麻紡韌皮纖維脫膠用堿性果膠酶的制備及表征

麻紡韌皮纖維脫膠用堿性果膠酶的制備及表征PreparationandCharacterizationofPectateLyaseforBast-fibreDegumming摘要：麻類纖維作為一種高檔的天然纖維素纖維，有其他纖維難以比擬的優(yōu)勢：質(zhì)地輕、強力大、防蟲防霉、靜電少、吸濕散濕、透氣舒適、具有完全的生物降解性。在眾多的紡織纖維中，麻類纖維是極具發(fā)展?jié)摿Φ木G色環(huán)保纖維。然而，作為麻類纖維原料的原麻中含有大量的膠質(zhì)，如果膠、半纖維素、木質(zhì)素和蠟脂質(zhì)等，不能直接用于紡紗工藝，必須經(jīng)脫膠處理才能進行后續(xù)加工。目前，常用化學(xué)方法進行脫膠，但化學(xué)脫膠工藝過程不僅消耗大量的化工原料和能源，增加生產(chǎn)成本，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，而且化學(xué)試劑還損傷纖維結(jié)構(gòu)，使麻類纖維更加粗糙，可紡性降低。生物技術(shù)的發(fā)展為改變落后的脫膠工藝提供了契機。以生物酶為基礎(chǔ)的生物脫膠方法能夠克服化學(xué)脫膠的諸多缺點，工藝過程快速高效、低能耗、無污染，更為重要的是，具有底物專一性的生物酶能夠最大程度地保留麻類纖維的原有品質(zhì)。本課題一方面分離純化了實驗室篩選的BacillussubtilisA5發(fā)酵液中的堿性果膠酶；另一方面利用分子生物學(xué)方法，獲得了BacillussubtilisA5在麻類脫膠過程中發(fā)揮重要作用的堿性果膠酶基因(pel)，進一步構(gòu)建基因工程菌以表達可高度純化的重組堿性果膠酶。最后對所獲得的兩種酶進行酶學(xué)性質(zhì)及脫膠效果的比較研究。主要研究內(nèi)容結(jié)果如下：1、從中國湖南腐爛苧麻上篩選得到的BacillussubtilisA5是一種能產(chǎn)生具有脫膠活性的堿性果膠酶的微生物。其發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨鹽析分級沉淀、透析、離子交換層析、交聯(lián)葡聚糖凝膠層析純化，得到分子量約為45kD的堿性果膠酶。比酶活為5284.43U/mg，整個純化過程酶活回收率為4.24%，純化倍數(shù)為6.05倍。酶最適反應(yīng)溫度為50℃，最適pH為9.6，較能夠耐受高溫和堿性環(huán)境。Ca2+對其有一定的激活作用。Co2+，Ba2+和EDTA對其有強的抑制作用。2、根據(jù)GenBank上Bacillussubtilis編碼堿性果膠酶（pectatelyase）的基因(pel)序列，設(shè)計合成一對引物，以BacillussubtilisA5基因組DNA為模板，利用PCR技術(shù)擴增得到1260bp的DNA片段。序列測定表明，BacillussubtilisA5的pel基因序列與GenBank:X74880.1序列相比存在9處堿基差異，同源性為99.3%。經(jīng)過氨基酸密碼子翻譯后，除去氨基酸密碼子同義突變處，共有2處突變，氨基酸序列同源性為99.5%。BacillussubtilisA5的pel氨基酸序列與文獻中所報道的pel活性位點（鈣離子結(jié)合位點）以及鄰近鈣離子的保守氨基酸均為一致。將PCR擴增獲得的pel片段通過T載體連接，構(gòu)建克隆質(zhì)粒pMD-pel，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得重組轉(zhuǎn)化子。雙酶切克隆質(zhì)粒pMD-pel，得到具有SalI和NotI酶切位點的粘性末端片段pel。通過定向克隆技術(shù)，將表達載體pET-28a-c(+)和粘性末端片段pel進行T4連接反應(yīng)，構(gòu)建表達質(zhì)粒pET-pel，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，篩選后獲得表達宿主菌株。3、利用含表達質(zhì)粒pET-pel的大腸桿菌BL21(DE3)宿主進行誘導(dǎo)表達，產(chǎn)物經(jīng)NiSepharose6FastFlow親和純化及稀釋復(fù)性，得到分子量約為49kDa的重組果膠酶。比酶活為873.45U/mg，獲得的酶總量較大（3.6L發(fā)酵液中至少含4.4mg酶蛋白），純度很高。酶最適溫度為55℃，最適pH為9.6。與BacillussubtilisA5所產(chǎn)酶相比，重組果膠酶的耐高溫程度及耐堿性均有所提高。Ca2+同樣對其有激活作用，Ba2+對其有強的抑制作用。4、利用實驗制備的兩種酶在最適條件進行脫膠效果測定，通過立體顯微鏡、光學(xué)顯微鏡觀察，酶處理后的苧麻表面膠質(zhì)基本去除，纖維分散程度好。BacillussubtilisA5產(chǎn)果膠酶和重組果膠酶脫膠效果相差不大。由掃描電子顯微鏡觀察，未經(jīng)酶處理的原麻表面凹凸不平，有大量片狀膠質(zhì)，經(jīng)過酶處理后的纖維成分散狀，脫膠效果較好，纖維表面僅存在少許顆粒殘余，BacillussubtilisA5產(chǎn)果膠酶與重組果膠酶相比脫膠效果較好，表面更光滑。本課題從野生菌發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化和基因工程菌的構(gòu)建表達兩方面對堿性果膠酶進行制備，并研究了所獲得的兩種酶的酶學(xué)性質(zhì)及脫膠效果的比較。奠定了進一步研發(fā)高效脫膠酶制劑的基礎(chǔ)，為麻紡纖維原料的綠色加工提供理論和技術(shù)支撐。關(guān)鍵詞：堿性果膠酶，生物脫膠，分離純化，克隆表達，酶學(xué)性質(zhì)。Keywords:Pectatelyase,bio-degumming,Isolationandpurification,Cloneandexpression,Propertyofenzyme.第一章前言1．1麻類紡織品及麻紡纖維麻類紡織品被譽為綠色高檔紡織品，這種功能性紡織綠色產(chǎn)品以其天然的本質(zhì)和獨特的功能，在注重高品質(zhì)、個性化、時尚化、舒適性、健康環(huán)保的當(dāng)代紡織品消費觀念的影響下備受青睞。同時，麻類纖維還是產(chǎn)業(yè)用的優(yōu)質(zhì)材料，可制作植物培育墊、高速傳送帶、過濾材料、醫(yī)用紡織品、非木材紙、復(fù)合板材等。麻紡纖維是從各種麻類植物取得的纖維。其同棉纖維相同都屬于天然纖維，所不同的是麻纖維除主要成分為纖維素外，其非纖維素成分含量高，這些非纖維素成分統(tǒng)稱為膠質(zhì)。膠質(zhì)內(nèi)含有半纖維素、果膠、木質(zhì)素、水溶物、脂蠟質(zhì)、灰分等幾種物質(zhì)[1]。紡織用麻纖維即是指從原麻中脫去部分或全部膠質(zhì)而分離出的纖維。在植物學(xué)上麻纖維分為韌皮纖維和葉纖維兩大類[2]：韌皮纖維是指從雙子葉植物的莖桿韌皮部分剝?nèi)〉睦w維。這種纖維一般較為柔軟，也稱“軟質(zhì)纖維”。苧麻、亞麻、黃麻、洋麻、大麻、苘麻及羅布麻均屬于這類纖維。葉纖維是指從單子葉植物的葉梢部得到的纖維。這種纖維一般較為粗硬，故亦稱“硬質(zhì)纖維”。劍麻、西沙爾麻、蕉麻、馬尼拉麻、菠蘿麻均屬于這類纖維。韌皮纖維中的苧麻、亞麻是優(yōu)良的麻種，其纖維木質(zhì)化程度低，強度高，伸長小，柔軟細長，可紡性能好，用它們織成的織物挺括，吸汗，不貼身，透氣，涼爽，是織造夏季衣料的良好材料。黃麻、大麻、洋麻等纖維較粗，且短，適宜于包裝材料：麻袋、麻繩等。葉纖維中劍麻和蕉麻在經(jīng)濟上較有實用價值，因纖維細胞壁木質(zhì)化程度高，長度較長，伸長小，強度好，耐腐蝕，耐海水浸泡，常用于做航船和礦井用的繩纜，也可編粗麻袋或包裝用布。（軟質(zhì)纖維和硬質(zhì)纖維在制備麻紡織物時有何區(qū)別？）麻類韌皮纖維開發(fā)的功能性麻紡織品不僅是符合綠色消費的環(huán)保產(chǎn)品，而且已被公認為是一種典型的原料型保健紡織品。具有纖維長、強度高；透氣性好，傳熱快，吸水多而散濕快；纖維強力大而延伸度?。徊蝗菀资苊咕g和蟲蛀等特點。1．2中國麻紡織業(yè)概況我國是世界上麻類資源最豐富的國家，有亞麻、劍麻、大麻、羅布麻、苧麻，在品種、質(zhì)量和數(shù)量上都占有明顯的優(yōu)勢。我國的原麻種植、紡織加工和技術(shù)開發(fā)等均處于世界先進水平。我國的麻紡織工業(yè)具有完整的生產(chǎn)體系和相當(dāng)?shù)囊?guī)模，是世界麻紡織大國，苧麻紡織、亞麻紡織的生產(chǎn)和貿(mào)易居世界首位。主要麻紡織品產(chǎn)銷量，麻紗線、織物、制成品及服裝出口持續(xù)增長[3]。中國近幾年來我國政治、經(jīng)濟良性發(fā)展，促進了我國麻紡織行業(yè)的發(fā)展。在國家的“十一五”發(fā)展綱要中，提到了“加快非棉類織紡織資源的開發(fā)和利用”這一條，尤其是提到了加快麻紡織品發(fā)展的相關(guān)問題。國內(nèi)棉花的原料缺口以及化纖原料居高不下的進口依存度所構(gòu)成的“結(jié)構(gòu)性矛盾”為麻紡產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了空間。而我國麻類纖維資源非常豐富，因此，大力發(fā)展麻類纖維原料、加快麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展、對于改善紡織天然纖維原料結(jié)構(gòu)具有積極意義。