相對分子質(zhì)量大的化合物不能進(jìn)入孔中，直接隨流動相流出。利用分子篩對相對分子量大小不同的個組分排阻能力的差異完成分離。缺點：不能分辨分子大小相近的化合物常用于分離高分子化合物，如多肽、蛋白質(zhì)、核酸等第二十二頁，共五十五頁，2022年，8月28日排阻色譜分離過程模型第二十三頁，共五十五頁，2022年，8月28日空間排阻色譜分離示意圖第二十四頁，共五十五頁，2022年，8月28日6.高效液相色譜分離類型的選擇

高效液相色譜每種分離類型都有其自身的特點和適用范圍，沒有一種類型可以通用于所有領(lǐng)域，它們互相補(bǔ)充。一般情況，選擇最有效的分離類型，應(yīng)考慮樣品來源，樣品的性質(zhì)（相對分子質(zhì)量、化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性、化學(xué)穩(wěn)定性、溶解度參數(shù)等化學(xué)性質(zhì)和物理性質(zhì)），分析目的要求，液相色譜分離類型的特點及應(yīng)用范圍、實驗室條件（儀器、色譜柱等）等一系列因素。第二十五頁，共五十五頁，2022年，8月28日液相色譜分離類型選擇參考表第二十六頁，共五十五頁，2022年，8月28日第三節(jié)基本理論和條件選擇熱力學(xué)理論：塔板理論——平衡理論基礎(chǔ)動力學(xué)理論：速率理論——Vander方程一、塔板理論二、速率理論三、HPLC法中分離條件的選擇第二十七頁，共五十五頁，2022年，8月28日一、塔板理論第二十八頁，共五十五頁，2022年，8月28日二、速率理論（與GC對比）

1.第二十九頁，共五十五頁，2022年，8月28日續(xù)前2）渦流擴(kuò)散項及其影響next2.討論：

1）流動相流速對HPLC板高的影響（與GC對比）第三十頁，共五十五頁，2022年，8月28日圖示第三十一頁，共五十五頁，2022年，8月28日續(xù)前3）傳質(zhì)阻抗項及其影響第三十二頁，共五十五頁，2022年，8月28日圖示第三十三頁，共五十五頁，2022年，8月28日高效液相色譜儀由以下五部分組成：高壓輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)記錄系統(tǒng)（記錄儀、積分儀和色譜工作站）第四節(jié)高效液相色譜儀第三十四頁，共五十五頁，2022年，8月28日高效液相色譜儀流程圖1．貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì)）2．高壓泵（輸液泵）3．進(jìn)樣裝置4．色譜柱——分離5．檢測器——分析6．廢液出口或組分收集器7．記錄裝置第三十五頁，共五十五頁，2022年，8月28日高效液相色譜儀的工作過程：輸液泵將流動相一穩(wěn)定的流速或壓力輸送到分析體系，在色譜柱之前通過進(jìn)樣器將樣品倒入，流動相將樣品帶入色譜柱，在色譜柱中各組分因在固定相中的分配系數(shù)或吸附力大小的不同而被分離，并依次隨流動相流至檢測器，檢測到的信號送至數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄、處理或保存。第三十六頁，共五十五頁，2022年，8月28日1．高壓輸液系統(tǒng)：溶劑儲存器、高壓泵、梯度洗脫裝置和壓力表等。泵：按輸出液恒定的因素分恒壓泵：流量精度不穩(wěn)恒流泵：常用對泵的要求：無脈動流速恒定流量可調(diào)耐腐蝕便于實現(xiàn)程序控制死體積小，便于測壓、調(diào)整及維護(hù)。第三十七頁，共五十五頁，2022年，8月28日2．進(jìn)樣裝置

包括進(jìn)樣口、注射器和進(jìn)樣閥等，作用是把分析試樣有效的送入色譜柱上進(jìn)行分離。

1）隔膜進(jìn)樣---微量注射器（高分子有機(jī)硅膠墊→進(jìn)樣室）

GC系統(tǒng)壓力較小，可以

HPLC系統(tǒng)壓力太大，必須停泵進(jìn)樣（早期）隔膜容易吸附樣品產(chǎn)生記憶效應(yīng)

