細(xì)胞生物學(xué)講課課件

7.5程序性細(xì)胞死亡

講授內(nèi)容

一、概述二、細(xì)胞凋亡的生物學(xué)特征三、細(xì)胞凋亡過程與調(diào)控四、細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制五、細(xì)胞凋亡與疾病學(xué)習(xí)要求掌握細(xì)胞凋亡的概念、生物學(xué)意義。掌握細(xì)胞凋亡的過程及細(xì)胞凋亡與壞死的差別。熟悉細(xì)胞凋亡的主要變化。熟悉細(xì)胞凋亡的調(diào)控。熟悉細(xì)胞凋亡與常見疾病的關(guān)系。了解細(xì)胞凋亡在疾病防治中的意義。細(xì)胞凋亡:細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下,遵循自身的程序,結(jié)束其生命的生理性死亡，是受基因嚴(yán)格調(diào)控的細(xì)胞自殺現(xiàn)象.凋亡過程中，細(xì)胞骨架蛋白分解—細(xì)胞和細(xì)胞器濃縮而不裂解—染色體DNA斷裂和形成凋亡小體—細(xì)胞內(nèi)含物不外泄，不引起炎癥反應(yīng)。最后凋亡小體被巨噬細(xì)胞識(shí)別和吞噬。細(xì)胞壞死（necrosis）是在各種致病因素（如缺氧、物理、化學(xué)和生物學(xué)因素）的劇烈刺激下的病理性死亡。

其特點(diǎn)是:引起死亡的因素劇烈，死亡迅速。能量代謝下降—膜通透性增加—細(xì)胞水腫—細(xì)胞器破裂，細(xì)胞溶解，DNA不斷裂—內(nèi)含物釋放—引起炎癥反應(yīng)。細(xì)胞凋亡與壞死的比較1衰老的概念（附）衰老(senescing，aging)：是機(jī)體在退化時(shí)期生理功能下降和紊亂的綜合表現(xiàn)，是不可逆的生命過程。人的衰老與細(xì)胞的衰老相關(guān)聯(lián)?，F(xiàn)代人類面臨著3種衰老：生理性衰老；心理性衰老病理性衰老；心理負(fù)擔(dān)和壓力可結(jié)合保健防病加以控制是生命過程的必然Hayflick界限1961年，Hayflick首次報(bào)道了體外培養(yǎng)的人的成纖維細(xì)胞具有增殖分裂的極限。細(xì)胞，至少是培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞，不是不死的，而是有一定的壽命；它們的增殖能力不是無限的，而是有一定的界限，這就是Hayflick界限**。個(gè)體衰老與細(xì)胞衰老老人會(huì)出現(xiàn)

皺紋、老人色斑、白頭發(fā)皮膚干燥、發(fā)皺頭發(fā)變白老人斑飲食減少細(xì)胞水分減少，體積減小細(xì)胞內(nèi)的酶活性降低細(xì)胞內(nèi)色素的累積細(xì)胞膜通透性功能改變早老癥兒童與正常兒童的比較細(xì)胞的凋亡由基因所決定的細(xì)胞自動(dòng)結(jié)束生命的過程，就叫細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡受到嚴(yán)格的由遺傳機(jī)制決定的程序性調(diào)控，所以也常常叫做細(xì)胞編程性死亡2002年，英國科學(xué)家悉尼·布雷諾爾、約翰·蘇爾斯頓和美國科學(xué)家羅伯特·霍維茨。他們?yōu)檠芯科鞴侔l(fā)育和程序性細(xì)胞死亡過程中的基因調(diào)節(jié)作用作出了重大貢獻(xiàn)。SydneyBrenner