另一方面，麻作為天然纖維的高舒適性并深受人民群眾喜愛等一系列優(yōu)勢也使整個行業(yè)的發(fā)展具備潛力。然而，“綠色環(huán)保”是21世紀(jì)社會發(fā)展的一大標(biāo)志，麻類纖維屬于生態(tài)纖維，但麻紡織加工尚未達到生態(tài)標(biāo)準(zhǔn)，麻類脫膠生產(chǎn)中的廢水污染等問題仍普遍存在，并急需解決。要使麻類紡織品成為真正的生態(tài)紡織品，麻類脫膠污染是當(dāng)前我國麻紡織行業(yè)攻關(guān)的方向，也是我們迎接新世紀(jì)經(jīng)濟競爭的重要手段。因此，對于有著生態(tài)特征的麻紡產(chǎn)業(yè)，把排污和清潔生產(chǎn)做好對促進行業(yè)的健康發(fā)展，提高競爭力，加速產(chǎn)業(yè)升級有著十分重要的意義。（請增加原麻解剖結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成方面的內(nèi)容！?。。?．3原麻的脫膠及其方法半纖維素、果膠物質(zhì)和木質(zhì)素等雜質(zhì)包圍在纖維的外表，使纖維膠結(jié)在一起而呈堅固的片條狀物質(zhì)，即原麻。干燥后的原麻含有60-70%纖維素和30-35%非纖維素的膠質(zhì)成份。這些膠質(zhì)都是高分子化合物，多半是多聚糖類碳水化合物，少量為芳香族化合物。主要含有半纖維素、果膠質(zhì)、木質(zhì)素、水溶物、脂蠟質(zhì)、灰分等。其中果膠質(zhì)、半纖維素、木質(zhì)素是主要成分。原麻是不能直接用來紡紗的，在紡紗之前必須將韌皮中的膠質(zhì)去除，并使麻單纖維相互分離，這一過程就稱“脫膠”。一般有如下方法：1．3．1天然水漚麻微生物脫膠法將砍下來的麻株或剝下來的麻皮就地浸泡于天然水域中進行微生物厭氧發(fā)酵脫膠，利用水中各種微生物的聯(lián)合作用將高分子化合物的膠質(zhì)分解成為小分子的化合物，從而將纖維素提取出來的方法。天然水漚麻脫膠中所用菌種都是自然界中天然存在的，不需另外單獨培養(yǎng)，脫膠過程主要是厭氧性微生物在起作用。這種方法主要有以下缺點：需要大量的水，因此限制了麻在缺水地區(qū)的加工；受季節(jié)、氣候的影響很大，產(chǎn)量、質(zhì)量不穩(wěn)定；脫膠時間太長；會對農(nóng)村水域造成嚴(yán)重污染。1．3．2化學(xué)脫膠法該方法為麻脫膠所采用的主要方法。它是利用麻中的膠質(zhì)和纖維素對酸、堿、氧化物的作用性質(zhì)不同"通過煮練水洗等化學(xué)、物理機械手段使膠質(zhì)與纖維分離?；瘜W(xué)脫膠法分為高溫高壓和常溫常壓兩大類，視原麻品質(zhì)和紡紗工藝的不同要求采取不同的脫膠工藝，高溫高壓煮練，脫膠速度快，膠質(zhì)去除多，精干麻品質(zhì)較好，但是纖維制成率較低，制成的工藝?yán)w維長度較短。常溫常壓煮練，脫膠速度慢，膠質(zhì)去除較少，精干麻纖維分離度較差，纖維制成率較高，但制成的工藝?yán)w維長度較長。目前國內(nèi)外苧麻脫膠廣泛采用以燒堿煮煉為中心的化學(xué)脫膠方法[4-9]，即“浸酸、二煮”的老工藝。流程如下：扎把→裝籠→水解處理→水洗→煮練(I)→水洗→煮練(II)→水洗→打纖→漂酸洗→脫水→抖松→裝籠→給油→脫油→抖松→烘干。“浸酸、二煮”是指韌皮經(jīng)酸浸泡后，在堿液中煮兩次制得其纖維(精干麻)的工藝過程。這個老工藝存在流程長、工序多、手工操作多、勞動強度大、脫膠工藝時間長、能耗高、脫膠質(zhì)量影響織物外觀等問題，不能適應(yīng)高檔、高支織物紡織的需要。1．3．3微生物脫膠法[10]微生物脫膠是把經(jīng)過篩選的脫膠菌進行擴大培養(yǎng)后接種到麻上，在適宜環(huán)境條件下，培育針對麻的高效專用脫膠細菌來分解膠質(zhì)，而保留纖維素成分。以麻上的膠質(zhì)為營養(yǎng)源，讓脫膠菌在麻上大量繁殖，在脫膠菌繁殖過程中，分泌出酶物質(zhì)來分解膠質(zhì)，使高分子量的果膠及半纖維素等大分子分解成低分子物質(zhì)而溶于水中，最后實現(xiàn)纖維的相互分離，即在緩和的條件下進行的一系列“膠養(yǎng)菌，菌產(chǎn)酶，酶脫膠”的生化反應(yīng)。1．3．4酶法脫膠[11，12]酶法脫膠就是將脫膠菌培養(yǎng)到菌生長的衰老期后進行過濾或離心等處理，再用得到的粗酶液浸漬原麻，也可將粗酶液提純，濃縮為液劑，或者將該濃縮液干燥成為粉劑。使用時將液劑稀釋或?qū)⒎蹌┤苡谒?，把原麻浸漬在酶稀釋液中進行酶解脫膠。酶法脫膠研究較晚，主要面向苧麻、亞麻、紅麻、黃麻等。酶法脫膠工藝無需專用設(shè)備，快速高效，無污染，生產(chǎn)的精干麻質(zhì)量好。但就目前來說，產(chǎn)酶菌種或酶制劑的酶活力太低，酶制劑價格過高，導(dǎo)致脫膠成本過高。1．3．5生物化學(xué)聯(lián)合脫膠法[13]隨著生物技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了對麻進行預(yù)微生物或酶處理的生物與化學(xué)相結(jié)合的脫膠方法，使麻類的脫膠研究取得了一定的突破。生物化學(xué)聯(lián)合脫膠就是將經(jīng)過微生物脫膠法或酶制劑脫膠法處理后的脫膠麻再用化學(xué)脫膠法處理一次，以提高纖維質(zhì)量。我國苧麻脫膠幾十年來一直沿用化學(xué)方法，雖然在脫膠工藝和助劑方面作了許多改進，但是沒有脫離化學(xué)脫膠的范疇。傳統(tǒng)的化學(xué)脫膠利用原麻中纖維素和膠質(zhì)成分對堿、無機酸和氧化劑作用穩(wěn)定性的不同，以去除原麻中的膠質(zhì)成分，而保留纖維素成分。該脫膠方法不僅消耗大量的堿、酸等化工原料和能源，增加了生產(chǎn)成本，而且化學(xué)脫膠廢水造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，國內(nèi)還沒有一家麻紡廠治理脫膠廢水已經(jīng)完全過關(guān)。其次，化學(xué)脫膠破壞了麻纖維的結(jié)構(gòu)，使麻纖維更加粗糙，可紡性差、制成率低。當(dāng)今世界高新技術(shù)迅速發(fā)展，生物技術(shù)己經(jīng)滲透到各個行業(yè)，利用生物技術(shù)進行苧麻脫膠不但可以節(jié)約大量的化工原料和能源，降低生產(chǎn)成本，而且可以大大減輕脫膠廢水造成的污染，還可以提高苧麻纖維的可紡性，應(yīng)用生物技術(shù)將徹底改變苧麻脫膠的落后面貌。因此，發(fā)展生物脫膠是麻紡行業(yè)可持續(xù)發(fā)展的保證。為了解決麻紡纖維化學(xué)脫膠工藝存在的成本高、污染嚴(yán)重等難題，國內(nèi)外許多科技工作者已經(jīng)在生物脫膠方面進行了多年的探索。總體來說這類探索目前僅局限于實驗室中或停留在中間試驗階段，至今還沒有在工業(yè)生產(chǎn)中大量的推廣應(yīng)用。1．4果膠質(zhì)及果膠酶1．4．1果膠質(zhì)果膠質(zhì)是由不同酯化度的半乳糖醛酸以α-1,4糖苷鍵聚合而成的多糖鏈，常具由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等組成的側(cè)鏈[14]。它存在于植物細胞壁和細胞間層中，為細胞的支撐物質(zhì)，使兩個相鄰細胞結(jié)合在一起。根據(jù)果膠質(zhì)分子酯化度不同，果膠質(zhì)可分為三類[1]：(1)果膠酸（PGA）：是由D-半乳糖醛酸脫水縮合，以α-1,4糖苷鍵連接形成的直鏈狀半乳糖醛酸聚合物。(2)果膠（PMGA）：是由鼠李糖與多個PGA連結(jié)成的鼠李糖-半乳糖醛酸聚糖為主鏈，由D-半乳糖、L-阿拉伯糖及木糖等分別組成長短不同的側(cè)鏈的多支鏈分子。酯化程度不高，可以是膠體或具有溶解性。(3)原果膠（Protopectin）：果膠分子與細胞壁的其他糖類組分、多價金屬離子、蛋白質(zhì)分子等連接在一起的大分子物質(zhì)。在天然植物中，果膠質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)因植物的種類、組織部位、生長條件等的不同而不同[2]。麻類植物中果膠質(zhì)的主要成分為果膠酸及其衍生物，主要有果膠酸的鈣、鎂鹽及果膠酸甲酯。果膠質(zhì)與其他膠雜質(zhì)如半纖維素、木質(zhì)素等大分子之間具有廣泛的聯(lián)系，相互間形成具網(wǎng)絡(luò)體系的復(fù)合體結(jié)構(gòu)，將麻纖維一根根地粘連在一起，形成纖維束，這些纖維束又進而粘在一起形成厚厚的韌皮部。麻類脫膠的目的就是要破壞韌皮部纖維束與周圍組織的粘結(jié)程度，使果膠大分子鏈斷裂，進而使膠雜質(zhì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)松散，提高膠雜質(zhì)在水中的溶解度，以達到徹底去除的目的。麻類在進行紡織前，必須把果膠類物質(zhì)處理掉，以便能進行后續(xù)加工，而果膠酶能夠滿足這些工藝的要求。同時也對麻的質(zhì)量也有所提高，使得果膠酶在紡織行業(yè)中得到廣泛的應(yīng)用（是否可刪掉這一段？應(yīng)該重點談果膠酶，特別是微生物產(chǎn)生的果膠酶。）。1．4．2果膠酶幾十年來人們根據(jù)經(jīng)驗及大量的試驗，篩選出了一系列的高效脫膠菌株，如：Erwiniasp[15],Rhizomucorpusillu[16],Bacillussp.MG-cp-2[17],BacillusNo.P-4-N[18]等，應(yīng)用范圍幾乎包括所有主要麻類。