2）閥進(jìn)樣：不必停泵，六通閥第三十八頁，共五十五頁，2022年，8月28日3．色譜柱：柱內(nèi)徑2~5mm,柱長10~30cm

裝柱方法：干法和濕法兩種填料粒度大于20μm的可用干法裝柱；粒度小于20μm的填料不宜用干法裝柱，這是由于微小顆粒表面存在著局部電荷，具有很高的表面能，因此在干燥時傾向于顆粒間的相互聚集，產(chǎn)生寬的顆粒范圍并粘附于管壁，這些都不利于獲得高的柱效。目前，對微顆粒填料的裝柱只能采用濕法完成。濕法也稱勻漿法，即以一合適的溶劑或混合溶劑作為分散介質(zhì)，使填料微粒在介質(zhì)中高度分散，形成勻漿，然后，用加壓介質(zhì)在高壓下將勾槳壓入柱管中，以制成具有均勻、緊密填充床的高效柱。柱再生：維護(hù)、保養(yǎng)、柱子的沖洗第三十九頁，共五十五頁，2022年，8月28日4．檢測器

1）紫外檢測器

ultraviolet-visibledetector,UVD高效液相色譜儀中應(yīng)用最廣泛的一種。是一種靈敏度和檢測精度都較高的選擇性濃度型檢測器。適用于在紫外可見區(qū)有吸收的樣品。作用原理：基于被分析樣品組分對特定波長紫外光的選擇性吸收，組分濃度與吸光度的關(guān)系遵守比耳(Beer)定律。

第四十頁，共五十五頁，2022年，8月28日紫外可見檢測器的優(yōu)缺點優(yōu)點;(1)靈敏度高，最小檢測濃度可達(dá)10-8g·mL-1；

(2)選擇性好，對柱溫控制精度要求不高，對流動相流速變化不敏感，適用梯度洗脫，對樣品無破壞性、線性范圍寬。缺點

(1)是對壓力變化敏感，要求用無脈沖泵；

(2)對在紫外可見光區(qū)無強(qiáng)吸收的組分，需要經(jīng)過衍生化，才可用紫外可見檢測器，如糖類、氨基酸、類酯化物等；

(3)不能用在紫外可見光區(qū)有吸收的溶劑作流動相。第四十一頁，共五十五頁，2022年，8月28日2）示差折光檢測器

refractiveindexdetector,RID

濃度型通用檢測器。利用折光率的差別，根據(jù)流動相中出現(xiàn)組分時，流動相折射率發(fā)生變化而設(shè)計的。優(yōu)點：對所有的物質(zhì)都有響應(yīng)；靈敏度可達(dá)到10-7g·mL-1缺點：對溫度變化很敏感；不能用于梯度洗提脫。第四十二頁，共五十五頁，2022年，8月28日3）電化學(xué)檢測器：electrochemicaldetector,ED

根據(jù)電化學(xué)分析方法設(shè)計的。電化學(xué)檢測器主要有兩種類型：一是根據(jù)溶液的導(dǎo)電性質(zhì)，通過測定離子溶液電導(dǎo)率的大小來測量離子濃度；另一類是根據(jù)化合物在電解池中工作電極上所發(fā)生的氧化-還原反應(yīng)，通過電位、電流和電量的測量，確定化合物在溶液中的濃度。電導(dǎo)檢測器是根據(jù)被測組分被淋洗下來后，流動相電導(dǎo)率發(fā)生變化的原理而設(shè)計的。它僅適用于水溶性流動相中離子型化合物的檢測，也是一種選擇性檢測器。缺點是靈敏度不高，對溫度敏感，需配以好的溫控系統(tǒng)，且不適于梯度淋洗。第四十三頁，共五十五頁，2022年，8月28日4）熒光檢測器（F1uorescenceDetector，F(xiàn)D）基于物質(zhì)經(jīng)紫外光照射后，發(fā)射出較原激發(fā)光波長長的二次（熒）光。在一定條件下熒光的強(qiáng)度與溶液中產(chǎn)生熒光物質(zhì)的濃度成正比。熒光檢測器為選擇性檢測器。有兩種類型的化合物可用其檢測：

(1)它們自身發(fā)射熒光;(2)通過衍生的方法使原來不發(fā)射熒光的化合物發(fā)射熒光.