H.RobertHorvitzJohnE.Sulston

細(xì)胞凋亡葉子的離開不是風(fēng)的追求也不是樹的不挽留而是命運(yùn)的安排自然的選擇該來的會(huì)來該走的會(huì)走有時(shí)候離開并不意味著結(jié)束而是－另一種開始！發(fā)生在我們身邊的細(xì)胞凋亡二、細(xì)胞凋亡的生物學(xué)特征（一）細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征（二）細(xì)胞凋亡的生化特征（三）細(xì)胞凋亡的生理意義（四）細(xì)胞凋亡的檢測方法（一）細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征細(xì)胞：首先變圓，體積縮小，與鄰近細(xì)胞的連接喪失，失去微絨毛，胞漿濃縮。細(xì)胞核的變化：胞核內(nèi)染色質(zhì)濃縮形成密集顆粒呈帽狀〈或新月形)，位于核被膜下。核被膜下核纖層(nuclearlamina)分解，隨后細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)固縮為不均一點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)。細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜：相鄰細(xì)胞間連接復(fù)合體普遍消失，其他細(xì)胞膜特有結(jié)構(gòu)如微絨毛等亦隨之消失。此時(shí)，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)仍保持完整。空泡化固縮出芽邊集凋亡小體凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征：核酸內(nèi)切酶活化與DNA電泳呈梯子狀改變是Apoptosis的生物化學(xué)標(biāo)志。核酸內(nèi)切酶在核小體連接處將DNA鏈切斷，從而最終產(chǎn)生寡聚核小體。這些寡聚核小體的大小均是DNA長度為180-200個(gè)堿基對(bp)的倍數(shù)，因此用瓊脂糖凝膠電泳測定細(xì)胞DNA時(shí)出現(xiàn)特征性的“梯狀”（ladder）帶紋。（三）細(xì)胞凋亡的生理意義

1維持組織器官細(xì)胞類型和細(xì)胞總量的基本平衡：清除衰老損傷的細(xì)胞：皮膚、粘膜細(xì)胞的更新等。2在胚胎發(fā)育中起重要作用a手指和腳趾的形成等。b

大腦神經(jīng)元之間形成連接時(shí)多余的神經(jīng)細(xì)胞通過凋亡清除掉。c

在淋巴細(xì)胞發(fā)育成熟中起重要作用。d

心臟發(fā)育過程中左右心室、房的形成以及左右心室的厚度，通過細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)。3細(xì)胞凋亡異?？梢鹉[瘤和神經(jīng)退行性病變等疾病。（四）細(xì)胞凋亡的檢測方法◆形態(tài)學(xué)觀測：染色法、透射和掃描電鏡觀察◆DNA電泳：DNA片段就呈現(xiàn)出梯狀條帶◆TUNEL測定法:即DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法◆彗星電泳法（cometassay）◆流式細(xì)胞分析根據(jù)凋亡細(xì)胞DNA斷裂和丟失，采用碘化丙啶使DNA產(chǎn)生激發(fā)熒光，用流式細(xì)胞儀檢出凋亡的亞二倍體細(xì)胞，同時(shí)又能觀察細(xì)胞的周期狀態(tài)。一、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測根據(jù)凋亡細(xì)胞固有的形態(tài)特征，人們已經(jīng)設(shè)計(jì)了許多不同的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測方法。1、光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡（1）未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。（2）染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞DNA電泳圖1．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)0h2．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)1h3．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)2h4．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)3h5．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)4h6．陰性對照7．Marker形成大小為180～200bp整倍性的DNA梯狀條帶；2、DNA電泳4、彗星電泳法5、流式細(xì)胞分析凋亡細(xì)胞形成的DNA降解片段，在電場中泳動(dòng)速度快，使細(xì)胞核產(chǎn)生彗星式的圖案；根據(jù)凋亡細(xì)胞DNA斷裂和丟失，采用碘化丙啶使DNA產(chǎn)生激發(fā)熒光，用流式細(xì)胞儀檢出凋亡的亞二倍體細(xì)胞。3、TUNEL測定法即DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法：凋亡細(xì)胞核中DNA產(chǎn)生3’-OH末端，可用原位缺口翻譯或末端標(biāo)記法顯示凋亡細(xì)胞。三、細(xì)胞凋亡過程與調(diào)控（一）、細(xì)胞凋亡的過程（四個(gè)階段）1.凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)2.凋亡基因激活3.凋亡的執(zhí)行（由DNase和caspases執(zhí)行）4.凋亡細(xì)胞的清除。凋亡過程Ⅰ受體cAMPCa2+神經(jīng)酰胺凋亡相關(guān)基因激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞膜細(xì)胞核凋亡誘導(dǎo)因素+Dnase激活Caspases激活死亡信號(hào)凋亡過程Ⅱ執(zhí)行凋亡凋亡細(xì)胞的清除Dnase激活Caspases激活凋亡過程小結(jié)+受體cAMPCa2+神經(jīng)酰胺凋亡誘導(dǎo)因素死亡信號(hào)凋亡相關(guān)基因激活Dnase激活Caspases激活巨噬細(xì)胞吞噬分解凋亡細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因激活執(zhí)行凋亡凋亡細(xì)胞的清除凋亡過程及分期