雖然屬于不同的種屬，脫膠作用基本上都是利用它們所產(chǎn)生的果膠酶來實現(xiàn)的，所以人們將果膠酶作為脫膠的關(guān)鍵酶及衡量標(biāo)準(zhǔn)。通常情況下，果膠酶一般可分為以下三種類型：(1)原果膠酶(Protopectinase，PPase)，能將不溶性原果膠有限地水解為水溶性果膠（如糖醛酸的甲酯）和切斷聚甲氧基半乳糖醛和阿拉伯糖之間的化學(xué)鍵。(2)果膠酯酶(Pectinesterase，PE)，能隨機切除甲酯化果膠中的甲氧基團，形成果膠酸。(3)果膠解聚酶(Depolymerizingenzymes)，能夠降解果膠糖苷鍵。按作用類型又可細分為果膠水解酶(hydrolyzingglycosidiclinkages)和果膠裂解酶(cleavingglycosidiclinkages)。其中，果膠水解酶的作用是水解果膠糖苷鍵，包括聚半乳糖醛酸酶(polygalacluronases，PG)和聚甲基半乳糖醛酸酶(polymethyl-galacturoases，PMG)；果膠裂解酶的作用是通過β消除反應(yīng)使糖苷鍵斷裂，該酶攻擊底物的糖苷鍵在鄰近羧基或酯化的羧基一邊發(fā)生β消除，包括聚半乳糖醛酸裂解酶(polygalacturonatelyases，PGL)和聚甲基半乳糖醛酸裂解酶(polymelhyl-galacturonatelyases，PMGL)。果膠水解酶和果膠裂解酶均有內(nèi)切酶(endo-)和外切酶(exo-)之分。產(chǎn)果膠酶的真菌主要有曲霉屬(Aspergillus)，青霉屬(Penicillium)，盾殼霉屬(Coniothyrium)，鐮孢屬(Fusarium)，克魯維氏酵母(Kluyveromyoes)等。產(chǎn)果膠酶的細菌主要有假單胞桿菌屬(Pseudomonas)，黃單胞桿菌屬(Xanthomonas)，歐文桿菌屬(Erwinia)，芽胞桿菌屬(Bacillus)，梭菌屬(Clostridium)。由于真菌中的黑曲霉（Aspergillusniger）屬于公認安全級(GRAS,GeneralRegardedAsSafe)，其代謝產(chǎn)物是安全的，因此目前市售的食品級果膠酶主要來源于黑曲霉，最適pH值一般在酸性范圍[19]。而最適合用于麻類脫膠堿性環(huán)境的堿性果膠酶通常指內(nèi)切聚半乳糖醛酸裂解酶(endo-PGL)（EC4.2.2.2）[20]，其最適pH在8-10。這類酶能夠隨機裂解果膠酸的α-1,4糖苷鍵，將多聚半乳糖醛酸降解為半乳糖醛酸產(chǎn)物（圖1）。用堿性果膠酶處理，代替堿對棉、麻等織物進行煮練加工和整理工藝，以去除初生胞壁中的果膠物質(zhì)，在比較緩和的pH值和溫度條件下使處理后的織物手感柔軟，強度高，取代了耗能大、污染嚴(yán)重的傳統(tǒng)熱堿脫膠工藝另外，可避免因微生物處理造成的纖維素的降解[18,21]。圖1內(nèi)切聚半乳糖醛酸裂解酶（EC4.2.2.2）作用模型近年來，人們篩選發(fā)現(xiàn)了許多來源于微生物的堿性果膠酶如Aspergillusflavus[22]、Acrophialophoranainiana[23]、BacilluspumilusBK2[24]等。果膠酶除了在紡織工業(yè)中有重要應(yīng)用外，在造紙[25]、食品加工[26]、飼料加工[27]、植物抗病[28]、治療胃石[29]等方面都有重大的應(yīng)用價值。1.5堿性果膠酶的分離純化現(xiàn)有的酶的分離純化方法都是以酶與其它蛋自在理化性質(zhì)、穩(wěn)定性上的差異以及酶的生物特性為依據(jù)而建立起來的[30,31]，包括：(1)根據(jù)溶解度不同，有鹽析法、有機溶劑沉淀法、共沉淀法、選擇性沉淀法、等電點沉淀法、液-液分離法以及結(jié)晶法等。(2)根據(jù)分子大小的差別，有凝膠過濾(層析)法、透析、超濾法及超離心法等。(3)根據(jù)電學(xué)、解離性質(zhì)，有吸附層析法、離子交換層析法、電泳法以及聚焦層析法、疏水層析法等。(4)基于酶和底物、輔助因子以及抑制劑間具有專一的親和作用特點而建立的親和層析法、親和電泳法、融合蛋白親和分離法、金屬整合層析法、染料配體親和層析法、共價層析法和免疫吸附層析法等。(5)利用穩(wěn)定性差異而建立的選擇性熱變性法、酸堿變性法和表面變性法等。(6)高效液相色譜法(HPLC)是近年來層析技術(shù)上的一大進展。它是凝膠過濾層析、離子交換層析、疏水層析和親和層析等技術(shù)應(yīng)用上的一個發(fā)展新階段，它以這些層析的原理為基礎(chǔ)，但是具有更高的效率、更高的分辨與更快的速度。它已成為蛋白質(zhì)分離、純化的有力工具。近年來，國內(nèi)外對一些微生物來源的堿性果膠酶進行了分離純化方面的研究。顏濤等[32]通過丙酮沉淀，陽離子交換層析，凝膠過濾，從苧麻脫膠菌BacillussubtilisNo.16A發(fā)酵液中純化了分子量為30.2KD的聚半乳糖醛酸酶（PGase），該酶最適作用pH為9，最適作用溫度為50℃，在55℃以下、中性pH(6-8）范圍內(nèi)穩(wěn)定，Ca2+、Mg2+對該酶有激活作用，Co2+、Hg2+有抑制作用。Kobayashi等[33]純化Bacillussp.KSM—P576堿性高分子量外切聚半乳糖醛酸酶，研究了其酶學(xué)性質(zhì)，并得到N端氨基酸序列為：Thr–Glu–Val–Ser–Pro–Lys–Ser–Pro–Ala–Ser–Pro–Val。Suryakant等[34]對Fusariummoniliforme堿性果膠酶進行了分離純化，并研究了其性質(zhì)和酶反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)。Maria等[23]對Acrophialophoranainiana堿性果膠酶進行了分離純化，并著重進行了物理化學(xué)研究。Barbara等[24]對BacilluspumilusBK2堿性果膠酶進行了分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究，并進行了生物精練試驗（實驗結(jié)果？）。總的來看，堿性果膠酶的分離純化一般先用沉淀法或超濾法將粗酶液中的雜質(zhì)大部分去除，減小后續(xù)分離純化步驟的負荷，再用柱層析的方法如離子交換、凝膠過濾等進行較細致的分離純化，最后用電泳檢測酶的純度和分子量。1．6堿性果膠酶的基因表達隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷提高，基因克隆技術(shù)已經(jīng)能夠成熟地實現(xiàn)某個基因?qū)肫渌拗骷毎羞M行表達。近年來，堿性果膠酶的分子生物學(xué)研究在不斷地深入，己從許多種屬微生物中克隆了基因并測序，對其結(jié)構(gòu)、功能、調(diào)控等方面進行了深入探討。Nikaidou等[35]克隆并測序了PseudomonasmarginalisN6301的果膠裂解酶的核酸序列。Hatada等[36]從Erwiniacarotovora中克隆了果膠酶基因，并在Escherichiacoli中進行了表達。Wagner等[37]克隆了Penicilliumsonii的兩個PG基因pg1和pg2，它們分別由370和380個氨基酸組成，并研究了對基因pgl和pg2定點破壞后其表達的PG酶活變化。Hatada等[38]克隆并測定了一個源于Bacillus的高度適應(yīng)堿性的果膠酶基因。Berensmeier等[39]從Bacilluslicheniformis14A中克隆了一個pelA基因，并對重組蛋白進行了生物化學(xué)性質(zhì)及熱穩(wěn)定性測定。Matsumoto等[40]在Escherichiacoli中高效表達了來源于Bacillussubtilis的果膠裂解酶融合蛋白，并進行了一步純化的研究。Nasser等[41]克隆了Bacillussubtilis基因，并研究了基因的分子生物學(xué)性質(zhì)。Stephen等[42]克隆并表達了TreponemapectinovononATCC33768PL的pelA基因，并比較了重組與未重組果膠裂解酶具有相同的性質(zhì)，比如：最適pH值、酶活對Ca2+的依賴以及酶活被Zn2+所抑制。Jeffrey等[43]克隆和鑒定了Aspergilluspavasiticus的一種新PG編碼基因，利用PCR合成探針從A．parasiticuscDNA文庫分離到PG編碼基因pecA．，并以DNA序列分析和氨基酸序列分析證明其與其他真菌的PG在核酸和氨基酸水平上的相似性。1.7大腸桿菌表達系統(tǒng)及融合表達1.7.1大腸桿菌基因表達系統(tǒng)目前，已被用于表達外源蛋白質(zhì)的表達系統(tǒng)有細菌（大腸桿菌和枯草桿菌）、酵母、昆蟲、植物和哺乳動物細胞等。對于原核來源的目的基因而言，大腸桿菌表達系統(tǒng)具有明顯的優(yōu)越性。大腸桿菌屬革蘭氏陰性菌，它是目前為止研究得最為詳盡、應(yīng)用最為廣泛的原核生物種類之一，也是基因工程研究和應(yīng)用中發(fā)展最為完善和成熟的載體受體系統(tǒng)。大腸桿菌表達體系的優(yōu)越性：全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架；基因克隆表達系統(tǒng)成熟完善，特別是對于基因表達調(diào)控的分子機理有深刻的了解；繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定、成本低廉，易用于批量生產(chǎn)；被美國FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物是一種安全的基因工程實驗體系，擁有各類適用的寄主菌株和不同類型的載體。