很多生物活性物質(zhì)、藥物制品、環(huán)境污染物自身都能發(fā)射熒光。熒光檢測器由于具有很高的靈敏度和選擇性，因而成為液相色譜常用檢測器之一。但其適用范圍窄，應(yīng)用有一定局限性。第四十四頁，共五十五頁，2022年，8月28日第五節(jié)影響分離的因素1．第四十五頁，共五十五頁，2022年，8月28日續(xù)前2．對流動相的要求：1）與固定液不反應(yīng)2）對樣品有良好溶解度

k=1~10k=2~5最理想的3）與檢測器匹配：

UV（常用，測定波長應(yīng)大于溶劑的截止波長）熒光，電化學(xué)4）使用粘度小、純度高的流動相（甲醇，乙腈）使用前過濾、脫氣第四十六頁，共五十五頁，2022年，8月28日續(xù)前

3．洗脫方式1）等度洗脫（恒組成溶劑洗脫）以固定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫組分（一個泵）類似GC的等溫度洗脫2）梯度洗脫：在一定分析周期內(nèi)不斷變換流動相的種類和比例即不斷改變其極性（兩個泵）適于分析極性差別較大的復(fù)雜組分類似GC的程序升溫（沸程較長樣品）第四十七頁，共五十五頁，2022年，8月28日圖示第四十八頁，共五十五頁，2022年，8月28日第六節(jié)高效液相色譜法

在環(huán)境中的應(yīng)用1903年自Tswett開創(chuàng)色譜法以來，Tames和Martin、Kirkland和Small相繼報道了氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）和離子色譜法（IC）。在已知大約存在300萬種以上的化合物中，適于GC有效地進(jìn)行分析的揮發(fā)性、熱穩(wěn)定的化合物占20%左右，而HPLC可分析揮發(fā)性低、易受熱分解、離子型或大分子（分子量大于300以上）的化合物約占80%左右。離子色譜法可同時測定多種陰離子、陽離子和有機(jī)陰離子,優(yōu)于電化學(xué)法和原子吸收法。色譜法在環(huán)境監(jiān)測分析中已占有主導(dǎo)地位。第四十九頁，共五十五頁，2022年，8月28日高效液相色譜法是吸取了氣相色譜和經(jīng)典液相色譜的優(yōu)點，用現(xiàn)代化的手段加以改進(jìn)，已得到廣泛應(yīng)用,特別適用于分子量大、揮發(fā)性低、熱穩(wěn)定性差的有機(jī)污染物的分離和分析。如多環(huán)芳烴類、酚類、多氯聯(lián)苯、鄰苯二甲酸酯類、聯(lián)苯胺類、陰離子和非離子表面活性劑、有機(jī)農(nóng)藥、除草劑等。第五十頁，共五十五頁，2022年，8月28日環(huán)境樣品，無論是水質(zhì)、大氣、土壤或生物物質(zhì)，大都具有成分復(fù)雜、分析對象多、含量低等特點，某些本底值甚至只有ppt級；樣品性質(zhì)一般不夠穩(wěn)定，需要快速連續(xù)測定。HPLC具有高效、快速、靈敏度高、選擇性好等特點，特別適用于分離高沸點、難揮發(fā)、熱穩(wěn)定性差的高分子化合物，能滿足環(huán)境分析的這些要求，特別是對有機(jī)污染物的分析，更是其它分析手段難以比擬的。同時，離子色譜法的迅速發(fā)展，使得高效液相色譜法在測定有機(jī)和無機(jī)陰離子方面取得很好的成效。因此近年來高效液相色譜在大氣、水質(zhì)、土壤、生物等環(huán)境監(jiān)測中得到了廣泛地應(yīng)用和發(fā)展。第五十一頁，共五十五頁，2022年，8月28日大氣、降水、廢氣等監(jiān)測中的應(yīng)用

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