誘導(dǎo)期執(zhí)行期消亡期

凋亡誘導(dǎo)因素受體cAMPCa2+神經(jīng)酰胺死亡信號(hào)凋亡相關(guān)基因激活Dnase激活Capases激活巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞凋亡細(xì)胞（二）、細(xì)胞凋亡的調(diào)控1.細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)因素與抑制因素(1)誘導(dǎo)因素（啟動(dòng)細(xì)胞凋亡）激素和生長因子失衡：二者過多或缺乏均可應(yīng)起細(xì)胞凋亡。例：強(qiáng)烈應(yīng)激反應(yīng)糖皮質(zhì)激素淋巴細(xì)胞凋亡。理化因素：電離輻射、高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、細(xì)胞毒性抗癌藥等。免疫性因素：免疫細(xì)胞在生長、分化及執(zhí)行防御、自穩(wěn)、監(jiān)視功能中,其免疫分子參與免疫細(xì)胞或靶細(xì)胞的凋亡過程。微生物因素：細(xì)菌、病毒及其毒素可誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡。如HIV可至CD4+，T淋巴細(xì)胞凋亡，是愛滋病的發(fā)病機(jī)理。(2)抑制因素（抑制細(xì)胞凋亡）

細(xì)胞生長因子：如IL-2、神經(jīng)生長因子。

激素例：ACTH腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞增生抑制細(xì)胞凋亡

2、細(xì)胞凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)

凋亡誘導(dǎo)因素作用于細(xì)胞轉(zhuǎn)化為凋亡信號(hào)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活細(xì)胞死亡程序細(xì)胞凋亡（DNA片段化及蛋白解體）。

死亡受體通路：線粒體通路：誘導(dǎo)信號(hào)+配體誘導(dǎo)信號(hào)+配體+銜接蛋白誘導(dǎo)信號(hào)+配體（如Fas）+銜接蛋白+Procaspase-8（死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物）Procaspase-8激活為Caspase-8缺氧、缺血、酸中毒等原因線粒體膜通透性下降凋亡啟動(dòng)因子釋放（cyt-c、Apaf-1等）cyt-c+Apaf-1+Procaspase-9Procaspase-9激活為Caspase-93.細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因（1）抑制凋亡基因：Bcl-2（B細(xì)胞淋巴瘤\白血病-2基因）。Bcl-2(B-celllymphoma/leukemia-2)基因：分布：造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、多種瘤細(xì)胞。功能：抑制多種凋亡誘導(dǎo)因素（如電離輻射、化學(xué)藥物）所引起的細(xì)胞凋亡（細(xì)胞增殖）。機(jī)制：*直接抗氧化而抑制細(xì)胞調(diào)亡；*抑制線粒體釋放促凋亡的蛋白質(zhì)；*抑制凋亡蛋白酶的激活；*維持細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)。（2）促進(jìn)凋亡基因：野生型p53基因——編碼p53蛋白，故名。功能：促使惡性腫瘤細(xì)胞、衰老細(xì)胞或損傷較重的細(xì)胞凋亡，修復(fù)受損的細(xì)胞（分子警察）。

