高效液相簡(jiǎn)介與常見問題分析

高效液相色譜簡(jiǎn)介特點(diǎn)：高效液相色譜法有“四高一廣”的特點(diǎn)：

1.高壓：流動(dòng)相為液體，流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對(duì)載液加高壓2.高速：分析速度快、載液流速快，較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個(gè)樣品在15～30分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內(nèi)即可完成，一般小于1小時(shí)3.高效：分離效能高?？蛇x擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍4.高靈敏度：紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01ng，進(jìn)樣量在μL數(shù)量級(jí)5.應(yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機(jī)化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢(shì)6.柱子可反復(fù)使用：用一根柱子可分離不同化合物

7.樣品量少、容易回收：樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備第1頁，共31頁。高效液相色譜簡(jiǎn)介

此外高效液相色譜還有色譜柱可反復(fù)使用、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點(diǎn)，但也有缺點(diǎn)，與氣相色譜相比各有所長(zhǎng)，相互補(bǔ)充。高效液相色譜的缺點(diǎn)是有“柱外效應(yīng)”。在從進(jìn)樣到檢測(cè)器之間，除了柱子以外的任何死空間（進(jìn)樣器、柱接頭、連接管和檢測(cè)池等）中，如果流動(dòng)相的流型有變化，被分離物質(zhì)的任何擴(kuò)散和滯留都會(huì)顯著地導(dǎo)致色譜峰的加寬，柱效率降低。高效液相色譜檢測(cè)器的靈敏度不及氣相色譜

第2頁，共31頁。高效液相色譜簡(jiǎn)介HPLC儀器的配置及流程：第3頁，共31頁。高效液相色譜簡(jiǎn)介色譜分離的機(jī)理：第4頁，共31頁。高效液相色譜簡(jiǎn)介色譜的圖形結(jié)果：第5頁，共31頁。高效液相色譜簡(jiǎn)介色譜柱進(jìn)樣閥脫氣裝置流動(dòng)相檢測(cè)器高壓泵構(gòu)造：第6頁，共31頁。高效液相色譜簡(jiǎn)介高效液相色譜構(gòu)造：輸液泵：多用柱塞往復(fù)泵，柱塞向前運(yùn)動(dòng)，液體輸出，流向色譜柱；向后運(yùn)動(dòng)，將貯液瓶中液體吸入缸體。如此往復(fù)運(yùn)動(dòng)，將流動(dòng)相源源不斷地輸送到色譜柱中第7頁，共31頁。高效液相色譜簡(jiǎn)介高效液相色譜構(gòu)造：色譜柱：常用的色譜柱填料有硅膠和化學(xué)鍵合硅膠。后者以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用辛基鍵合硅膠次之，氰基或氨基鍵合硅膠也有使用；離子交換填料用于離子交換色譜；凝膠或玻璃微球等，用于分子排阻色譜等第8頁，共31頁。高效液相色譜簡(jiǎn)介高效液相色譜構(gòu)造：色譜柱：在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖

化學(xué)鍵合固定相應(yīng)用，量出供試品主成分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時(shí)間t(R)和半高峰寬W(h/2)，按n=5.54[t(R)╱W(h/2)]^2計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)，如果測(cè)得理論板數(shù)低于各品種項(xiàng)下規(guī)定的最小理論板數(shù)，應(yīng)改變色譜柱的某些條件（如柱長(zhǎng)、載體性能、色譜柱充填的優(yōu)劣等），使理論板數(shù)達(dá)到要求第9頁，共31頁。高效液相色譜簡(jiǎn)介高效液相色譜構(gòu)造：檢測(cè)器：分為紫外檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器。紫外檢測(cè)器：是基于溶質(zhì)分子吸收紫外光的原理設(shè)計(jì)的檢測(cè)器，其工作原理是Lambert-Beer定律，即當(dāng)一束單色光透過流動(dòng)池時(shí)，若流動(dòng)相不吸收光，則吸收度A與吸光組分的濃度C和流動(dòng)池的光徑長(zhǎng)度L成正比

第10頁，共31頁。高效液相色譜簡(jiǎn)介高效液相色譜構(gòu)造：熒光檢測(cè)器：是高壓液相色譜儀常用的一種檢測(cè)器。用紫外線照射色譜餾分，當(dāng)試樣組分具有熒光性能時(shí)，即可檢出第11頁，共31頁。高效液相色譜簡(jiǎn)介高效液相色譜構(gòu)造：流動(dòng)相：