一個完整的表達系統(tǒng)通常包括配套的表達載體和表達菌株。如果是特殊的誘導(dǎo)表達還包括誘導(dǎo)劑；融合表達還包括純化系統(tǒng)或者Tag檢測等。選擇表達系統(tǒng)通常要根據(jù)實驗?zāi)康膩砜紤]，比如表達量高低，目標(biāo)蛋白的活性，表達產(chǎn)物的純化方法等。在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細胞內(nèi)，被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體（InclusionBodies，IB）。富含蛋白質(zhì)的包涵體多見于生長在含有氨基酸類似物培養(yǎng)基的大腸桿菌細胞中，由這些氨基酸類似物所合成的蛋白質(zhì)往往會喪失其理化特性和生物功能，從而集聚形成包涵體。由高效表達質(zhì)粒構(gòu)建的大腸桿菌工程菌大量合成非天然性的同源或異源蛋白質(zhì)，后者在一般情況下也以包涵體的形式存在于細菌細胞內(nèi)。包涵體表達形式的優(yōu)點：在一定程度上保持表達產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；能夠避免細胞內(nèi)蛋白水解酶的作用，有利于目標(biāo)蛋白的富集；簡化外源基因表達產(chǎn)物的分離操作；包涵體的水難溶性及其密度遠大于其它細胞碎片和細胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細菌裂解物中分離出來；能夠表達對大腸桿菌宿主有毒或有致死效應(yīng)的目標(biāo)蛋白。包涵體表達形式的缺點：以包涵體形式表達的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象（因而具有生物活性）的目標(biāo)蛋白，因此包涵體變復(fù)性操作的效率對目標(biāo)產(chǎn)物的收率至關(guān)重要。經(jīng)過復(fù)性處理的目標(biāo)蛋白不一定能完全恢復(fù)原來的生物學(xué)活性，有時甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白分子中的Cys殘基數(shù)目較高時，體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)?，一般不超過30%。復(fù)性處理工藝使目標(biāo)蛋白的制備成本上升。1．7．2融合表達隨著生物技術(shù)的進步，特別是基因工程的迅猛發(fā)展，表達蛋白已經(jīng)變得很容易，相對而言，純化卻是一個非常繁雜的工作，所以越來越多的研究者把需要表達的目標(biāo)蛋白和親和純化用的標(biāo)簽融合表達。生物分子間存在很多特異性的相互作用，它們之間都能夠?qū)Ｒ欢赡娴慕Y(jié)合，這種結(jié)合力就稱為親和力。親和層析就是通過將具有親和力的兩個分子中一個固定在不溶性基質(zhì)上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對另一個分子進行分離純化。被固定在基質(zhì)上的分子稱為配體，配體和基質(zhì)是共價結(jié)合的，構(gòu)成親和層析的固定相，稱為親和吸附劑。親和層析時首先選擇與待分離的生物大分子有親和力物質(zhì)作為配體，并將配體共價結(jié)合在適當(dāng)?shù)牟蝗苄曰|(zhì)上。將制備的親和吸附劑裝柱平衡，當(dāng)樣品溶液通過親和層析柱的時候，待分離的生物分子就與配體發(fā)生特異性的結(jié)合，從而留在固定相上；而其它雜質(zhì)不能與配體結(jié)合，仍在流動相中，并隨洗脫液流出，這樣層析柱中就只有待分離的生物分子。通過適當(dāng)?shù)南疵撘簩⑵鋸呐潴w上洗脫下來，就得到了純化的待分離物質(zhì)。所謂標(biāo)簽融合表達，是指表達載體的多克隆位點上有一段融合表達標(biāo)簽（Tag），表達產(chǎn)物為融合蛋白（有分N端或者C端融合表達），方便后繼親和純化步驟。對于特別小的分子建議用較大的Tag（如GST）以獲得穩(wěn)定表達；而一般的基因多選擇小Tag以減少對目的蛋白的影響。常見的融合標(biāo)簽、純化用的填料或配基及純化洗脫方法見表1。標(biāo)簽純化用的填料或配基純化洗脫方法多聚組氨酸（6XHis）螯合鎳、銅、鈷離子填料咪唑或降低pH谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)酶（GST）鍵合谷胱甘肽親和填料10-20mM還原谷胱甘肽麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）淀粉瓊脂糖凝膠麥芽糖金黃色葡萄球菌蛋白AIgG瓊脂糖凝膠低pHFlagpeptide抗Flag抗體,M1,M2低pH或EDTA多聚精氨酸（Poly-Arg）SP瓊脂糖凝膠高鹽多聚半胱氨酸（Poly-Cys）活化巰基瓊脂糖凝膠DTT多聚苯丙氨酸（Poly-Phe）苯基瓊脂糖凝膠乙二醇鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽鈣調(diào)蛋白EGTA纖維素結(jié)合域纖維素鹽酸胍或脲幾丁質(zhì)結(jié)合域幾丁質(zhì)巰基乙醇，半胱氨酸表1：常見的融合標(biāo)簽、純化用的填料或配基及純化洗脫方法1．7．3His-Tag融合蛋白His-Tag（組氨酸標(biāo)簽）融合蛋白是目前最常見的表達方式，它的優(yōu)點是表達方便而且基本不影響蛋白的活性，無論是表達的蛋白是可溶性的或者包涵體都可以用固定金屬離子親和色譜（IMAC）純化。固定金屬離子親和色譜（IMAC）是利用蛋白質(zhì)表面的一些氨基酸，如組氨酸能與多種過渡金屬離子Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，F(xiàn)e3+發(fā)生特殊的相互作用，利用這個原理可以把富含這類氨基酸的蛋白質(zhì)吸附，從而達到分離的目的。由于這個原因，偶聯(lián)這些金屬離子的瓊脂糖凝膠就能夠選擇性地分離出這些含有多個組氨酸的蛋白以及對金屬離子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。而組氨酸是與固定化金屬離子作用最強的氨基酸,組氨酸的咪唑環(huán)作為電子供體容易與固定的金屬離子形成配位鍵.基質(zhì)材料洗滌之后,可通過調(diào)節(jié)柱緩沖液的pH使組氨酸充分質(zhì)子化，或者添加游離咪唑，使組氨酸不再與Ni2+結(jié)合，洗脫下含多聚氨基酸序列的肽類。氮川三乙酸鎳（nickel-nitrilotriaceticacid，Ni-NTA），是金屬親和層析填料，有4個金屬螯合位點，能更牢固定Ni離子，避免其他同類填料容易在清洗過程中因固定不牢離子脫落而造成的產(chǎn)物回收率低等問題。Ni-NTA及其與組氨酸配位鍵形成見圖2。圖2Ni-NTA及其與組氨酸配位鍵形成金屬鎳離子被螯合到固相支持物共價結(jié)合的反應(yīng)性基團上，當(dāng)融合蛋白溶液流經(jīng)親和純化介質(zhì)時，融合蛋白被特異親和吸附，雜質(zhì)被洗掉后再洗脫目標(biāo)蛋白。組氨酸標(biāo)記在一般或變性條件（如8M尿素）下借助它能與Ni2+螯合柱緊緊結(jié)合的能力，用咪唑洗脫，或?qū)H降至5.9使組氨酸充分質(zhì)子化，不再與結(jié)合Ni2+使之得以分離純化。1．8本課題的研究意義及內(nèi)容1．8．1本課題的研究意義以生物分離工程的基本原理為依據(jù)，為尋找高效環(huán)保的生物脫膠方法，從實驗室自行篩選的BacillussubtilisA5發(fā)酵液中分離純化出堿性果膠酶；并通過對野生型高效脫膠菌種進行分子生物學(xué)解析，獲得在脫膠過程中發(fā)揮重要作用的堿性果膠酶基因，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建基因工程菌表達可高度純化的重組堿性果膠酶。以堿性果膠酶的制備為切入點，構(gòu)建快速高效、無污染的實驗室水平酶法脫膠體系，為麻紡纖維原料的綠色加工提供理論和技術(shù)支撐。1．8．2本課題的研究內(nèi)容1）通過鹽析、透析、離子交換層析、交聯(lián)葡聚糖凝膠層析從BacillussubtilisA5發(fā)酵液中分離純化出堿性果膠酶，并SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測純化組分。2）通過在NCBI上查找堿性果膠酶基因序列，設(shè)計引物，從BacillussubtilisA5中擴增，進行亞克隆。3）從亞克隆載體上獲得堿性果膠酶基因，構(gòu)建帶有His-Tag的融合蛋白，并用親和層析進行純化。4）從最適溫度、最適pH、溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性及金屬離子的影響等方面對野生菌純化酶及重組酶進行酶學(xué)性質(zhì)研究。并進行脫膠試驗。