實驗轉(zhuǎn)基因生物的GUS檢測

實驗轉(zhuǎn)基因生物的GUS檢測第1頁/共15頁實驗八、轉(zhuǎn)基因生物的GUS檢測實驗?zāi)康模和ㄟ^GUS(β-葡萄糖苷酸酶)活性測定，了解報告基因在基因工程中的應(yīng)用。技術(shù)應(yīng)用：1.

Gus基因與目的基因連接構(gòu)建融合基因進(jìn)行組織定位；2.gus基因與啟動子連接來研究啟動子的表達(dá)的組織特異性。要求：了解通過顯色反應(yīng)檢驗外源基因的表達(dá)情況的方法，了解報告基因的概念。第2頁/共15頁材料：轉(zhuǎn)化的植物組織、器官、原生質(zhì)體、種子的胚及萌發(fā)的幼苗等。非轉(zhuǎn)化的相同材料（陰性對照）。試劑：

5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X－Gluc）；N-N-二甲基甲酰胺(DMF)；NaH2PO4；Na2HPO4

；Na2EDTA；Triton-100；K3[Fe(CN)6]（鐵氰化鉀）；K4[Fe(CN)6]（亞鐵氰化鉀）第3頁/共15頁原理

適宜的反應(yīng)條件下，β-葡萄糖苷酸酶（GUS）可將X－Gluc水解成藍(lán)色物質(zhì)，因此具有GUS活性的部位或位點呈現(xiàn)藍(lán)色或藍(lán)色斑點，可用肉眼或顯微鏡觀察到。第4頁/共15頁相關(guān)知識鏈接——標(biāo)記基因

標(biāo)記基因是幫助對轉(zhuǎn)基因生物體進(jìn)行篩選和鑒定的一類外源基因，包括選擇標(biāo)記基因和報告基因。常用的選擇標(biāo)記基因包括有抗生素抗性基因和除草劑抗性基因（Bar基因）。標(biāo)記基因通常與目的基因構(gòu)建在同一表達(dá)載體上，一起轉(zhuǎn)入生物，但有時，標(biāo)記基因本身就是目的基因，如除草劑抗性基因。第5頁/共15頁報告基因是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是一個其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，從而利用它的表達(dá)產(chǎn)物來標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控，篩選得到轉(zhuǎn)化體。報告基因是研究基因調(diào)控的有力工具，常用于判斷試驗基因的轉(zhuǎn)化效率以及基因的調(diào)控與功能的研究實驗中。第6頁/共15頁報告基因必須具備的條件(1)已被克隆和全序列已測定;(2)表達(dá)產(chǎn)物在受體細(xì)胞中不存在，即無背景，在被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中無相似的內(nèi)源性表達(dá)產(chǎn)物;(3)報告基因編碼的產(chǎn)物的檢測應(yīng)該快速、簡便、靈敏度高而且重現(xiàn)性好，表達(dá)產(chǎn)物能進(jìn)行定量測定。(4)細(xì)胞內(nèi)其它的基因產(chǎn)物不會干擾報告基因產(chǎn)物的檢測。第7頁/共15頁常見的報告基因：在植物基因工程研究領(lǐng)域，已使用的報告基因有以下幾種：常用的報告基因包括β—葡萄糖苷酸酶報告基因(gus),胭脂堿合成酶基因(nos)、章魚堿合成酶基因(ocs)、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTll)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat)、β-半乳糖苷酶(β-gal，β-galactosidase)、螢光素酶(luc，luciferase)、和綠色熒光蛋白基因(gfp，greenfluorescenceprotein)等.第8頁/共15頁利用報告基因表達(dá)載體的研究技術(shù)的優(yōu)點：其一，避開內(nèi)源和外源基因表達(dá)水平的影響：對于報告基因編碼產(chǎn)物的檢測水平可以精確地反映基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，不會受到內(nèi)源性基因表達(dá)產(chǎn)物水平的影響.第二，易于檢測：如果研究不同基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，采取本身基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測方法，必須建立各種基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測方法，有些基因的表達(dá)產(chǎn)物的檢測技術(shù)還不具備，或者很難建立，而采用報告基因的研究策略就很容易解決這一問題，只要建立穩(wěn)定的報告基因表達(dá)的檢測技術(shù)就可以用于不同基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的檢測和研究。第9頁/共15頁gus基因簡介gus基因是目前常用的一種報告基因，是β－D－葡萄糖苷酸酶(gus)基因，其表達(dá)產(chǎn)物β-葡萄糖苷酸酶(GUS)能催化裂解一系列的β－葡萄糖苷酸

，它可以將5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X－Gluc）分解為藍(lán)色的物質(zhì),也可以將4-甲基-傘形花酮-β-D-葡萄糖苷酯(4-MUG)分解為藍(lán)色物質(zhì)。其檢測方法簡單、快速、靈敏、穩(wěn)定，且背景活性低。gus基因的最大優(yōu)點是它能測定外源基因表達(dá)的具體細(xì)胞和組織部位，這是其它報告基因所不能及的。第10頁/共15頁藥品配方1）X－Gluc母液：X-Gluc，用N-N-二甲基酰胺(DMF)配成20mM的貯存液，分裝成每管100μL，保存于-20℃。2）X－Gluc基液（50mMPBS，pH7.0）。配制方法：50mMNaH2PO4·0.78g/100ml；50mMNa2HPO41.79g/100ml共同溶解；Na2EDTA（10mM，372mg），Triton-100（0.1％，100μl）,K3[Fe(CN)6]（鐵氰化鉀）（0.5mM，16.5mg）K4[Fe(CN)6]（亞鐵氰化鉀）（0.5mM，21.1mg）染色液：50μlX-Gluc母液＋450μl基液第11頁/共15頁染色方法將準(zhǔn)備好的試材浸泡在染液，于25—37℃保溫1小時至過夜。葉片等綠色材料轉(zhuǎn)入70%乙醇中脫色2—3次，至陰性對照材料呈白色。肉眼或顯微鏡下觀察，白色背景上的藍(lán)色小點即為Gus表達(dá)位點。第12頁/共15頁實驗步驟將準(zhǔn)備好的擬南芥植株放入小EP管中，加入染色液浸沒試材，封好蓋子；