機(jī)制：射線、毒素DNA損傷+P53蛋白啟動(dòng)DNA修復(fù)機(jī)制DNA修復(fù)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡機(jī)制細(xì)胞凋亡P53基因突變后反而抑制細(xì)胞凋亡,值得注意。

（3）雙向調(diào)控基因：C.myc雙向調(diào)節(jié)：誘導(dǎo)細(xì)胞增殖（有生長因子）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（無生長因子）

四、細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)制（一）氧化損傷（二）鈣穩(wěn)態(tài)失衡(三)線粒體損傷（四）細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制氧化應(yīng)激與自由基的損傷作用1.氧自由基攻擊細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化直接造成細(xì)胞膜損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。2.氧化應(yīng)激可激活Ca2+/Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶及活化核轉(zhuǎn)錄因子如NF-kB，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。3.氧化應(yīng)激引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞，使Ca2+內(nèi)流增加誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。4.激活P53基因，細(xì)胞調(diào)亡。

（一）氧化損傷（二）鈣穩(wěn)態(tài)失衡

1.激活Ca2+/Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶，降解DNA鏈；2.激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，使細(xì)胞骨架蛋白分子間發(fā)生廣泛交聯(lián)，有利于凋亡小體形成。3.激活核轉(zhuǎn)錄因子，加速細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄；4.Ca2+在ATP的配合下使DNA鏈?zhǔn)嬲梗┞冻龊诵◇w之間的連接區(qū)內(nèi)的酶切位點(diǎn)，有利DNA內(nèi)切酶切割DNA。（三）線粒體損傷

1.線粒體損失，導(dǎo)致ATP不足，線線體膜通透感性增高Ca2+濃度升高,均可啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。2.膜電位下降，線粒體膜轉(zhuǎn)換孔開放，通透性增加，細(xì)胞凋亡因子被激活，使細(xì)胞色素C，凋亡蛋白酶激活因子，凋亡誘導(dǎo)因子釋放到細(xì)胞漿。1）細(xì)胞色素C+凋亡蛋白酶激活因子，激活Caspase-9,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。2)凋亡誘導(dǎo)因子激活核酸內(nèi)切酶，增強(qiáng)Caspase-3活性導(dǎo)致蛋白水解。

（四）細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制

●線蟲(C.elegans)

●Caspase家族與凋亡●Bcl-2家族與細(xì)胞凋亡●細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理

細(xì)胞凋亡受基因控制。線蟲是研究細(xì)胞凋亡分子基礎(chǔ)的理想材料。

每條線蟲具有1090個(gè)細(xì)胞，其中在正常情況下有131個(gè)細(xì)胞在發(fā)育過程中以凋亡的方式死亡。從線蟲中找到若干控制細(xì)胞凋亡的基因。1線蟲(C.elegans)找到一系列與細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因

ced-3、ced-4誘發(fā)、啟動(dòng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡ced-9

基因阻止ced3/ced4的激活，抑制凋亡①

ced-3、ced-4基因突變或缺失，使凋亡受阻②移入ced-9使凋亡受阻③失去ced-9使細(xì)胞凋亡

2Caspase家族與凋亡

◆Caspase家族◆Caspase激活◆Caspase水解的靶蛋白

Ced3的哺乳類同源基因是ICE(Interleukin-1-convertingenzyme)，即Caspase-1。

Ced4的哺乳類同源基因是Apaf-1(細(xì)胞凋亡蛋白活化因子）。Ced9的哺乳類同源基因是BCL-2。Caspase家族是一組與眾不同的蛋白水解酶，在凋亡早期階段被激活，并負(fù)責(zé)引發(fā)隨后的凋亡變化，通過切割一組高度選擇性的必須蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn)這一功能。