第2章BacillussubtilisA5產(chǎn)堿性果膠酶的分離純化2.1實驗設(shè)備、材料和試劑2.1.1主要儀器設(shè)備玻璃儀器：試管，量筒，培養(yǎng)皿，錐形瓶，燒杯，玻璃棒，研缽（所有玻璃儀器出自海門海博）其他實驗儀器：主要設(shè)備生產(chǎn)廠家4℃冰箱/-20℃低溫冰箱西門子ThemoscientificForma-86℃UTIFreezerThemoWP800TL23-K3微波爐佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器EL104電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）托盤天平馬頭牌JYT-5pHS-J4PH/mv計上海天達儀器DYY-6B型電泳儀北京六一儀器廠雪花制冰機CommercialQT-1漩渦混合器上海琪特分析儀器WFZUV2100紫外可見光光度計尤尼柯（上海）儀器隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱GHP-9080上海齊欣醫(yī)療器械DK-8D電熱恒溫水槽上海森信實驗儀器生物潔凈工作臺博訊實業(yè)醫(yī)療儀器廠微量加樣器ThermoLabSystem（2、20、200、1000、5000μl）ThermoLabSystem計時器TIANGEN公司81-2恒溫磁力攪拌器上海閔行虹浦儀器廠九陽電磁灶山東九陽家電高速臺式離心機上海安亭科學(xué)儀器廠HITACHICR21GⅡ高速離心機HitanhiKoki.Co.,Ltd,madeinJapan大容量全溫振蕩培養(yǎng)箱DQHZ-2021B型太全市華美生化儀器廠YXQ-LS-50SI立式壓力蒸汽滅菌鍋上海博訊實業(yè)醫(yī)療設(shè)備廠電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱黃石市恒豐醫(yī)療器械循環(huán)水式真空泵于華牌干燥器啟東市呂四玻璃廠透析袋（截留分子量25kD）上海生工BioLogicTMLP系統(tǒng)BIO-RAD離子交換層析柱（26mm×600mm）上海錦華交聯(lián)葡聚糖凝膠層析柱（10mm×300mm）上海錦華2.1.2材料實驗用原麻采自夏末秋初，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)苧麻研究所麻園，苧麻干燥后，用手輕捻掉其上殘留的少量黑皮，剪掉苧麻的較硬的頭部和細碎的梢部，只留纖維均一的中間部分用于試驗。2.1.3常用試劑和培養(yǎng)基的配制2.1.3.1試劑蛋白胨UNIPATHLTD.牛肉膏國藥磷酸氫二鉀國藥硫酸銨BBI無水乙醇上海玻爾硫酸國藥氯化鈣國藥磷酸國藥磷酸二氫鉀國藥亞硫酸鈉江蘇永華甘氨酸國藥氫氧化鈉國藥D-半乳糖醛酸Sigma聚半乳糖醛酸Sigma三羥甲基氨基甲烷（Tris）BBIBSABBI公司氯化鈉國藥PrestainedProteinMolecularWeightMarkerFermentas丙烯酰胺(Acr)BBI甲叉雙丙烯酰胺(Bis)BBI過硫酸銨AMRESCON,N,N,N，一四甲基乙二胺(TEMED)AMRESCO考馬斯亮藍G250上海生工BME(β-巰基乙醇)上海捷瑞溴酚藍Sigma甲醇國藥冰乙酸國藥2.1.3.2實驗用溶液甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（0.05mol/L，pH9.0）：50ml0.2mol/L甘氨酸+8.8ml0.2mol/L氫氧化鈉，加水稀釋至200ml。底物聚半乳糖醛酸：在500ml甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（0.05mol/L，pH9.0）中溶解1g聚半乳糖醛酸和24.42g氯化鈣。5×G250緩沖液：250mgG250，125ml乙醇，250ml磷酸，加水至500ml。離子交換起始緩沖液：磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉pH7.0的緩沖液。離子交換洗脫緩沖液：含0.1-1MNaCl的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉pH7.0的緩沖液。凝膠層析平衡洗脫緩沖液：磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉pH7.0的緩沖液。SDS（10%W/V）：20gSDS溶于ddH2O中，至終體積200ml，溶液應(yīng)透明無色。室溫下溶液數(shù)周之內(nèi)穩(wěn)定，但遇冷則產(chǎn)生沉淀。分離膠緩沖液（1.5MTris-HCl,pH8.8）：54.45gTris+70~80mlddH2O溶解，用1NHCl調(diào)pH至8.8后，再加水定容至300ml，4℃貯存。濃縮膠緩沖液（0.5MTris-HCl,pH6.8）：18gTris+90mlddH2O溶解，用1NHCl調(diào)pH至6.8后，再加水定容至300ml，4℃貯存。5×SDS上樣緩沖液（0.1MTris-HClpH6.8，20%甘油，0.2%溴酚藍，4%SDS，5%BME）過硫酸銨（10%W/V）：稱取0.1g過硫酸銨于1.5ml的Eppendorf離心管中，充分溶解于1ml滅菌ddH2O中，臨用前配制?？捡R斯亮蘭染液：配制ddH2O：甲醇：冰乙酸=5：5：2（V:V:V）溶液1200ml；水500ml+甲醇500ml+冰乙酸200ml混合均勻。稱取考馬斯亮蘭R-2501.2g溶于上述溶液中，配成0.1%濃度。使用前經(jīng)濾紙除去不溶物質(zhì)。脫色液：95%乙醇500ml+冰乙酸160ml+水1340ml，混合均勻。5×電泳緩沖液：Tris30g，甘氨酸188g，10%SDS100ml，加ddH2O定容至2L，4℃貯存。使用前如有沉淀發(fā)生，37℃加熱溶解。2.1.3.3培養(yǎng)液、培養(yǎng)基種子培養(yǎng)液：蛋白胨10g牛肉膏3g氯化鈉5g水1000mLpH7.0-7.2苧麻發(fā)酵培養(yǎng)基：原麻（2cm小段）5g硫酸銨0.5g磷酸氫二鉀0.1g硫酸鎂0.05g氯化鉀0.05g硫酸亞鐵0.001水100mLpH82．1．4菌種以實驗室自行篩選的BacillussubtilisA5作為產(chǎn)酶菌種。2．2實驗方法2．2．1生長曲線制作及發(fā)酵培養(yǎng)2．2．1．1制備種子液用接種針挑取少量在斜面上保藏的BacillussubtilisA5菌落，在若干只裝有5ml種子培養(yǎng)液的試管中接種。37℃，200rpm下培養(yǎng)24h。作為種子液備用。2．2．1．2接種及生長曲線制作將已活化的種子液接種于苧麻培養(yǎng)基中，40℃，pH8，接種量5%，200rpm，培養(yǎng)，四小時取一次樣，測定菌濃度、酶活。2．2．1．3發(fā)酵培養(yǎng)根據(jù)生長曲線，選擇合適條件發(fā)酵培養(yǎng)：將已活化的種子液接種至裝有400ml苧麻培養(yǎng)基的三角燒瓶中，200rpm，40℃，pH8，搖床培養(yǎng)48小時。2．2．2酶活及蛋白濃度的測定2．2．2．1堿性果膠酶的酶活測定參照文獻[44]，選用不飽和半乳糖醛酸法測定酶活。1）果膠酶活定義：1個果膠酶活力單位定義為：一定條件下，每分鐘由聚半乳糖醛酸釋放1mg的D-半乳糖醛酸所需酶量。(U/ml)即：式中：U—酶活力單位（U/ml）；G—酶解液中還原性醛基含量（mg）；N—酶液稀釋倍數(shù)；V—加酶液量（ml）；t—酶解時間（h）。2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作標(biāo)準(zhǔn)D-半乳糖醛酸曲線：取100mg/ml標(biāo)準(zhǔn)D-半乳糖醛酸液各0，0.05，0.1，0.15，0.2，0..25，0.3，0.35，0.4，0.45，0.5ml補加水至2.0ml,加0.03mol/L磷酸3ml，在波長為235nm下測定吸光度。,3次重復(fù)實驗的均值用最小乘法相擬合Y=ax+b一元線性方程。由光密度值引得D-半乳糖醛酸量，可以用來測定堿性果膠酶活性。3）酶活測定堿性果膠酶酶活的測定：底物為聚半乳糖醛酸（PGA），酶液體積20μl，PGA溶液（PGA溶于0.2mol/LpH9.0的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，其中含有0.44mol/L的氯化鈣）濃度為0.2%，用量為2ml，反應(yīng)溫度為45℃，時間為15min，0.03mol/L磷酸終止劑用量3ml，在波長為235nm下測定吸光度。2．2．2．2蛋白濃度的測定1）蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線制定BSA儲液20μg/μl序號BSA質(zhì)量μgBSA體積μl水的體積μl①101.1438.9②202.2437.8③252.75437.25④303.3436.7⑤353.85436.15⑥404.4435.6⑦454.95435.05⑧505.5434.5⑨556.05433.95?、?⑨各200μl，加入4mlG250緩沖液，混勻，2min后，在波長為595nm下測定吸光度。2）蛋白濃度測定方法在小試管中加入4mlG250緩沖液，再加入200μl樣品，混勻，2min后，在595nm下測量吸光度。2．2．3分離純化2．2．3．