原核表達(dá)系統(tǒng)

基因原核表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄載體翻譯載體LIC（連接非依賴的克隆）圖3.5SCMRP基因原核表達(dá)M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1：IPTG誘導(dǎo)BL21(DE3pET-32b)總蛋白；泳道2~4：IPTG誘導(dǎo)BL21(DE3pET-32bS)總蛋白。Fig.3.5ProkaryoticexpressionofgeneSCMRPM:ProteinMolecularWeightMarker;lane1:thewholecellproteinofBL21(DE3pET-32b)inducedbyIPTG;lane2~4:thewholecellproteinofBL21(DE3pET-32bS)inducedbyIPTG.圖3.7SCMRP基因原核表達(dá)產(chǎn)物溶解形式分析M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1、2：BL21(DE3pET-32bS)表達(dá)蛋白質(zhì)的可溶組分；泳道3：BL21(DE3pET-32b)表達(dá)蛋白質(zhì)的可溶組分；泳道5、6、7：BL21(DE3pET-32bS)表達(dá)蛋白質(zhì)的不溶組分；泳道8：BL21(DE3pET-32b)表達(dá)蛋白質(zhì)的不溶組分。Fig.3.7ThedissolvabilityanalysisofprokaryoticexpressionproductofthegeneSCMRPM:proteinmarker;lane1-2:dissolvablegroupoffusionproteinbyBL21(DE3pET-32bS);lane3:dissolvablegroupoffusionproteinbyBL21(DE3pET-32b);lane5-7:insolvablegroupoffusionproteinbyBL21(DE3pET-32bS);lane8:insolvablegroupoffusionproteinbyBL21(DE3pET-32b).圖3.8SCMRP原核表達(dá)產(chǎn)物Westernblot分析M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1：Ni-NTA純化SCMRP；泳道2：IPTG誘導(dǎo)BL21(DE3pET-32b)總蛋白；泳道3：IPTG誘導(dǎo)BL21(DE3pET-32bS)總蛋白；泳道4：無IPTG誘導(dǎo)BL21(DE3pET-32bS)總蛋白。Fig.3.8WesternblotanalysisofprokaryoticexpressionproductofSCMRPM:proteinmarker;lane1:purificationproteinthroughNi-NTA;lane2:thewholecellproteinexpressedbyBL21(DE3pET-32b)inducedbyIPTG;lane3:thewholecellproteinexpressedbyBL21(DE3pET-32bS)inducedbyIPTG;lane4:thewholecellproteinexpressedbyBL21(DE3pET-32bS)withoutIPTGinduction.蛋白質(zhì)溶解方式調(diào)節(jié)與溶解性高的蛋白質(zhì)序列融合如GST、Trx（硫氧還蛋白）、NusA與催化二硫鍵形成的酶融合如Trx、DsbA、DsbC與信號肽融合DsbA、DsbC低溫培養(yǎng)、誘導(dǎo)原核表達(dá)宿主菌的選擇BL21（DE3）：為λDE3溶原菌，其染色體上帶有一拷貝由lacUV5啟動子控制的T7RNA聚合酶基因。命名為pLysS和pLysE的宿主菌帶有編碼T7溶菌酶（為T7RNA聚合酶的天然抑制物）的pET相容性質(zhì)粒。帶有pLysS的細(xì)胞產(chǎn)生少量溶菌酶，而pLysE宿主菌產(chǎn)生更大量酶。這些菌株用于在誘導(dǎo)前抑制T7RNA聚合酶的基礎(chǔ)表達(dá)，這樣可以穩(wěn)定編碼影響細(xì)胞生長和活力的目標(biāo)蛋白的pET重組體。

Rosetta（DE3）：Rosetta宿主菌從BL21衍生而來，可增強(qiáng)帶有大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白的表達(dá)。該菌株通過一個(gè)相容性氯霉素抗性質(zhì)粒補(bǔ)充密