1.溶劑對(duì)于待測(cè)樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性2.溶劑要與檢測(cè)器匹配。對(duì)于紫外吸收檢測(cè)器，應(yīng)注意選用檢測(cè)器波長(zhǎng)比溶劑的紫外截止波長(zhǎng)要長(zhǎng)3.高純度。由于高效液相靈敏度高，對(duì)流動(dòng)相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會(huì)引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。痕量雜質(zhì)的存在，將使截止波長(zhǎng)值增加50～I(xiàn)OOnm4.化學(xué)穩(wěn)定性好。不能選與樣品發(fā)生反應(yīng)或聚合的溶劑5.低粘度。若使用高粘度溶劑，勢(shì)必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度過于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測(cè)器內(nèi)形成氣泡，影響分離.第12頁，共31頁。高效液相色譜簡(jiǎn)介HPLC的主要類型：液一液分配色譜法（LLPC）：在液-液色譜中,流動(dòng)相和固定相都是液體,它能適用于各種樣品類型的分離和分析，無論是極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子型的化合物分離原理：液液分配色譜的分離原理基本與液液萃取相同，都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。所不同的是液液色譜的分配是在柱中進(jìn)行的，使這種分配平衡可反復(fù)多次進(jìn)行，造成各組分的差速遷移，提高了分離效率，從而能分離各種復(fù)雜組分第13頁，共31頁。高效液相色譜簡(jiǎn)介HPLC的主要類型：液一液分配色譜法（LLPC）：固定相：液液色譜的固定相由載體和固定液組成，通常有以下幾類；1.全多孔型載體：由硅膠、硅藻土等材料制成，直徑約100m的全多孔型顆粒，這類固定相由于顆粒很細(xì)，孔仍然較淺，傳質(zhì)速率快，易實(shí)現(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析2.表面多孔型載體（薄殼型微珠載體）：由直徑為30~40m的實(shí)心玻璃球和厚度約為1~2m的多孔性外層所組成。目前，這種載體粒度為5~10m

流動(dòng)相：根據(jù)所使用的流動(dòng)相和固定相的極性程度，將其分為正相分配色譜和反相分配色譜第14頁，共31頁。高效液相色譜簡(jiǎn)介HPLC的主要類型：液一液分配色譜法（LLPC）：正相液-液分配色譜法(NormalPhaseliquidChromatography):流動(dòng)相的極性小于固定液的極性反相液-液分配色譜法(ReversePhaseliquidChromatography):流動(dòng)相的極性大于固定液的極性

液-液分配色譜法的缺點(diǎn)：盡管流動(dòng)相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動(dòng)相中仍有微量溶解；流動(dòng)相通過色譜柱時(shí)的機(jī)械沖擊力，會(huì)造成固定液流失第15頁，共31頁。高效液相色譜簡(jiǎn)介HPLC的主要類型：液一固吸附色譜法(LSAC)：液一固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的表面存在吸附中心。液固色譜實(shí)質(zhì)是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來進(jìn)行分離的分離原理：當(dāng)流動(dòng)相通過固定相（吸附劑）時(shí)，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動(dòng)相分子。同時(shí)，當(dāng)試樣分子（X）被流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，只要它們?cè)诠潭ㄏ嘤幸欢ǔ潭鹊谋Ａ艟鸵〈鷶?shù)目相當(dāng)?shù)囊驯晃降牧鲃?dòng)相溶劑分用）于是，在固定相表面發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附

X+nSad=Xad+nS第16頁，共31頁。高效液相色譜簡(jiǎn)介HPLC的主要類型：液一固吸附色譜法(LSAC)：固定相：液－固吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強(qiáng)弱不等的吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酸膠等。由于硅膠的優(yōu)點(diǎn)較多，如線性容量較高，機(jī)械性能好，不溶脹，與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)等，因此，以硅膠用得最多目前最廣泛使用的還是5～10m的全多孔型微粒填料流動(dòng)相：一般把吸附色譜中流動(dòng)相稱作洗脫劑。在吸附色譜中對(duì)極性大的試樣往往采用極性強(qiáng)的洗脫劑；對(duì)極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑第17頁，共31頁。高效液相色譜簡(jiǎn)介HPLC的主要類型：離子交換色譜法（IEC）：此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測(cè)定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進(jìn)行分離。它不僅適用無機(jī)離子混合物的分離，亦可用于有機(jī)物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣離子交換原理：離子交換色譜法是利用不同待測(cè)離子對(duì)固定相親和力的差別來實(shí)現(xiàn)分離的。其固定相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團(tuán)和可游離的平衡離子。當(dāng)待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進(jìn)行可逆交換第18頁，共31頁。高效液相色譜簡(jiǎn)介HPLC的主要類型：離子交換色譜法（IEC）：固定相：1.