1鹽析將發(fā)酵完畢的苧麻培養(yǎng)基發(fā)酵液均分至離心管中，配平，8000rpm離心5min，棄去沉淀，將上清液收集至大燒杯中，用0%，10%,20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%飽和度的硫酸銨逐級鹽析發(fā)酵液，獲得鹽析曲線。選擇最適鹽析范圍后大量鹽析，獲得大量目的蛋白。2．2．3．2透析將鹽析后的發(fā)酵液裝入截留分子量為25kD的透析袋中，在pH7.0的磷酸鹽緩沖液中，4℃，透析過夜。透析袋的前處理：⑴.把透析袋剪成適當(dāng)長度（10-20cm）的小段，注意帶手套。⑵.在大體積的2%(W/V)碳酸氫鈉和1mmol/LEDTA(pH8.0)中將透析袋煮沸10分鐘。⑶.用蒸餾水徹底清洗透析袋。⑷.放在1mmol/LEDTA(pH8.0)中將之煮沸10分鐘。⑸.冷卻后，存放于4攝氏度，必須確保透析袋始終浸沒在溶液內(nèi)。從此時起取用透析袋時必須戴手套。⑹.用前在透析袋內(nèi)裝滿水然后排出，將之清洗干凈。2．2．3．3離子交換層析1）劑型的選擇：DEAE-52離子交換劑2）膨脹活化：DEAE-52的用量則根據(jù)柱容積的大小和所需過柱樣品的量來決定。一般是1.0gDEAE-52相當(dāng)于6ml～8ml柱床體積。稱取所需的量，撒于0.5Mol/LNaOH溶液中（1gDEAE-52干粉約需15倍NaOH液），浸泡1h左右，不時攪拌。抽濾（以布氏漏斗加兩層濾紙抽濾），以蒸餾水洗滌，再抽濾，直至濾液近中性為止，再將DEAE-52浸泡于0.5Mol/LHCl中1h，同樣抽濾液至近中性。再將DEAE-52浸于0.5Mol/LNaOH液中，同樣處理，洗至中性。3）上柱條件和洗脫條件的確定：1））上柱PH值的確立：在小離心管中用不同pH（7，7.5，8，8.5，9）的磷酸鹽緩沖液洗滌膠體，加入適量透析后酶液，再加入相應(yīng)緩沖液，每隔五分鐘混勻，半小時后測定上清殘余酶活。2））洗脫條件的確立用不同NaCl濃度的磷酸鹽緩沖液洗脫已上柱的膠體，每隔五分鐘混勻，半小時后測定上清酶活。4）平衡：將DEAE-52放入pH7磷酸鹽緩沖液中（起始緩沖液），靜止1h，不時攪拌，待膠體下沉后，傾去上清液或抽濾除去洗液，如此反復(fù)幾次至傾出液體的pH值與加入的磷酸鹽緩沖液的pH值相近時為止。5）裝柱裝柱時，將柱下端連接細塑料管，夾上螺旋夾。把層析柱垂直固定在三角鐵架上，倒入起始緩沖液至一半的柱高，除去死區(qū)及塑料管內(nèi)的氣泡。再將平衡的DEAE-52糊狀物沿管壁倒入柱中。注意不要產(chǎn)生氣泡，如有氣泡應(yīng)排除或重裝。擰開螺旋夾，使流速至1ml/5min，待緩沖液快接近膠體面時，繼續(xù)倒入膠體，同時用玻璃棒攪拌表面層，以免使兩次加入的膠體形成分界層，通過進出緩沖液調(diào)節(jié)流量，也可通過塑料管的升降來控制，至柱床體積不變?yōu)橹?。剪一圓形濾紙（與柱內(nèi)徑大小一致），從柱的上端輕輕放入，使其沉接于膠體表面，以免在加樣時打亂膠體層。裝好柱的柱面應(yīng)該是平整的，無傾斜，整個柱床內(nèi)無氣泡、不分層。繼續(xù)平衡，使流出液的pH值與流入液的pH值完全一致為止。6）上樣要層析的酶液樣品首先用起始緩沖液（4℃）平衡過夜。將柱的上端打開，用吸管將填料柱上面的緩沖液吸出，不要吸凈，留一薄層液面，以免空氣進入。沿管壁緩緩加入樣品，注意不要打亂填料表層。擰開下端的螺旋夾，使樣品進入交換劑中，快要進完時，加1ml～2ml緩沖液沖洗柱壁，隨即用多量的洗脫液洗脫。樣品的加量與DEAE-52有一個最適比的關(guān)系，超過這個比值，吸附就不完全，直接影響到分離的純度。7）洗脫加樣后，用起始緩沖液進行平衡，洗脫流速為1ml/min，洗去未被DEAE-52凝膠吸附的雜蛋白，待層析柱流出液在核酸蛋白檢測儀上繪出的基線穩(wěn)定，用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉pH7.0的緩沖液NaCl梯度洗脫（濃度為0-1mol/LNaCl），層析柱聯(lián)上梯度混合器，混合器中分別為500ml磷酸鹽pH7.0緩沖液和500ml含1mol/LNaCl的磷酸鹽pH7.0緩沖液。洗脫流速為1ml/min，每5ml接一管，洗脫至緩沖溶液流完為止。跟蹤測定各管的堿性果膠酶活力，將堿性果膠酶活力高的若干管酶液集中，測量總體積（ml數(shù)），并留樣用于堿性果膠酶蛋白含量測定、堿性果膠酶活力測定、交聯(lián)葡聚糖凝膠層析，樣品低溫－4℃保存。2．2．3．4交聯(lián)葡聚糖凝膠層析1）劑型的選擇：由于目標(biāo)果膠酶的分子量大小為43KD，而葡聚糖凝膠G-75的分離范圍為3000-70000，且適用于蛋白及多糖的純化和分離，故選擇葡聚糖凝膠G-75。2）膠體溶脹：在室溫下，將膠體干粉浸泡于蒸餾水中24小時。3）裝柱：將柱子及其附件清洗干凈先將下口接好，加上緩沖液，將出口處的汽泡排除，待柱內(nèi)剩有2cm左右液柱時，關(guān)緊流出口，將己溶脹好的凝膠的上清液吸去，輕輕攪拌凝膠順層析柱或玻璃棒一次性傾倒入層析柱，待底部自然沉降有一定凝膠后，打開流出口，直至凝膠沉積至所需高度。加蓋，并接上貯液瓶，開始滴注洗脫平衡液（磷酸鹽緩沖液）。至少要滴注2個柱床體積的洗液，使膠床穩(wěn)定。并檢查柱子裝得是否均勻、有無斷層，有無汽泡。4）上樣：吸去柱床上的溶液，直至膠面剛露出為止。將樣品沿柱壁四周緩慢加入勿攪動膠面。打開下流出口，使樣品進入膠床。再如上法，加1－2次小體積的洗脫液沖洗內(nèi)壁，完成后，將洗脫劑與流入口相接進行洗脫。5）洗脫：加樣后，用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉pH7.0的緩沖液洗脫，洗脫流速為1ml/min，每5ml接一管，待層析柱流出液在核酸蛋白檢測儀上會出的基線穩(wěn)定為止。將果膠酶活力高的若干管酶液集中，測量總體積（ml數(shù)），并留樣用于堿性果膠酶蛋白含量測定、堿性果膠酶活力測定、SDS分析、酶的基本性質(zhì)實驗，樣品低溫－4℃保存。2．2．4SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測2．2．4．1制膠⑴將玻璃板、海綿墊條及電泳槽洗凈，晾干。⑵裝配：將玻板放在灌膠架上，用長尾夾固定，構(gòu)成灌膠三夾板。⑶用無水乙醇檢查灌膠裝置三邊是否密封得很好。⑷按照如下配方在燒杯中配制10%分離膠(10ml)：ddH2O4.8ml分離膠緩沖液2.5ml10%（W/V）SDS100μl40%Acrylamide2.5ml10%過硫酸銨100μlTEMED4μl加入TEMED前混勻其他各成分，向同一個方向緩和旋轉(zhuǎn)液體（防止氣泡的產(chǎn)生）緩和均勻。加入TEMED后，繼續(xù)同樣方法混勻，緩和灌入分離膠，防止氣泡的產(chǎn)生，保留2cm長的位置以灌制濃縮膠，用ddH2O封閉膠面，防止形成氣泡和隔絕空氣，使膠面壓緊平整。靜止45~60min，使分離膠聚合，水與凝固的膠面有折射率不同的界線出現(xiàn)。用濾紙條吸去多余的水。準(zhǔn)備配制濃縮膠。⑸按照如下配方在燒杯中配制5%濃縮膠(4ml)：ddH2O2.42ml濃縮膠緩沖液1.0ml10%（W/V）SDS40μl40%Acrylamide0.5ml10%過硫酸銨40μlTEMED4μl加入TEMED前同樣混勻其他各成分，向同一個方向緩和旋轉(zhuǎn)液體（防止氣泡的產(chǎn)生）緩和均勻。加入TEMED后，繼續(xù)同樣方法混勻，緩和灌入濃縮膠，防止氣泡的產(chǎn)生，輕輕插入梳子，小心避免產(chǎn)生氣泡。靜止45~60min，使?jié)饪s膠聚合。小心撥出梳子。用噴射的蒸餾水洗凈凝膠頂部，除去未聚會的丙烯酰胺和其他雜質(zhì)。⑹將凝膠固定于電泳裝置上，上、下電極槽中加入電泳緩沖液；用電泳緩沖液反復(fù)噴射沖洗凝膠上的加樣孔。2．2．4．2樣品制備⑴每個加樣孔上樣量2μl，凝膠體積變化時，樣品量根據(jù)實驗情況適量調(diào)整，以能獲得最佳靈敏度和分辨率為準(zhǔn)；上樣前樣品中的蛋白質(zhì)濃度應(yīng)預(yù)先測定，計算出適當(dāng)?shù)臉悠飞蠘芋w積，必要時應(yīng)對樣品進行稀釋或濃縮。⑵吸取一定的量樣品置于1.5mlEppendorf離心管中，用ddH2O將樣品體積調(diào)至40μl，加入5×樣品緩沖液10μl，混勻，即為上樣溶液。置沸水中5min，使蛋白變性，-20℃冷卻備用。⑶加樣時拿出各凍存的樣品溶解，離心，取上清液加樣。2．2．4．3蛋白質(zhì)Marker的準(zhǔn)備將Marker開封后，分裝入0.5mlEppendorf離心管中（10μl），-20℃保存?zhèn)溆?，使用前置室溫融化后，與95℃保溫5min，冰上冷卻片刻，離心，上樣。2．2．4．4電泳⑴微量注射器分別吸取3μl樣品液、5μl蛋白Marker，沿玻板壁小心加入梳孔中，使沉入梳孔底部。⑵按照樣品端與陰極緩沖液接通，另一端與陽極緩沖液相連，注意避免有氣泡。⑶根據(jù)凝膠的大小、濃度和進行電泳的蛋白質(zhì)樣品，電流選擇10mA穩(wěn)定直流電流，對樣品進行100min的電泳。⑷電泳結(jié)束后，關(guān)掉電源，倒凈電泳緩沖液，取下膠板2．2．4．5染色⑴染色小心將玻板去除，取下膠，放入平板中。將凝膠用至少5倍的考馬斯亮蘭染色液浸泡，放在脫色搖床上緩慢搖2~3小時。⑵脫色將使用后的染色液倒出，加入脫色液，同樣置于脫色搖床上浸泡、脫色，必要時過夜。脫色期間，更換脫色液幾次，直至凝膠上背景與蛋白質(zhì)帶的對比度明顯、蛋白質(zhì)帶清晰可見、背景顯色很淺為止。⑶脫色結(jié)束后，取下凝膠進行照相記錄，將凝膠保存在20%甘油中。