Caspase活性位點(diǎn)是半胱氨酸(Cysteine)裂解靶蛋白位點(diǎn)是天冬氨酸殘基后的肽鍵因此稱為Cysteineasparticacicspecificprotease，即CaspaseCaspase激活

細(xì)胞中合成的Caspase自身以無活性的酶原狀態(tài)（Procaspase）存在，經(jīng)激活后方能執(zhí)行其功能。其激活依賴于其他的Caspase在它的天冬氨酸位點(diǎn)水解活化或自身活化胞外信號(hào)分子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑

◆上游啟始者Caspases切割、活化下游執(zhí)行者Caspases

當(dāng)細(xì)胞接受凋亡信號(hào)分子(Fas,TNF等)后，凋亡細(xì)胞表面信號(hào)分子受體相互聚集并與細(xì)胞內(nèi)的銜接蛋白(Adaptorprotein)結(jié)合，這些銜接蛋白又募集Procaspases聚集在受體部位，Procaspase相互活化并產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞凋亡

◆下游執(zhí)行者Caspases活化后，水解蛋白底物，啟動(dòng)凋亡

裂解核纖層蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞核形成凋亡小體；裂解DNase結(jié)合蛋白，使DNase釋放，降解DNA形成DNALadder;裂解參與細(xì)胞連接或附著的骨架和其他蛋白，使凋亡細(xì)胞皺縮、脫落，便于細(xì)胞吞噬；導(dǎo)致膜脂PS重排，便于吞噬細(xì)胞識(shí)別并吞噬。3Bcl-2家族與細(xì)胞凋亡◆Bcl-2是一種原癌基因，是ced-9在哺乳類中的同源物，能抑制細(xì)胞凋亡；與線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相結(jié)合；Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的結(jié)構(gòu)域；Bcl-2家族成員的基因中，常常含有三個(gè)保守的Bcl-2同源區(qū)，即BH1，BH2和BH3◆Bcl-2蛋白質(zhì)家族成員以不同的方式調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡

促進(jìn)凋亡:Bad、Bid、Bax阻止凋亡：Bel-X、Bel-w、Bel-2◆哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的Apaf2即是CytC正常機(jī)體細(xì)胞生長與死亡的平衡生長壞死、凋亡正常機(jī)體五、細(xì)胞凋亡與疾病

細(xì)胞凋亡與疾病的關(guān)系——該“死”的細(xì)胞不死，不該“死”的細(xì)胞卻死了，也就是說無論凋亡過度或凋亡不足都可以導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

細(xì)胞凋亡不足：腫瘤，自身免疫病，

細(xì)胞凋亡過度：心肌缺血，心力衰竭，神經(jīng)元退行性疾病，病毒感染不足與過度并存：動(dòng)脈粥樣硬化細(xì)胞凋亡與疾病凋亡相對不足腫瘤、自身免疫性疾病、病毒感染等（一）細(xì)胞凋亡不足1.腫瘤細(xì)胞增殖過度、細(xì)胞凋亡不足。實(shí)驗(yàn)研究：

P53基因（促凋亡基因）缺失或突變Bcl-2基因（抑制凋亡基因）表達(dá)過度臨床應(yīng)用：放療、化療誘導(dǎo)瘤細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡不足腫瘤2.自身免疫病機(jī)體對自身抗原發(fā)生免疫應(yīng)答——自身組織損傷。針對自身抗原免疫細(xì)胞凋亡不足——自身免疫病。例：1型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、慢性甲狀腺炎。臨床應(yīng)用：糖皮質(zhì)激素——誘導(dǎo)自身免疫性淋巴細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡過度神經(jīng)退行性疾病、造血衰竭性疾病、心肌缺血/再灌注損傷（二）細(xì)胞凋亡過度1.心血管疾?。?）急性心肌梗死，壞死與凋亡同時(shí)存在（2）心力衰竭與心肌細(xì)胞功能異常及凋亡有關(guān)實(shí)驗(yàn)研究：心肌細(xì)胞肥大壓力負(fù)荷