多孔型離子交換樹脂：它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交聯(lián)聚合物，直徑約為5～20μm，有微孔型和大孔型之分2.薄膜型離子交換樹脂：它是在直徑約對(duì)30μm的固體惰性核上，凝聚1～2μm厚的樹脂層3.表面多孔型離子交換樹脂：它是在固體情性核上，覆蓋一層微球硅膠，再在上面涂一層很薄的離子交換樹脂流動(dòng)相：離子交換色譜法所用流動(dòng)相大都是一定pH和鹽濃度（或離子強(qiáng)度）的緩沖溶液。通過改變流動(dòng)相中鹽離子的種類、濃度和pH值可控制k值，改變選擇性。有時(shí)也使用有機(jī)溶劑如甲醇或乙醇同水緩沖溶液混合使用，以提高特殊的選擇性，并改善樣品的溶解度第19頁，共31頁。高效液相色譜簡(jiǎn)介HPLC的主要類型：離子對(duì)色譜法（IPC）：離子對(duì)色譜法是分離分析強(qiáng)極性有機(jī)酸和有機(jī)堿的極好方法。離子對(duì)色譜法是將一種（或數(shù)種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（稱對(duì)離子或反離子）加到流動(dòng)相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成離子對(duì)，從而控制溶質(zhì)離子保留行為的一種色譜法分離原理：由于離子對(duì)化合物A-B+具有疏水性，因而被非極性固定相（有機(jī)相）提取。組分離子的性質(zhì)不同，它與反離子形成離子對(duì)的能力大小不同以及形成的離子對(duì)流水性質(zhì)不同，導(dǎo)致各組分離子在固定相中滯留時(shí)間不同，因而出峰先后不同第20頁，共31頁。高效液相色譜簡(jiǎn)介HPLC的主要類型：離子對(duì)色譜法（IPC）：固定相：非極性的疏水鍵合相流動(dòng)相：加有平衡離子（反離子）的極性溶液通過改變流動(dòng)相的pH、平衡離子的濃度和種類可改變分離的選擇性。

第21頁，共31頁。高效液相色譜簡(jiǎn)介HPLC的主要類型：空間排阻色譜法（SEC）：主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機(jī)理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實(shí)現(xiàn)分離的分離原理：空間排阻色譜是按分子大小順序進(jìn)行分離的一種色譜方法。凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴，體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱第22頁，共31頁。高效液相色譜簡(jiǎn)介HPLC的主要類型：空間排阻色譜法（SEC）：固定相：排阻色譜固定相種類很多，一般可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類。1.軟性凝膠如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶脹到它們干體的許多倍。它們適用以水溶性溶劑作流動(dòng)相，一般用于小分子質(zhì)量物質(zhì)的分析，不適宜用在高效液相色譜中2.半剛性凝膠如高交聯(lián)度的聚苯乙烯（Styragel）比軟性凝膠稍耐壓，溶脹性不如軟性凝膠。常以有機(jī)溶劑作流動(dòng)相。用于高效液相色譜時(shí)，流速不宜大3.剛性凝膠如多孔硅膠、多孔玻璃等它們既可用水溶性溶劑，又可用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相，可在較高壓強(qiáng)和較高流速下操作。一般控制壓強(qiáng)小于7MPa，流速＜1cm3·s-1；否則將影響凝膠孔徑，造成不良分離第23頁，共31頁。高效液相色譜簡(jiǎn)介HPLC的主要類型：空間排阻色譜法（SEC）：流動(dòng)相：排阻色譜所選用的流動(dòng)相必須能溶解樣品，并必須與凝膠本身非常相似，這樣才能潤(rùn)濕凝膠。當(dāng)采用軟性凝膠時(shí)，溶劑也必須能溶脹凝膠。溶劑的粘度要小，因?yàn)楦哒扯热軇┩拗品肿訑U(kuò)散作用而影響分離效果。常用的流動(dòng)相有四氫呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等第24頁，共31頁。高效液相色譜簡(jiǎn)介液相色譜分離類型選擇參考表：第25頁，共31頁。高效液相色譜簡(jiǎn)介色譜的定量分析：

色譜定量分析是基于被測(cè)物質(zhì)的量與峰面積成正比。在一定色譜條件下有：第26頁，共31頁。高效液相色譜簡(jiǎn)介常見色譜故障：基線噪音：檢測(cè)池臟檢測(cè)器燈能量下降由泵引起的脈沖檢測(cè)器上的溫度效應(yīng)檢測(cè)池中有氣泡通過第27頁，共31頁。高效液相色譜簡(jiǎn)介常見色譜故障：鬼峰：鬼峰－沒有進(jìn)樣就有色譜峰出現(xiàn)原因－流動(dòng)相臟，尤其是水相雙峰：柱頭塌陷或柱床運(yùn)動(dòng)泵頭過濾芯部分堵塞