2.3結(jié)果與分析2.3.1D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線表2D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)還原糖量（mg）05101520253035404550吸光度均值（A）0．0000.0060.0120.0180.0230.0300.0360.0420.0470.0530.059圖3D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線2.3.2蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線表3蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)BSA（ug/200ul）010202530354045505560吸光度均值（A）00.8750.1440.2020.2530.2620.3010.3720.3710.4110.450圖4蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線2.3.3BacillussubtilisA5生長曲線及酶活曲線圖5BacillussubtilisA5生長曲線及酶活曲線■酶活曲線◆OD600由圖5可知，起始發(fā)酵0-12h，A5菌處于延滯期，由于利用堿性果膠酶分解膠質(zhì)產(chǎn)生營養(yǎng)物，發(fā)酵起始時使得酶活先于菌濃度上升，隨后，12-32hA5菌處于指數(shù)生長期，堿性果膠酶酶活程平緩上升趨勢，至32-52h時，A5菌處于平穩(wěn)期，其中48h時酶活及菌濃度均處于頂峰，故用培養(yǎng)48小時的菌液進行分離純化為最佳。此時，測得發(fā)酵液酶活為144.167U/ml，蛋白濃度為0.165mg/ml，比酶活為873.03U/mg。2.3.4硫酸銨鹽析曲線2.3.4.1鹽析后的上清液圖6鹽析上清液酶活曲線由圖6可知，鹽析后上清液在硫酸銨飽和度為30%的時候，酶活力開始急劇下降，至80%飽和度時基本接近平緩，故說明硫酸銨飽和度在30%至80%區(qū)間內(nèi)可大量析出堿性果膠酶。2.3.4.2鹽析后的沉淀圖7鹽析沉淀酶活曲線由圖7可知，堿性果膠酶鹽析沉淀的酶活變化為：在硫酸銨飽和度達到30%時，其相對酶活急劇上升，故結(jié)合4.4.1可知：堿性果膠酶在硫酸銨飽和度為30%-80%時大量析出。此時測得80%硫酸銨沉淀的發(fā)酵粗酶液酶活為2415.28U/ml，蛋白濃度為0.8678mg/ml,比酶活2783.219U/mg。2.3.5離子交換層析2.3.5.1上柱pH的確立圖8不同上柱pH對酶活力的影響由圖8可知，在pH7條件下，酶液樣品中的堿性果膠酶與填料DEAE結(jié)合率為最高，使得上清液中的酶活接近于0，故把上柱pH確立為pH7。2.3.5.2NaCl(M)洗脫條件圖9NaCl(M)濃度對酶活的影響由圖9可知，當(dāng)NaCl濃度達到O.1M時，被吸附酶基本被洗脫下來。因此確定，NaCl初始洗脫濃度為0.1M。2.3.5.3洗脫曲線蛋白相對濃度以收集管最高濃度為基準(zhǔn)，相對酶活是以收集管中最高酶活為基準(zhǔn)。上透析后酶液樣品1ml 圖10離子交換層析圖◆UV■相對酶活--NaCl（M）由圖10可知，隨著氯化鈉濃度的增高，吸附在填料DEAE上的蛋白逐步被洗脫下來，顯然，蛋白濃度在7-12管（0.1MNaCl洗脫）和14-18管（1MNaCl洗脫）時出現(xiàn)兩個檢測峰，而酶活在9-13管時出現(xiàn)一個峰值，故收集9-13管并儲存于4℃冰箱中，用于后續(xù)交聯(lián)葡聚糖凝膠層析的純化。2.3.6交聯(lián)葡聚糖凝膠層析蛋白相對濃度以收集管最高濃度為基準(zhǔn)，相對酶活是以收集管中最高酶活為基準(zhǔn)。圖11交聯(lián)葡聚糖凝膠層析曲線■相對酶活◆UV由圖11可知，在第19、25、42、46管中先后出現(xiàn)幾個不同大小的蛋白檢測峰。經(jīng)過測定，在第42管出現(xiàn)一個明顯的酶活峰（38-49管），所以第42管左右出現(xiàn)的蛋白可能是該酶蛋白，收集38-49管，用于電泳檢測及酶學(xué)性質(zhì)研究。2.3.7純化結(jié)果2.3.7.1各步驟純化結(jié)果表4純化結(jié)果操作步驟酶活U/ml總酶活U蛋白濃度mg/ml總蛋白mg比酶活U/mg純化倍數(shù)單元操作純化倍數(shù)收率%發(fā)酵液144.1667144166.70.165165873.0311100鹽析2415.278120763.90.86743.392783.2193.183.1883.77透析1849.72255491.670.63819.1542897.1323.311.0438.49離子交換74.3888917853.330.01784.2724179.1514.781.4412.38凝膠層析58.833336118.6670.0111.1575284.4316.051.264.24果膠酶純化結(jié)果如表4所示。整個純化過程酶活回收率為4.24%。純化倍數(shù)為6.05倍。果膠酶粗酶液經(jīng)30%，80％飽和度硫酸銨分級沉淀后回收率從100%略降至83.77%，繼而進行透析，透析后果膠酶回收率僅剩38.49%，由此可知，透析一步損耗了大部分果膠酶活，由于純化步驟稍多，因此不可避免地伴隨著酶的失活，從而導(dǎo)致酶活收率及純化倍數(shù)不是十分理想，整個純化流程有待進一步優(yōu)化。2.3.7.2SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測圖12SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖1：純化后酶樣品M：PrestainedProteinMolecularWeightMarker.由圖12可知，將凝膠層析后的酶液進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，表現(xiàn)為一條譜帶，大小約為45kD，與預(yù)計大小相符。2．4結(jié)論（1）BacillussubtilisA5發(fā)酵情況：起始發(fā)酵0-12h，A5菌處于延滯期，由于利用堿性果膠酶分解膠質(zhì)產(chǎn)生營養(yǎng)物，發(fā)酵起始時使得酶活先于菌濃度上升，隨后，12-32hA5菌處于指數(shù)生長期，堿性果膠酶酶活程平緩上升趨勢，至32-52h時，A5菌處于平穩(wěn)期，其中48h時酶活及菌濃度均處于頂峰，故用培養(yǎng)48小時的菌液進行分離純化為最佳。（2）純化過程中：鹽析時，硫酸銨飽和度在30%至80%區(qū)間內(nèi)可大量析出堿性果膠酶。離子交換層析時，在pH7條件下，酶液樣品中的堿性果膠酶與填料DEAE結(jié)合為最好，當(dāng)NaCl濃度達到O.1M時，被吸附酶基本被洗脫下來。隨著氯化鈉濃度的增高，吸附在填料DEAE上的蛋白逐步被洗脫下來，蛋白濃度在0.1MNaCl洗脫和1MNaCl洗脫時出現(xiàn)兩個檢測峰，而酶活在0.1MNaCl時出現(xiàn)一個峰值。葡聚糖凝膠層析時，出現(xiàn)一個明顯的酶活峰。（3）堿性果膠酶純化結(jié)果：整個純化過程酶活回收率為4.24%。純化倍數(shù)為6.05倍。堿性果膠酶粗酶液經(jīng)30%，80％飽和度硫酸銨分級沉淀后回收率從100%略降至83.77%，繼而進行透析，透析后堿性果膠酶回收率僅剩38.49%，由此可知，透析一步損耗了大部分堿性果膠酶，由于純化步驟稍多，因此不可避免地伴隨著酶的失活，從而導(dǎo)致酶活收率及純化倍數(shù)不是十分理想，整個純化流程有待進一步優(yōu)化。將純化的酶進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，表現(xiàn)為一條譜帶，大小約為45kD，與預(yù)計大小相符。第3章BacillussubtilisA5堿性果膠酶基因的克隆構(gòu)建3.1實驗設(shè)備、材料和試劑3.1.1主要儀器設(shè)備玻璃儀器：試管，量筒，培養(yǎng)皿，錐形瓶，燒杯，玻璃棒，研缽（所有玻璃儀器出自海門海博）其他實驗儀器：主要設(shè)備生產(chǎn)廠家4℃冰箱/-20℃低溫冰箱西門子ThemoscientificForma-86℃UTIFreezerThemoWP800TL23-K3微波爐佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器EL104電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）pHS-J4PH/mv計上海天達儀器DYY-6B型電泳儀北京六一儀器廠雪花制冰機CommercialQT-1漩渦混合器上海琪特分析儀器WFZUV2100紫外可見光光度計尤尼柯（上海）儀器隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱GHP-9080上海齊欣醫(yī)療器械DK-8D電熱恒溫水槽上海森信實驗儀器生物潔凈工作臺博訊實業(yè)醫(yī)療儀器廠微量加樣器ThermoLabSystem（2、20、200、1000、5000μl）ThermoLabSystem計時器TIANGEN公司81-2恒溫磁力攪拌器上海閔行虹浦儀器廠九陽電磁灶山東九陽家電高速臺式離心機上海安亭科學(xué)儀器廠HITACHICR21GⅡ高速離心機HitanhiKoki.Co.,Ltd,madeinJapan大容量全溫振蕩培養(yǎng)箱DQHZ-2021B型太全市華美生化儀器廠YXQ-LS-50SI立式壓力蒸汽滅菌鍋上海博訊實業(yè)醫(yī)療設(shè)備廠電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱黃石市恒豐醫(yī)療器械循環(huán)水式真空泵于華牌iCyclerPCR儀Bio-rad紫外凝膠成像儀3.1.2常用試劑和培養(yǎng)基的配制3.1.2.1試劑胰蛋白胨OXOID公司酵母提取物OXOID公司氯化鈉國藥瓊脂糖博大泰克氯化鈣國藥氨芐青霉素博大泰克瓊脂粉國藥甘油國藥卡那霉素博大泰克無水乙醇上海玻爾鹽酸國藥氫氧化鈉國藥EDTA國藥TrisBBI溴化乙錠BBIdNTPTaKaRaPfu聚合酶Frementas10×pfubuffer（withMg2+）FrementasTaqDNA聚合酶Frementas10×taqbuffer（withMg2+）FrementasNotI內(nèi)切酶FrementasSalI內(nèi)切酶Frementas10×TangoBufferFrementasT4DNA連接酶Frementas10×T4ligationBufferFrementasGeneRulerTM1kbDNALadderFrementas6×DNALoadingDyeFrementasGenomicDNARapidIsolationKit,forBacterialCell博大泰克AxyPrepDNAGelExtractionKitAXYGENAxyPrepPCRCleanupKitAXYGENB型質(zhì)?？焖傩×砍樘嵩噭┖胁┐筇┛?.1.2.2實驗用溶液10×CaCl2轉(zhuǎn)化緩沖液：稱取CaCl211.1g，加80mlddH2O溶解，再加ddH2O定容至100m1，以0.22μm濾膜過濾除菌，-20℃保存。臨用時用無菌水10倍稀釋。lmol/LTris-Cl(pH8.0)：稱取Tris堿121.1g,溶于650mlddH2O中，用6mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0，定容至1L,121℃高壓蒸氣滅菌20min。0.5MEDTA(pH8.0)：稱取186.1gEDTA，置于1L燒杯中，加入約800m1ddH2O，充分?jǐn)嚢?，加NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0（約20gNaOH），加入ddH2O將溶液定容至1L,適量分成小份后，121℃高壓蒸氣滅菌20min。1mol/LTris-HCl緩沖液(含EDTA·2Na5mmol/L)(pH7.0)：稱取Tris堿12.114g,EDTA·2Na0.1816g,溶于80mlddH2O中，用6mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0，定容至100ml,121℃高壓蒸氣滅菌20min。50XTAE(pH8.0)：稱取Tris242g，加0.5MEDTA·2H2O37.2g(pH8.0)，向燒杯中加入約800ml的ddH2O，充分?jǐn)嚢枞芙狻＜尤?7.1ml的無水乙酸，充分?jǐn)嚢?，再加入ddH2O將溶液定容至1L。電泳時，稀釋50倍，用1XTAE。100mg/ml氨芐青霉素儲液：稱取0.5g氨芐青霉素溶于5m1滅菌ddH2O中，0.22μm濾膜過濾除菌，-20℃保存。工作濃度:100μg/ml。30mg/ml卡那霉素儲液：稱取0.15g氨芐青霉素溶于5m1滅菌ddH2O中，0.22μm濾膜過濾除菌，-20℃保存。工作濃度:30μg/ml。3.1.2.3培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基：稱取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，加去離子水800m1加熱攪拌溶解，以5mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，用去離子水定容至1L,121℃高壓蒸氣滅菌20min。LB固體培養(yǎng)基在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上含1.5%~2.0%的瓊脂粉。3．1．4菌種、質(zhì)粒克隆菌株DH5α和表達菌株BL21(DE3)為實驗室保存。克隆載體pMD18-T購自TaKaRa，表達載體pET-28a-c(+)購自Nvagen。3．2實驗方法3．2．1BacillussubtilisA5基因組DNA的提取取保存于斜面上的BacillussubtilisA5單菌落接種于5mlLB液體培養(yǎng)基，于37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)24h。取1.5ml培養(yǎng)物離心收集菌體，按照博大泰克“GenomicDNARapidIsolationKit,forBacterialCell”操作說明書提取基因組總DNA，取5μl用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組提取產(chǎn)物，紫外凝膠成像儀中觀察并記錄結(jié)果。3．2．2pel基因的PCR擴增及產(chǎn)物純化3．2．2．1引物設(shè)計根據(jù)NCBI上Bacillussubtilis的堿性果膠酶（pectatelyase）的基因序列（pel，GenBank:X74880.1），結(jié)合克隆質(zhì)粒pMD18-T、表達質(zhì)粒pET-28a-c(+)的多克隆位點，運用PrimerPremier5.0軟件進行引物設(shè)計，上游引物5'端添加SalI酶切位點，下游引物5’端添加NotI酶切位點，酶切位點前加保護性堿基。所用引物見表5，陰影部分為添加的限制性核酸內(nèi)切酶位點。由于表達質(zhì)粒pET-28a-c(+)序列自帶ATG起始密碼子，故此處不再設(shè)計ATG。表5pel引物合成表及其上的酶切位點引物引物長度引物序列（5’→3’）酶切位點上游36ACGCGTCGACGCAAAAAAGTGATGTTAGCTACGGCTSalI:GTCGAC下游35ATTTGCGGCCGCATTAATTTAATTTACCCGCACCCGNotI:GCGGCCGC3．2．2．2pel基因的高保真PCR擴增為保證對野生菌基因克隆準(zhǔn)確性的效果，采用高保真DNA聚合酶pfu酶作為PCR反應(yīng)的DNA聚合酶，可校正PCR擴增過程中產(chǎn)生的錯誤，使產(chǎn)物的堿基錯配率極低。以BacillussubtilisA5基因組DNA為模板，擴增目的pel基因。按表6加樣。PCR擴增的條件：95℃預(yù)變性5min;然后進入循環(huán)，變性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min，共30個循環(huán)；72℃延伸10min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。表6pel基因高保真PCR擴增加樣體系試劑試驗管/μl滅菌ddH2O14.110×pfubuffer（withMg2+）2dNTPs(10mM)0.5上游引物(10mM)0.5下游引物(10mM)0.5pfu聚合酶(2.5U/μl)0.4模板DNA2.0總體積20.03．2．2．3pel基因的高保真PCR產(chǎn)物的純化在長波紫外燈下用清洗過的刀片切下含有所需DNA帶的凝膠條，盡量將不含有DNA片段的空白凝膠切掉，置于新的滅菌的1.5mLEppendorf管中。用離心機快速離心，將凝膠甩入Eppendorf離心管底。稱重后，按照AXYGEN的“AxyPrepDNAGelExtractionKit”的操作方法對PCR產(chǎn)物進行純化。3．2．2．4PCR純化產(chǎn)物片段3'端加A反應(yīng)由于pfuDNA聚合酶PCR產(chǎn)物為平端，無3'端突出的單A核苷酸，不能直接用于TA克隆，故采用TaqDNA聚合酶對產(chǎn)物的3'端做加A的反應(yīng)。按表7加樣，置70°C下反應(yīng)30min。表7TaqDNA聚合酶3'端加A反應(yīng)體系試劑試驗管/μlPCR純化產(chǎn)物片段1010×taqbuffer（withMg2+）2dNTPs(10mM)0.5taq聚合酶(5U/μl)0.2滅菌ddH2O7.3總體積20.0反應(yīng)完畢后，按照AXYGEN的“AxyPrepPCRCleanupKit”的操作方法對反應(yīng)產(chǎn)物進行純化。純化后目的產(chǎn)物進行1%膠的瓊脂糖電泳，檢測目的產(chǎn)物的濃度。3．2．3pel基因TA克隆重組子的構(gòu)建及鑒定3．2．3．1目的片段與TA載體連接根據(jù)3．2．2．4中目的產(chǎn)物片段的濃度，按照T載體與目的產(chǎn)物片段的摩爾比1：1進行TA克隆。參照TaKaRapMD18–TDNA片段克隆試劑盒說明書，按表8加樣。表8PCR純化產(chǎn)物與T載體連接的反應(yīng)體系試劑試驗管/μlpMD18-T1.0目的產(chǎn)物片段1.0ddH2O3.0總體積5.0加入5μl（等量）的SolutionI。12000rpm短促離心2s，用手輕彈管壁使各成分混合均勻，再短促離心2s，16℃連接過夜，得到連接產(chǎn)物，冰上短暫